Method Article

Intraperitoneale Glucose-Toleranz-Test, Messung der Lungenfunktion und Fixierung der Lunge, um die Auswirkungen von Übergewicht und beeinträchtigter Stoffwechsel auf pulmonale Ergebnisse studieren

DOI:

10.3791/56685

⸱

March 15th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Experimental Pediatrics, Experimental Pulmonology, Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, University of Cologne, 2Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, University of Cologne, 3Division of Experimental Pediatrics and Metabolism, University Children's Hospital, Heinrich Heine University Düsseldorf

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Inzidenz der Adipositas steigt und erhöht das Risiko von chronischen Lungenerkrankungen. Die zugrunde liegenden Mechanismen und Präventionsstrategien, wohldefinierte Tier sind Modelle erforderlich. Hier bieten wir drei Methoden (Glukose-Toleranz-Test, Body-Plethysmographie und Lunge Fixierung), um die Wirkung der Fettleibigkeit auf die pulmonale Ergebnisse bei Mäusen untersuchen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adipositas und Erkrankungen der Atemwege sind große gesundheitliche Probleme. Adipositas ist mit einer erwarteten Zahl von mehr als 1 Milliarde übergewichtige Personen weltweit bis 2030, stellvertretend für eine zunehmende sozioökonomische Belastung einer aufstrebenden Epidemie. Gleichzeitig sind Adipositas verbundenen Komorbiditäten, einschließlich Diabetes sowie Herz- und chronische Lungenerkrankungen, kontinuierlich auf dem Vormarsch. Übergewicht mit einem erhöhten Risiko für Asthma-Exazerbationen in Verbindung gebracht hat, zwar Verschlechterung der respiratorischen Symptomen und mangelhafte Kontrollen, die funktionale Rolle der Fettleibigkeit und gestörten Stoffwechsel in der Pathogenese der chronischen Lungenerkrankungen oft unterschätzt, und zugrunde liegenden molekulare Mechanismen bleiben schwer. Dieser Artikel zielt darauf ab, Methoden zur Beurteilung der Wirkung von Fettleibigkeit auf Stoffwechsel, sowie Lunge Struktur und Funktion zu präsentieren. Hier beschreiben wir drei Techniken für Mäuse-Studien: (1) Beurteilung der intraperitonealen Glukosetoleranz (IpGTT) analysieren die Auswirkungen der Fettleibigkeit auf Glukose-Stoffwechsel; (2) Messung des Atemwegswiderstandes (Res) und Atemwege Compliance (Cdyn) zu analysieren, die Wirkung der Fettleibigkeit auf die Lungenfunktion; und (3) Vorbereitung und Fixierung der Lunge für anschließende quantitative histologische Bewertung. Adipositas Lungenerkrankungen sind wahrscheinlich multifaktoriell, aus systemische entzündliche und metabolische Dysregulation, die Lungenfunktion und das Ansprechen auf die Therapie möglicherweise negativ beeinflussen. Daher unbedingt eine standardisierte Methode zur molekularen Mechanismen und die Wirkung von neuartigen Behandlungen zu studieren.

Introduction

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Laut der Weltgesundheitsorganisation (WHO) im Jahr 2008, waren mehr als 1,4 Milliarden Erwachsene, im Alter von 20 und älter, Übergewicht mit einem Body mass Index (BMI) größer als oder gleich 25; Weitere, mehr als 200 Millionen Männer und fast 300 Millionen Frauen waren übergewichtig (BMI≥30)1. Adipositas und metabolisches Syndrom sind Hauptrisikofaktoren für eine Vielzahl von Krankheiten. Bei der Adipositas und damit einhergehenden erhöhten weißen Fettgewebe Masse eng verknüpft wurde um 2 Diabetes2,3, Herz-Kreislauf Erkrankungen, wie koronare Herzkrankheit (KHK), Herzinsuffizienz (HF), Vorhofflimmern4 geben und Arthrose5, ihre funktionelle Rolle in der Pathogenese der Erkrankungen der Atemwege bleiben schlecht verstanden. Epidemiologische Studien haben jedoch gezeigt, dass Übergewicht stark verbunden mit chronischen Atemwegserkrankungen ist, einschließlich exertional Dyspnoe, obstruktive Schlafapnoe-Syndrom (OSAS), Adipositas Hypoventilation Syndrom (OHS), chronische obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Lungenembolie, Aspirationspneumonie und Asthma bronchiale6,7,8,9. Mögliche Mechanismen Verknüpfung von Fettleibigkeit und gestörten Stoffwechsel, z.B., Insulinresistenz und Typ-II-Diabetes, zur Pathogenese der chronischen Lungenerkrankungen umfassen nicht nur mechanische und physikalische Konsequenzen des Gewichts zu gewinnen sondern auch über be-und Entlüftung induzieren Sie eine chronische subakute entzündliche Zustand10,11. Der Anstieg von Adipositas und Lungenerkrankungen während des letzten Jahrzehnts, gekoppelt mit dem Mangel an wirksame Präventionsstrategien und Therapieansätze, betont die Notwendigkeit, untersuchen die molekularen Mechanismen zu definieren, neue Wege zur Verwaltung von Adipositas Lunge Krankheiten.

Hier beschreiben wir drei standard-Tests, die wichtige Grundlagen, Adipositas und ihre Auswirkungen auf Lunge Struktur und Funktion in Mausmodellen zu untersuchen sind: (1) intraperitoneal Glukose Toleranz (IpGTT) (2) Messung des Atemwegswiderstandes (Res) und der Atemwege System-Compliance (Cdyn); und (3) Vorbereitung und Fixierung der Lunge für anschließende quantitative histologische Bewertung. Die IpGTT ist eine robuste Screening-Test Maßnahme Glukoseaufnahme, und damit die Wirkung von Adipositas auf den Stoffwechsel. Die Einfachheit der Methode ermöglicht gute Standardisierung und damit die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen den Labors. Ausgefeiltere Methoden, z. B. hyperglykämischen Klemmen oder Studien auf isolierte Inseln können für eine detaillierte Analyse der metabolischen Phänotyp12verwendet werden. Hier bewerten wir Glukosetoleranz um eine Adipositas-assoziierten Staat der systemischen und metabolische Störung als Grundlage für weitere Studien auf eine pulmonale Ergebnis zu definieren. Um die Auswirkungen von Übergewicht und Stoffwechselstörungen auf die Lungenfunktion zu beurteilen, haben wir Atemwegswiderstand (Res) und Atemwege Compliance (Cdyn) gemessen. Zur Charakterisierung von Lungenerkrankungen stehen hemmungslose sowie zurückhaltende Methoden zur Bewertung der Lungenfunktion. Hemmungslose Plethysmographie im frei beweglichen Tieren ahmt einen natürlichen Zustand, Atemmuster widerspiegelt; im Gegensatz dazu sind invasive Methoden, wie Eingangs-Impedanz-Messung von Res und cDyn in tief narkotisierten Mäuse dynamische Lungenmechanik bewerten genauer13. Da chronische Atemwegserkrankungen durch histologischen Veränderungen des Lungengewebes übernommen werden, droht richtige Lunge Fixierung zur weiteren Analyse. Die Wahl der Methode der Gewebe Fixierung und Vorbereitung hängt das Fach der Lunge die, beispielsweise untersucht werden Durchführung der Atemwege oder Lunge Parenchym14. Hier beschreiben wir eine Methode, die qualitative und quantitative Bewertung der Durchführung von Fluglinien, die Auswirkungen der Fettleibigkeit auf Asthma Entwicklung zu studieren zu können.

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Protocol

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Alle tierische Verfahren wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Protokollen, die von lokalen Behörden genehmigt (Land NRW, AZ: 2012.A424), und wurden im Einklang mit dem deutschen Tierschutzgesetz und die Vorschriften über das Wohlergehen der Tiere für Experimente oder für andere wissenschaftliche Zwecke. Da Lunge Funktionsanalyse Lunge Struktur beeinflussen kann und deshalb nachfolgende histologische analysiert, sollte die Messung der Res Cdyn und die Vorbereitung und Fixierung der Lunge für Histomorphometrie bei verschiedenen Tieren durchgeführt werden. Messung von Res und Cdyn nach IpGTT ist jedoch möglich. Da Stress während der IpGTT stören könnten die Narkose benötigt für die Lungenfunktion tests, eine Erholungszeit von ca. 2 Wochen nach IpGTT empfiehlt sich die Mäuse von Körper-Gewicht-Verlust erholen können und Veränderungen in Blut Parameter12.

1. Vorbereitung für intraperitoneale Glucose-Toleranz-Test (IpGTT)

Hinweis: Nach 12 h Fasten, die komplette IpGTT dauert ca. 2 h.

  1. Da Stress Blutzucker maßgeblich beeinflusst, sicherzustellen Sie, dass beide Adaption von Mäusen sowie Ausbildung des Wissenschaftlers, durchgeführt.
  2. Übertragen Sie die Tiere auf der Versuchsfläche unter ruhigen und stressfreien Bedingungen.
  3. Halten Sie die Anwendung eine Hypercaloric Ernährung, Adipositas bei Mäusen zu induzieren. Siehe Abschnitt "Diskussion" für weitere Hinweise.
  4. Schnelle Tiere für 12 h in der Nacht, ohne Begrenzung des Zugangs zu Wasser. Am nächste Tag, ist nach 12 h Fasten, bereiten das Blutzuckermessgerät nach Angaben des Herstellers durch das Einfügen eines neuen Teststreifens in Streifen Testport Protokoll (siehe Tabelle der Materialien).
  5. Einschneiden der Schwanzspitze mit sterilen Schere sanft Beibehaltung der Maus am Heck, und sofort den nüchtern Blutzucker messen, indem ein rieselfähiges Blutstropfen (minimale Stichprobe Größe 0,5 µL) auf den Teststreifen für das Blutzuckermessgerät.
    Hinweis: Ein Countdown-Timer startet auf dem Bildschirm nach ausreichender Anwendung der Blutprobe. Nach 4 s, das Testergebnis erscheint auf dem Bildschirm.
  6. Danach wiegen Sie und beschriften Sie die Tiere einzeln mit Farbmarkierung.
  7. Verabreichen Sie 2 g Glukose/kg Körper Gewicht über intraperitoneale Injektion. Stellen Sie sicher, dass das Injektionsvolumen 0,1 mL/10 g Körpergewicht (27 G Nadel und 1 cc Spritze) ist.
  8. Anschließend Messen des Blutzuckers nach 15, 30, 60 und 120 min. durch die Anwendung frei fließende Blutstropfen auf einem neuen Teststreifen.
    Hinweis: Blutfluss kann erhöht werden, durch die sanfte Massage der Schweif Tipp-Stationen. Wenn die Rute Wunde überkrustet, reinigen Sie es mit einem sterilen Tupfer mit 0,9 % Natriumchlorid-Lösung getränkt.
  9. Lassen Sie die Tiere in ihrer Heimat Käfigen mit unbegrenztem Zugang zu Wasser zwischen den Messungen zu ruhen.

2. Lunge Funktionsanalyse Maßnahme Res und cDyn

Hinweis: Für ungestörte Messung von Res und cDyn Mäuse müssen Tiefe Narkose beatmet werden. Stressfreies Tier Behandlung und ordnungsgemäße Überwachung der Anästhesie sind unerlässlich. Lesen Sie für allgemeine Anweisungen sterile Techniken verwenden bitte den Artikel von Hoogstraten-Miller Et al. 15

  1. Kalibrieren der Plethysmogramm vor jeder Reihe von Experimenten und bereiten die Studie-Einstellungen in der Software (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Vor der Operation, tief betäuben Tiere über intraperitoneale Injektion von Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) und Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) (27 G Nadel- und 1 cc). Stellen Sie sicher, dass das Injektionsvolumen 0,1 mL/10 g pro Körpergewicht ist.
    Hinweis: Da Ketamin eine ordnungsgemäße analgetische Wirkung bei Mäusen hat, ist keine zusätzliche Schmerzbehandlung notwendig. Der invasive trachealen Katheter/Plethysmogramm Eingriff dauert ca. 5-7 Minuten, dann Datenerfassung kann beginnen.
  3. Platzieren Sie den Mauszeiger in die Rückenlage auf ein Heizkissen, die Körpertemperatur zu halten.
  4. Decken Sie die Augen mit Salbe, Trockenheit in Narkose zu verhindern.
  5. Die Tiefe der Narkose mit der Zehe Pinch-Reaktion ständig zu überwachen.
    Hinweis: Zusätzliche Gabe von Betäubung kann weiterhin eine chirurgische Ebene der Narkose erforderlich sein.
  6. Befeuchten Sie das Fell von der OP-Bereich in der Schilddrüse-Region mit 70 % Ethanol.
  7. Sorgfältig Einschneiden der Haut in der Mittellinie für ca. 1 cm zwischen der Vena Kerbe des Brustbeins und der Knolle Symphyses von der zögerlich durch mit der Pinzette anheben und die Haut unter Sichtkontrolle mit stumpfen Schere (Abbildung 1A) zuschneiden.
  8. Visualisieren Sie die zugrunde liegenden subkutanem Fettgewebe und Schilddrüse.
  9. Setzen Sie die Luftröhre durch sorgfältig stumpfen trennt beide Schilddrüsen-Lappen an der Landenge und Präparation des Sternothyroid und der Sternothyroid Muskeln (Abbildung 1 b). Achten Sie darauf, keine Schiffe zu Schaden und Blutungen, da dies negative Auswirkungen auf das Herz-Kreislauf-System führen kann und letztendlich auf die Messungen.
  10. Anschließend passieren Sie eine 4-0 geflochtenen chirurgischen Naht zwischen der Luftröhre und Speiseröhre mit stumpfen Pinzette. Sorgfältig die Luftröhre in der Nähe des Kehlkopfes zwischen die trachealen Knorpel mit Mikro Schere einzuschneiden.
  11. Intubation mit einer Trachealkanüle Röhre (0,04 Zoll/1,02 mm Durchmesser) unter Sichtkontrolle (Abbildung 1). Beheben der Röhre über Ligatur mit chirurgischen Nahtmaterials jedes Leck im System zu vermeiden.
  12. Als nächstes bewegen Sie das Tier zum beheizten Bett der Körper Kammer und schließen Sie die Trachealkanüle Schlauch an der Frontplatte (Abbildung 1) und schalten Sie die Lüftung mit der Belüftung-Taste an der Vorderseite des Controllers (Abbildung 1E).
  13. Überblick über die Belüftung durch die Beobachtung der Thorax-Bewegung zeitgleich mit der Belüftung. Um die richtige Platzierung der trachealen Röhre zu bestätigen, sicherzustellen Sie, dass beide Seiten des Thorax gleichzeitig bewegen.
  14. Sehen Sie sich den Druck auf dem Computerbildschirm (Abb. 1F) Signal. Sicherstellen Sie, dass die Lüftung Kurven einheitlich sind. Wenn dies nicht der Fall ist, das Tier zu trennen und die Chirurgie-Seite zu überprüfen. Hüten Sie sich vor Blut oder Schleim blockiert die trachealen Röhre.
    Hinweis: Für Erwachsenen Tieren mit einem Körpergewicht von 20-25 g, werden die Ventilatoreinstellungen wie in Abbildung 2 gezeigt im Einklang mit den Empfehlungen des Herstellers empfohlen.
  15. Um Änderungen in der Trans-pulmonale Druck während der Beatmung zu steuern, Einfügen einer Speiseröhrenkrebs Rohres (0,04 Zoll/1,02 mm Durchmesser) in die Speiseröhre in die Tiefe, die die Ebenen der Lunge nähert. Beobachten Sie den Bildschirm während des Einsetzens der Röhre. Legen Sie das Rohr wo maximale Druck Durchbiegung und minimale Herz Artefakte auf dem Bildschirm ersichtlich.
  16. Bereiten Sie nach der Operation das Tier zur Messung. Wiedereinleitung Anästhesie über intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) mit einer 27-G-Nadel und 1 cc Spritze. Stellen Sie sicher, dass das Injektionsvolumen 0,1 mL/10 g pro Körpergewicht ist.
    Hinweis: Um bronchiale Hyperreagibility zu beurteilen, zerstäuben Sie Methacholine, einen nicht-selektive Muskarin-Rezeptor-Agonisten des parasympathischen Nervensystems, die Bronchokonstriktion induziert. Die Datenerfassung erfolgt in vier verschiedenen Phasen (Abbildung 3).
  17. Datenerfassung nach dem letztgültigen Protokoll zu starten.
    Hinweis: Die Software führt automatisch durch den Akquisitionsprozess.
  18. Übernehmen Sie 10 µL PBS (Fahrzeug) auf den Zerstäuber, und starten Sie Vernebelung nach 5 min der Akklimatisierung. Befolgen Sie eine Antwort-Phase von 3 min, wo Res (CmH2O/mL/s) und cDyn (mL/CmH2O) gemessen. Am Ende bieten Sie eine Erholungsphase von 3 min um dem Tier vor der nächsten Vernebelung.
  19. Folgen Sie der Software durch schrittweise Anwendung von 10 µL des steigenden Konzentrationen von Methacholine (2,5 µg/10 µL, 6,25 µg/10 µL und 12,5 µg/10 µL) auf den Ventilator.
  20. Sobald alle Messungen durchgeführt und aufgezeichnet haben, das Tier durch zervikale Dislokation zu opfern.

(3) Lunge für Quantitative Analyse der Histomorphometric von Erwachsenen Mäusen isoliert

  1. Tief betäuben die Tiere über intraperitoneale Injektion von Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) und Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) (27 G Nadel- und 1 cc). Das Injektionsvolumen sollte 0,1 mL/10 g pro Körpergewicht.
    Hinweis: Nach dem Zustand der chirurgischen Toleranz zu erreichen, die Vorbereitung dauert ca. 5 min, gefolgt von Organ Perfusion und 30 min zur Fixierung.
  2. Sobald das Tier den Stand der chirurgischen Toleranz (negative Zehe Pinch-Response) erreicht hat, desinfizieren Sie das Tier mit 70 % Ethanol zu und fixieren Sie das Tier auf ein Pad mit chirurgischen Klebeband.
  3. Opfern Sie das Tier durch Herzpunktion und Blutungen. Kurz, öffnen Sie den Bauch mit einer medialen Einschnitt durch die Haut und das Bauchfell mit stumpfen Schere.
  4. Suchen Sie die Membran Kopf Stationen der Leber, und trennen Sie vorsichtig die Leber von der Membran.
  5. Machen Sie einen kleinen Schnitt in die Membran mit einer stumpfen Schere und punctata der linke Ventrikel des Herzens mit einer 20 G Nadel an einer 2-mL-Spritze. Langsam aussaugen des Tieres.
    Hinweis: Langsam und vorsichtig Entbluten ist wichtig, zu verhindern, dass die Ventrikel durch den Unterdruck, Hemmung einen ungestörten Blutfluss reduzieren.
  6. Sezieren der Lungenkrebs durch den Brustkorb sanft durch einen Parasternal Schnitt über die gesamte Länge des Brustkorbes mit gebogenen, stumpfe Schere öffnen.
  7. Danach heben Sie den Brustkorb um den pleural Raum (Abbildung 3) verfügbar zu machen. Entfernen Sie die Thymusdrüse um zu sehen, das Herz und die Lunge.
    Hinweis: Optionale Injektion des rechten Ventrikels, gefolgt von Perfusion der Lunge Gefäßsystem mit eiskaltem PBS und dann mit einem Fixativ Lösung [z.B.4 % (Masse/Volumen) Paraformaldehyd (PFA)] ist möglich. Beachten Sie, dass es ein erhöhtes Risiko besteht, alveoläre Septae Bruch und nachteilig auf die Lunge Struktur mit dieser Methode.
  8. Sezieren die Lunge zuerst sorgfältig entfernen das Herz.
  9. Anschließend passieren Sie eine 4-0 geflochtenen chirurgischen Naht zwischen der Luftröhre und Speiseröhre mit stumpfen Pinzette.
  10. Als nächstes vorsichtig einschneiden die Luftröhre in der Nähe des Kehlkopfes zwischen die trachealen Knorpel, Intubation mit einer intravenösen Kanüle (26 G) und aufblasen die Lunge durch Druck Fixierung mit einem konstanten Druck von 20 cm H2O mit Fixativ Agent [z.B.4 % (Masse /Volume) der PFA].
  11. Zur Fixierung der PFA lassen Sie das Fixiermittel für 30 min bei Raumtemperatur. Danach verbinden Sie die Luftröhre und entfernen Sie die Kanüle zu. Dann, Verbrauchsteuern Sie die Lunge sorgfältig ohne Schädigung des Gewebes, und speichern Sie es über Nacht in Fixativ Agent bei 4 ° C.
    Hinweis: Alternativ nach der ATS/ETS Konsens Papier 2,5 % GA gepuffert OsO4, Uracil-Lösung dient zur Stabilisierung der richtige Gewebe. Weitere Gewebe Vorbereitung finden Sie unter das Konsenspapier durch Hsia Et al. 14

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Results

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Repräsentative Ergebnisse der intraperitonealen Glucose-Toleranz-Test (IpGTT) (Abbildung 4), gebeizt Funktion Test (Abbildung 5) und Vertreter Lungenaufnahmen Hämatoxylin und Eosin veranschaulichen Lunge (Abbildung 6).

Die IpGTT wurde bei fettleibigen Mäusen (blau) nach 7 Wochen von High-Fat-Diät (HFD) durchgeführt. Standard-Diät gefüttert ...

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Discussion

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Dieser Bericht enthält drei Protokolle für drei verschiedene Methoden, um die Auswirkungen der Fettleibigkeit auf Glukose-Stoffwechsel und pulmonale Ergebnisse zu analysieren. Erstens kann die Glukose-Toleranz-Test bietet die Möglichkeit, intrazelluläre Glukoseaufnahme analysieren und Hinweis auf Insulin-Resistenz. Zweitens: Ganzkörper-Plethysmographie ist eine Technik zur Messung der Lungenfunktion und ist dabei hilfreich, um die Wirksamkeit von neuen Behandlungsmethoden zu testen. Drittens ist eine standardisierte Fixi...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Die Experimente wurden durch die Marga und Walter Boll-Stiftung, Kerpen, Deutschland gestützt; Projekt-210-02-16 (MAAA) Projekt 210-03-15 (MAAA) und von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG; AL1632-02; MAAA), Bonn, Deutschland; Zentrum für Molekulare Medizin Köln (CMMC; Universitätsklinikum Köln; Karriere-Förderung-Programm; MAAA), Köln Fortune (medizinische Fakultät, Universität zu Köln; KD).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GlucoMen LXA.Menarini Diagnostik, Firneze, Italien38969Blutzuckermessgerät
GlucoMen LX SensorA.Menarini Diagnostik, Firneze, Italien39765Teststreifen
Glukose 20%B. Braun, Melsung, Deutschland2356746
FinePointe SoftwareDSI, MC s´ Hertogenbosch, Niederlande601-1831-002
FinePointe RC Single Site MaustischDSI, MC s´ Hertogenbosch, Niederlande601-1831-001
FPRC ControllerDSI, MC s´ Hertogenbosch, Niederlande601-1075-001
FPRC AerosolblockDSI, MC s&akut; Hertogenbosch, Niederlande601-1106-001
Aerogen neb head-5.2-4umDSI, MC s´ Hertogenbosch, Niederlande601-2306-001
PinzetteFST, British Columbia, Kanada11065-07
Stumpfe SchereFST, British Columbia, Kanada14105-12
Micro ScissorsFST, British Columbia, Kanada15000-00
Perma-Hand 4-0Ethicon, Puerto Rico, USA736HChirurgisches Nahtmaterial
Roti-Histofix 4%RothP087.14% Paraformaldehyd
KetasetZoetis, Berlin, Deutschland10013389Ketamin
Rompun 2%Bayer, Leverkusen, Deutschland770081Xylazin

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