Neue therapeutische Strategien in der kardialen regenerativen Medizin erfordern umfangreiche und detaillierte Studien in großen präklinischen Tiermodellen, bevor sie für den Einsatz beim Menschen betrachtet werden können. Hier zeigen wir eine perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektionstechnik bei Kaninchen, die ist wertvoll für Hypothesentests die Wirksamkeit solcher neuartiger Therapien.
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Methodenartikel
Perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektion und Zelle-Lieferung in einem großen präklinischen Modell
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zell-und Gentherapie sind spannende und erfolgversprechende Strategien zur kardialen Regeneration im Rahmen der Herzinsuffizienz mit reduzierte Ejektionsfraktion (HFrEF). Bevor sie können für den Einsatz in Betracht gezogen und in den Menschen umgesetzt werden, müssen umfangreiche präklinische Studien in großen Tiermodellen, die Sicherheit, Wirksamkeit und Schicksal der Injectate (z.B. Stammzellen) einmal in das Myokard geliefert zu bewerten. Kleine Nager-Modelle bieten Vorteile (z. B.Preis-/Leistungsverhältnis, Hilfsbereitschaft für Genmanipulation); Allerdings übersetzen inhärente Einschränkungen dieser Modelle gegeben, die Ergebnisse in diesen selten in der Klinik. Umgekehrt haben große Tiermodellen wie Kaninchen, Vorteile (z.B. ähnliche kardiale Elektrophysiologie im Vergleich zu Menschen und andere Großtiere), Beibehaltung eine gute kostengünstige Balance. Hier zeigen wir, wie eine perkutane Kontrast Echokardiographie-geführte Intramyocardial (IMI) Injektionstechnik, ausführen, die minimal-invasive, sichere, gut verträglich und sehr wirksam bei der gezielten Bereitstellung von Injectates, einschließlich der Zellen ist, in mehreren Standorten innerhalb der Herzmuskel eines Kaninchen-Modells. Für die Umsetzung dieser Technik haben wir auch eine verbreitete klinische Echokardiographie-System genutzt. Nachdem man in der Praxis das Protokoll beschrieben hier, ein Forscher mit grundlegenden Ultraschall wissen werden kompetent bei der Erfüllung dieser vielseitige und minimal-invasive Technik für den Routineeinsatz in Experimenten, die darauf abzielen, Testen von Hypothesen von der Funktionen der kardialen regenerativen Therapeutika in der Kaninchen-Modell. Kompetenz erreicht, kann die ganze Prozedur innerhalb von 25 Minuten durchgeführt werden, nach dem Betäuben der Kaninchens.
Einleitung
Zell- und Gentherapie Therapien sind aufregend und immer Entwicklung von Strategien für die Regeneration/Reparatur der geschädigten Herzmuskel in HFrEF. Einige Studien haben die Wirksamkeit (z.B. Zelle Rückhalterate) von den verschiedenen Routen der Zelle Lieferung verglichen, die konsequent die Überlegenheit des IMI über intracoronary oder intravenös Routen1,2 unter Beweis gestellt haben , 3 , 4 , 5. so, ist es nicht verwunderlich, dass ein Großteil der Studien auf translationale Modelle der Stamm....
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Protokoll
Die hier beschriebenen Experimente wurden von der Ethikkommission der Forschung der Universität Murcia, Spanien, genehmigt und wurden gemäß Richtlinie 2010/63/EG der Europäischen Kommission durchgeführt. Die beschriebenen Schritte wurden unter operativen Standardprotokolle, die nicht ausschließlich für die Zwecke der Dreharbeiten des dazugehörigen Videos zu diesem Papier durchgeführt wurden und wurden Teil des Plans der Arbeit durchgeführt.
1. Vorbereitung der Zellen und Säugetieren Expressionsvektor
Hinweis: Hier beschreiben wir kurz ein Protokoll für die Vorbereitung und Transfektion einer Zelllinie (menschliche ....
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Ergebnisse
Perkutane Kontrast Echokardiographie-geführte IMI mit InI:
Mit dem Protokoll beschriebenen, und sobald die optimale Positionierung der Spitze der Nadel durch Echokardiographie und die Injektion initiiert bestätigt wurde, Transmural Hyperechogenicity bei der Lieferung von InI beobachtet wurde (10 % V/V mit PBS-Puffer) (Abb. 2E) , auch so kurz nach der IMI in der Zielregion (
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Diskussion
Das primäre Ziel war es, eine minimal-invasive Technik zu entwickeln, die für die Lieferung von Stammzellen in das Myokard Kaninchen (eine groß dimensionierte präklinischen Tiermodell)17,18, verwendet werden könnten, während die Verwendung von nutzen eine relativ kostengünstig imaging-System leicht zugänglich in vielen klinischen und Forschungszentren. Hier zeigen wir, dass mit einem klinischen Echokardiographie-System und unterstützt durch InI, ein weithin verfü.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren danken Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz und Manuel Molina für exzellente Unterstützung bei der Sammlung von Daten und Carlos Bueno für die Bereitstellung der EGFP(+) HEK-293-Zellen. Diese Arbeit wurde teilweise durch unterstützt: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Spanien (JT) (Anzahl zu gewähren: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de ich + D + I 2008-2011 (keine zu gewähren. RD12/0019/0001) (JMM), kofinanziert mit Mittel aus den Strukturfonds der Europäischen Union (FEDER) (JMM); und der University of Reading, Vereinigtes Königreich (AG, GB) (zentrale Finanzieru....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| HD11 XE Ultraschallgerät | Philips | 10670267 | Echokardiographie-System. |
| S12-4 | Philips | B01YgG | 4-12 MHz Phasenarray-Schallkopf |
| Ultraschall-Transmissionsgel (Aquason) | Parket laboratories Inc | N 01-08 | |
| Vasovet 24G | Braun | REF 381212 | Katheter über die Nadel |
| Omnifix-F 1 ml Spritze | Braun | 9161406V | |
| Imalgene (Ketamin) | Merial | RN 9767 | Tierärztliche Verschreibung erforderlich |
| Domtor (Medetomidin) | Esteve | CN 570686.3 | Tierärztliche Verschreibung ist erforderlich |
| Heizkissen | |||
| Faber-Castel TG1 | Faber-Castel | 16 33 99 | Indien (China) Ink |
| Holter Syneflash | Ela medical | SF0003044S | 24 h Holter EKG-System. |
| Elektroden Blue Sensor® | Ambu (NUMED) | VLC-00-S | Holter-EKG-Elektroden. |
| Mikrotom | Leica Biosystems | RM2155 | |
| Mikroskop | Olimpus | CO11 | |
| ABC Vector | Elite Vector Laboratories | PK-6200 | Avidin Biotin Complex Kit. |
| Hühner-Anti-GFP-Antikörper | Invitrogen | A10262 | Primärer Antikörper. |
| Biotinylierter Ziegen-Anti-Hühner-IgG-Antikörper | Vector Laboratories | BA-9010 | Sekundärer Antikörper. |
| 3,30-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB) | DAKO (Agilent) | S3000 | |
| Fluoreszenzmikroskop | Carl Zeiss MicroImaging | Zeiss AX10 Axioskop | |
| Holter-EKG | Elamedical | Syneflash SF0003044S | |
| Dulbecco s modifizierter Eagle medium (DMEM) | Fisher | Scientific 11965084 | |
| 10 % fötales Kälberserum (FCS) | Fisher Scientific | 11573397 | |
| 0,05 % Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Fisher Scientific | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 (Lipidtransfektionsreagenz) | Fisher | Scientific 11668019 | |
| Reduziertes Serummedium (Opti-MEM) | Fisher Scientific | ||
| Hygromycin B | Calbiochem (MERCK) | 400051 | |
| Xylol (histologisch) | Fisher Scientific | X3S-4 | |
| Wasserstoffperoxidlösung (H2O2) | Sigma | H1009 | |
| Pronase | Fisher Scientific | 53-702-250KU |
Referenzen
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
- Freyman, T., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
