Methodenartikel

Aufbau einer Hochdurchsatz-Screening-Plattform zu beurteilen, die Heterogenität der HER2-Gene-Verstärkung in Brust-

DOI:

10.3791/56686

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5. Dezember 2017

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1Division of Pathology, Fondazione IRCCS Ca' Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 2School of Medicine, University of Milan, 3School of Biology, University of Pavia, 4Division of Breast Surgery, Fondazione IRCCS Ca' Granda - Ospedale Maggiore Policlinico, 5Division of Medical Oncology, Fondazione IRCCS Ca' Granda - Ospedale Maggiore Policlinico, 6Department of Biomedical, Surgical, and Dental Sciences, University of Milan

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Heterogene Verteilung der HER2-positiven Zellen in einer Teilmenge von Brustkrebs beobachtet werden und erzeugt klinischen Dilemmas. Hier stellen wir eine zuverlässige und kostengünstige Protokoll zu definieren, zu quantifizieren und HER2 Intra-Tumor genetische Heterogenität in einer großen Serie von heterogen verarbeiteten Brustkrebs zu vergleichen.

Zusammenfassung

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Gezielte Therapien gegen die menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) haben die Ergebnisse von Patienten mit HER2-positivem Brustkrebs radikal verändert. Eine Minderheit der Fälle zeigt jedoch eine heterogene Verteilung der HER2-positiven Zellen, die wichtige klinischen Herausforderungen erzeugt. Bisher wurden keine zuverlässige und standardisierte Protokolle für die Charakterisierung und Quantifizierung von HER2 heterogene gen Verstärkung in großen Kohorten vorgeschlagen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Hochdurchsatz-Methodik um den HER2-Status gleichzeitig über verschiedene topographische Bereiche von mehreren Brustkrebs zu beurteilen. Insbesondere zeigen wir die Laborverfahren verstärkte Gewebe Microarrays (TMAs) Einbeziehung eine gezielte Zuordnung der Tumoren zu konstruieren. Alle TMA-Parameter wurden speziell für Silber in Situ -Hybridisierung () von Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Brustgewebe optimiert. Immunhistochemische Analyse der prognostische und prädiktive Biomarker (d. h., ER, PR, Ki67 und HER2) sollte mit Hilfe automatisierte Verfahren durchgeführt werden. Eine maßgeschneiderte Protokoll wurde implementiert, um eine qualitativ hochwertige molekulare Analyse über mehrere Gewebe zu ermöglichen, die unterschiedliche Fixierung, Aufbereitung und Lagerung Verfahren unterzogen. In dieser Studie bieten wir einen Proof-of-Principle, dass bestimmte DNA-Sequenzen lokalisierte gleichzeitig in verschiedene topographische Bereiche von mehreren und heterogen verarbeiteten Mammakarzinome mit einer effizienten und kostengünstigen Methode sein könnte.

Einleitung

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HER2 ist ein Protoonkogenproduktes, das überexprimiert und verstärkt in 15-30 % aller invasiven Brustkrebs Krebs1,2. HER2-Überexpression wird abgeleitet durch das Vorhandensein von > 10 % Zellen mit starken Membran immunhistochemische (IHC) Färbung (3 +), während die gen-Amplifikation beurteilt werden kann, wenn das HER2/Zentromer-Verhältnis ≥2 ist oder die gen-Kopie-Anzahl ≥6 ist, zählen auf mindestens 20 Zellen durch in Situ Hybridisierung (ISH)3.

Intra-Tumor genetische Heterogenität ist weit verbreitet in Brustkrebs, einen möglichen negat....

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Protokoll

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Diese Studie wurde genehmigt durch die institutionelle Review Boards von IRCCS Ca' Granda-Stiftung, Policlinico Krankenhaus, Mailand, Italien.

1. Auswahl der Patienten und Gewebeproben

  1. Abrufen der Archivierung Folien aller Fälle analysiert werden, einschließlich aller verfügbaren Hämatoxylin und Eosin (H & E) und IHC Dias aus der ursprünglichen Diagnose und, falls vorhanden, ein H & E von nicht-neoplastischen Brustgewebe (z.B. chirurgische Marge) abgestimmt .
  2. Durchführen Sie Fallbesprechungen.
    Hinweis: Für diese Aufgabe sollte mindestens zwei Pathologen mit Erfahrung in der Brust Pathologie ....

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Ergebnisse

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Insgesamt 444 invasivem Brustkrebs, Krebserkrankungen in 15 TMAs speziell optimiert für ISH Analysen aufgenommen wurden. Unter den 2.664 Punkten abgetastet 2.651 (99,5 %) waren Vertreter der zuvor ausgewählten Bereiche und daher als für spätere Analysen. Intra-Tumor Heterogenität wurde durch IHC und SIH, mit besonderem Schwerpunkt auf die heterogene Verteilung der HER2-positivem Klone in der topographischen Bereiche der Tumoren bestimmt. Tabelle 3 zeigt die biologischen E.......

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Diskussion

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Hier haben wir die Labor-Strategien Analysen das HER2 -gen und seine entsprechenden Zentromer in hochverzinsliche TMAs der heterogen verarbeiteten Mammakarzinome durchführen detaillierte. Diese Methode ist kostengünstig und kann in den meisten Labors für die Untersuchung von HER2 Gens Verstärkung Heterogenität in großen Kohorten der Brust Krebs abgerufen Form Pathologie Archive durchgeführt werden.

Aufgrund der klinischen Bedeutung des HER2 Tests bei Brustkrebs und die Heraus.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Surgipath ParaplastLeica Biosystems, Wetzlar, Deutschland, EU39601006Gewebeeinbettungsmedium, 56 > C Schmelzpunkt
Eosin Y  1%ige wässrige LösungBioOptica, Mailand, Italien, EU510002Eosin gelblich, wasserlöslich
Carazzi' s HämatoxylinBio Optica, Mailand, Italien, EU506012Alaun-Hämatoxylin gereift mit Kaliumjodat
DiamantqualitätLaboindustria, Arzergrande, Italien, EU3353326x76 mm Objektträger
Leica CV MontierungLeica Biosystems, Wetzlar, Deutschland, EU14046430011Eindeckmedium, ohne Monomere, auf Basis von Polymeren von Butylmethacrylat in Xylol
FLEX IHC ObjektträgerAgilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USAK8020Beschichtete Objektträger zur Adhäsion von FFPE zur Verwendung im IHC
BenchMark ULTRAVentana Medical System, Tucson, AZ, USAN750-BMKU-FSObjektträger-Färbesystem
CONFIRM Anti-Östrogenrezeptor (ER) (SP1) Monoklonaler Kaninchen-PrimärantikörperVentana Medical System, Tucson, AZ, USA790-4324Primärer Antikörper,
gebrauchsfertigCONFIRM Anti-Progesteron-Rezeptor (PR) (1E2) Monoklonaler Kaninchen-PrimärantikörperVentana medizinisches System, Tucson, AZ, USA790-2223Primärer Antikörper, gebrauchsfertig
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Monoklonaler Kaninchen-PrimärantikörperVentana medizinisches System, Tucson, AZ, USA790-4286Primärer Antikörper, gebrauchsfertig
PATHWAY HER2 (4B5) Monoklonaler Kaninchen-PrimärantikörperVentana medizinisches System, Tucson, AZ, USA790-4493Primärantikörper, gebrauchsfertiges
ultraView Universal DAB Detection KitMedizinisches System von Ventana, Tucson, AZ, USA760-500Indirektes, biotinfreies System zum Nachweis von Maus-IgG-, Maus-IgM- und Kaninchen-Primärantikörpern
INFORM HER2 Dual ISH DNA-Sonden-CocktailMedizinisches System von Ventana, Tucson, AZ, USA780-4422INFORM HER2 Dual ISH Assay - Von der FDA zugelassener automatisierter Assay für die zweifarbige In-situ-Hybridisierung zur Bestimmung des HER2-Genstatus bei Brustkrebspatientinnen
ultraView Silver ISH DNP Detection KitVentana medizinisches System, Tucson, AZ, USA800-098
ultraView Red ISH DIG Detection KitVentana medizinisches System, Tucson, AZ, USA800-505
ISH Protease 3Ventana medizinisches System, Tucson, AZ, USA780-4149Wird im ISH-Prozess verwendet, um Proteine zu entfernen, die die Ziel-DNA-Sequenzen von Interesse umgeben
HämatoxylinVentana medizinisches System, Tucson, AZ, USA760-2021Modifiziertes Gill's Hämatoxylin-Gegenfärbereagenz
Hämatoxylin II GegenfärbungVentana medizinisches System, Tucson, AZ, USA790-2208Modifiziertes Meyer's Hämatoxylin-Gegenfärbereagenz
Bläuliches ReagenzVentana medizinisches System, Tucson, AZ, USA760-2037Wässrige Lösung aus gepuffertem Lithiumcarbonat zum Brünen von Hämatoxylin gefärbten Schnitten auf Objektträgern
HybReadyVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-4409Formamid-basierter Puffer für ISH-Assays
EZ Prep (10x)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-102Konzentratlösung zur Paraffinentfernung aus Gewebeproben während IHC- und ISH-Reaktionen und zur Verdünnung im Verhältnis 1:10.
SSC-Puffer (10X)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-110Natriumchlorid-Natriumcitrat-Pufferlösung wird für Stringenzwäschen und zum Spülen von Objektträgern zwischen den Färbeschritten verwendet und bietet eine stabile wässrige Umgebung für die In-situ-Hybridisierungsreaktionen. 1:5 verdünnen.
ULTRA LCSVentana medical system, Tucson, AZ, USA650-210Vorverdünnte (gebrauchsfertige) Deckglaslösung, die als Barriere zwischen den wässrigen Reagenzien und der Luft verwendet wird, um eine Verdunstung bei den IHC- und ISH-Reaktionen zu verhindern
Reaktionspuffer (10x)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-300Pufferlösung auf Tris-Basis (pH 7,6 ± 0,2) zum Spülen von Objektträgern zwischen den Färbeschritten während IHC und ISH. 1:10 verdünnen.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-223Vorbehandlungsschritte bei der Verarbeitung von Gewebeproben während der IHC und ISH. Sofort einsatzbereit.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-224
ultraView Silver Wash IIVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-003Gebrauchsfertige Lösung zum Spülen von Objektträgern zwischen IHC- und ISH-Färbeschritten
Mikrotom LeicaBiosystems, Wetzlar, Deutschland, EURM 2255Automatisierter
Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland, EUST 5020Workstation für automatisiertes Färben und Eindecken
Minicore 1Alphelys, Plaisir, Frankreich, EU00-MICO-1Halbautomatischer Arrayer für den TMA-Bau mit TMA Designer 2 Embedded-Software
Aperio ScanScope CS2Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland, EUK080254Bilderfassungsgerät - digitaler Pathologiescanner
Tissue-Tek III Uni-KassetteSakura Finetek Europe B.V4135Kassette
Tissue-Tek Paraform Standard BasisformSakura Finetek Europe B.V7055Edelstahl-Grundmetallform
Rotationsmikrotom-Multistainer

Referenzen

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  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M.

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Schlagwörter

Brustkrebsheterogenit tSilber In situ HybridisierungKonstruktion von GewebemikroarraysFormalin fixiert und in Paraffin eingebettetimmunhistochemische AnalyseHER2 Chromosomenz hlungtopografische Fl chenkartierungautomatischer Immunf rber

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