Subretinale Transplantation von humanen embryonalen Stammzellen abgeleitet retinalen Pigment Epithelzellen zu einem großen Augen geographische Atrophie

Zusammenfassung

Retinalen Pigment Epithelzellen könnte als eine Zelle-Ersatz-Therapie für die fortgeschrittene Form der trockene altersbedingte Makuladegeneration dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines großen Augen Modells der geografischen Atrophie und die subretinale Transplantation von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigment Epithelzellen auf dieses Modell der Krankheit.

Zusammenfassung

Geografischen Atrophie (GA), die späte Phase der trockene altersbedingte Makuladegeneration zeichnet sich durch Verlust der retinalen Pigment (RPE) Epithelschicht, führt zu einer nachfolgenden Degeneration des lebenswichtigen retinalen Strukturen (z.B. Photorezeptoren) verursacht schwere Sehbehinderung. Ebenso ist RPE-Verlust und Abnahme der Sehschärfe in langfristigen Folgen oben gesehen von Patienten mit fortgeschrittenen Feuchte altersbedingte Makuladegeneration (AMD), die intravitreale Anti-vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) Behandlung. Daher ist es auf der einen Seite grundlegende effizient RPE-Zellen aus einer unbegrenzten Quelle abgeleitet, die als Ersatz-Therapie dienen könnte. Auf der anderen Seite, es ist wichtig, das Verhalten und die Integration der abgeleiteten Zellen in einem Modell der Krankheit mit chirurgischen bewerten und bildgebende Verfahren wie nah wie möglich an die beim Menschen angewendet. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll basierend auf unseren bisherigen Veröffentlichungen, die die Generation der präklinischen Modell GA beschreibt mit Albino Kaninchenauge für Bewertung der menschlichen embryonalen Stammzellen retinalen Pigment Epithelzellen (hESC-RPE) abgeleitet in eine klinisch relevante Einstellung. Differenzierte hESC-RPE werden verpflanzt in naiven Augen oder mit NaIO₃-GA-Like Netzhautdegeneration mit einer 25 G Transvitreal Pars Plana Technik induziert. Bewertung der degenerierten und transplantierten Gebieten erfolgt durch multimodale hochauflösende nichtinvasive Echtzeit-Bildgebung.

Einleitung

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines großen Augen präklinischen Modell der geografischen Atrophie (GA), die die Auswertung der Integration von transplantierten hESC-RPE in den subretinalen Raum ermöglicht. Die hier ausführlich beschriebenen Methoden wurden in 3 neueren Publikationen verwendet, die die Produktion einer angereicherten, rein und funktionale Bevölkerung von RPE-Zellen aus hESC¹sowie die Schaffung der äußeren Netzhaut Schaden und ein GA-ähnlichen Phänotyp zeigen induziert durch die subretinale Injektion von physiologischen Salzlösungen (d.h., BSS und PBS) oder NaIO₃ im Kaninchen Auge^2,3. Wir zeigten weiter, dass subretinalen Aussetzung Transplantationen von hESC-RPE umfangreiche funktionale Monolagen mit Photorezeptor Rettung Kapazität^{2 bilden}.

Mehrere Vorteile begleiten den Einsatz von Kaninchenauge zur Erzeugung von einem GA-Modell der Krankheit. Erstens, die Größe der Kaninchenauge, die 70 % das Volumen eines Erwachsenen menschlichen Auges, können klinisch bedeutsamen Transplantation mit einer Zelldichte, die viel niedriger als in kleinen Nagetier Augen (1.000 Zellen/µL vs. 50.000 Zellen/µL)⁴ routinemäßig eingesetzt ^{, 5}. Zweitens Chirurgie bei Nagetieren ist in der Regel Transscleral durch die Aderhaut, die Kompromisse der retinalen-Schranke und potenziell löst eine Entzündungsreaktion und eine mögliche Ablehnung-⁶. Beide Faktoren können zu Ölpauseverfahren und Verklumpung der transplantierten Zellen und einer insgesamt schlechten Integration der transplantierten Zellen in einem gestörten native Netzhautgewebe zusammen führen. Die großen Augen Kaninchen-Modell ermöglicht jedoch eine Operationstechnik mit Instrumentierung identisch mit einer klinischen Umgebung durchführen. Drittens ermöglicht eine große-Augen-Modell auch mit hoher Auflösung in Vivo imaging und Überwachung der transplantierten Zellen und der darüberliegenden Netzhaut durch Zeit^1,2,3. So beschreiben wir eine klinisch relevante und kosteneffiziente präklinische Modell, die eine attraktive Alternative zu Nagetiere für jedermann mit einem Interesse in der Forschung der normalen und krankhaften Netzhaut und subretinalen Raum sein sollte.

Protokoll

Das folgende Protokoll folgt die Tierbetreuung Richtlinien des Karolinska Instituet. Alle Tierversuche mit Neuseeland Albino Kaninchen (Table of Materials) von der regionalen Tier Ethikkommission (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) genehmigt worden (zulassen: Dnr 56/15). Die Verwendung von hESC (Dnr 2011/745-31/3) und die Übertragung und Bearbeitung von hESC-RPE (Dnr 2013/813-31/2) steht auch im Einklang mit den schwedischen Gesetzen und Vorschriften des Karolinska Institutet und genehmigt wurde, von der regionalen menschliche Ethik Komitee ( Regionala Etikprövningsnämnden ich Stockholm).

1. subretinale Injektion von Natrium Jodat (NaIO₃) in einem Tiermodell mit großen Augen

1. Tiere durch intramuskuläre Verabreichung in den Oberschenkel mit einer Mischung aus 35 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin in Kochsalzlösung mit einer 30 G Spritze zu betäuben, und Schülerinnen und Schüler mit topischen Augentropfen mit einer Mischung aus Cyclopentolate und 2,5 % Phenylephrin 0,75 % dehnen. Richtige Anesthetization wird bestätigt, wenn das Tier nicht auf eine harte Prise seine hintere Bein reagiert.
2. Legen Sie die Kaninchen unter dem Operationsmikroskop mit dem Kopf nach dem Chirurgen (Abbildung 1A). Verwenden Sie einen Deckel-Retraktor, um Augenlider und Nictitans Membran mit einem sterilen Tuch zur Minimierung des Risikos einer Kontamination zu entfernen. Verwendung ausgewogen Salzlösung (BSS), Trockenheit während Narkose in beiden Augen zu verhindern.
3. Für Mikrochirurgie, Verwendung einer 2-Port (oder optional 3-Port) 25 G Transvitreal pars Plana Technik mit nicht geschlossenen Trokare für das Einfügen von mikrochirurgischen Instrumenten (Abbildung 1 b). Multifunktions-Vitrektomie-Maschine verfügt über Anschlüsse, eine Infusion Kanüle, Endoillumination, Vitrector und Endolaser zu verbinden. Für subretinalen Injektionen ist nur die Endoillumination obligatorisch, wodurch eine 2-Port-Einstellung ausreichend. Legen Sie die Endoillumation durch den oberen linken Trokar und verwenden Sie den oberen rechten Trokar für die subretinale Injektionskanüle.
   1. Verwenden Sie für eine 3-Port-Konfiguration den unteren zeitlichen Trokar für die BSS-Infusion-Kanüle. Wenn optionale Instrumente (z. B. eine Vitrector) werden verwendet, fügen Sie sie durch den oberen rechten Trokar.
   2. Legen Sie die oberen 2 Trokare 1-2 mm aus dem Limbus mit krallenbewehrten Pinzette zu greifen und die Bindehaut über die Einstichstelle zu verdrängen.
   3. Stellen Sie sicher der Trokare sind eingefügte Transsclerally in einem parallelen Winkel von 30-45° Limbus, und fahren Sie bis zur Mitte der Spitze der den Trokar. Dann drehen Sie den Trokar 90° und voraus in das Auge, mit dem Ziel am hinteren Pol des Auges. Dieses Verfahren wird postoperative Leckage aus der Sclerotomies vermeiden und auch verringern das Risiko von Endophthalmitis (z. B. bakterielle Infektion im Auge). Siehe auch Abbildung 2 b für Trokar Positionen.
   4. Setzen Sie einen einmaligen Gebrauch flache Kontaktlinsen auf der Hornhaut, die Netzhaut, mit synthetischen Tränen als Kontaktgel zwischen Auge und Kontaktlinse (Abbildung 1A) zu visualisieren.
   5. Ziehen Sie 500 µL NaIO₃ in eine 1 mL Spritze verbunden mit einem Verlängerungsrohr (betrieben von der Assistentin) und 38 G Polytip Kanüle (betrieben durch den Chirurgen).
   6. Fügen Sie der Endoillumination Sonde durch den oberen linken Trokar und die Injektionskanüle durch den oberen rechten Trokar ein und fördern Sie die Kanüle durch den gläsernen Raum in Richtung der Netzhaut, mit dem Ziel, für den Bereich direkt unterhalb des Sehnervenkopfes.
   7. Lassen Sie die Spitze der Kanüle, die Netzhaut langsam zu berühren, bis eine fokale Aufhellung sichtbar ist. Die Injektion selbst dringt die Netzhaut, zulassend subretinalen Lieferung. Lassen Sie sich nicht die Kanüle die Netzhaut zu durchdringen, da dies zu Blutungen führen kann.
   8. Injizieren Sie 50 µL NaIO₃ subretinally über einen Zeitraum von 5 s. Da gibt es eine natürliche Spaltung Ebene zwischen der Netzhaut und der darunter liegenden Aderhaut, sollte eine deutlich sichtbare halbtransparenten Lungenblase allmählich während der Injektion bilden.
   9. Während der Injektion langsam zurückziehen der Nadelöhrs, aber stellen Sie sicher, dass die Spitze innerhalb der Lungenblase Rückfluß zu minimieren eingehalten wird.
   10. Nach dem Entfernen der Kanüle Endoillumation und Injektion der Trokare mit krallenbewehrten Pinzette zu entfernen, und üben Sie leichten Druck für 30 s, um die selbstdichtenden Naht-weniger Sclerotomies mit der Spitze oder der stumpfen Ende der Zange.
4. Postoperativ geben Sie 10 mL Kochsalzlösung subkutan, um Austrocknung zu verhindern. Geben Sie keine postoperative topische Steroide oder Antibiotika. Für Analgetika 0,5 mL Buprenorphin 0,3 mg/ml subkutan nach der Operation, als auch am Tag nach der Operation geben.
5. Nach der Verwendung waschen alle Instrumente durch Eintauchen für ein paar Sekunden zunächst in 70 % igem Ethanol, zweitens in 45 % Ethanol, und schließlich in destilliertem Wasser. Richtig mit einem Papiertuch abtrocknen.
6. Besuchen Sie Tiere, bis sie wieder genügend Bewusstsein und Sie sie alle einzelnen Tangotanzen legen. Auf Wunsch (z.B.Immunohistochemistry Zwecken) einschläfern von Tieren durch intravenöse Injektion von 100 mg/kg Pentobarbital (siehe Tabelle der Materialien).
7. Warten Sie 7 Tage mit der Transplantation von hESC-RPE-Zellen fortfahren.

2. subretinalen Transplantationen von hESC-RPE-Zellen im behandelten Tiere

1. Verwalten Sie 2 mg (100 µL) der intravitrealen Triamcinolon bei narkotisierten Tieren mit einer 30 g Injektionsnadel 1-2 mm aus dem Limbus im unteren temporalen Quadranten 1 Woche vor der Transplantation hESC-RPE und neu verwalten sie alle 3 Monate. Achten Sie darauf die Spitze in Richtung der hinteren Pol des Auges, einen Objektiv-Touch zu vermeiden.
2. Kultur eine hESC-RPE Monolage wie zuvor¹beschrieben.
3. Zelle Differenzierung Media (siehe Tabelle der Materialien) von einer 24-Well konfluierende hESC-RPE monomolekularen Film zu entfernen und waschen jeweils gut mit 500 µL PBS ohne Ca^{2 +} und Mg^{2 +}. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal, für eine Gesamtmenge von 2 Wäschen.
4. Überstand verwerfen, 500 µL von Trypsin pro Bohrloch hinzufügen und 12 min bei 37 ° c inkubieren
5. Die Platte kippen und vorsichtig Trypsin (Zellen sollte die Platte befestigt bleiben). Zellen in 800 µL frische 37 ° C vorgewärmte Differenzierung Medien durch sanfte pipettieren, oder sogar kratzen, wenn nötig, um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten, zu sammeln.
   Hinweis: Verwenden einer 40 µm-Sieb Zelle Zelle Klumpen eingehalten.
6. Anzahl der Zellen in einer Hemocytometer-Kammer mit 0,2 % Trypan blau, entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
7. 5 mL Differenzierung Medien und Zentrifuge Zellen bei Raumtemperatur, 300 X g für 5 min zugeben.
8. Überstand verwerfen und Pellet in frisch Filter sterilisiert PBS (durch eine 25 mm-Spritze-Filter geleitet), eine Endkonzentration von 1.000 Zellen/µL aufzuwirbeln.
9. Aliquot der vorherigen Zellsuspension in 600 µL Aliquots und halten Sie auf dem Eis bis und während der Operation.
10. Betäuben Sie Tiere durch intramuskuläre Verabreichung in den Oberschenkel mit einer Mischung aus 35 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin in Kochsalzlösung mit einer 30 G Spritze. Erweitern Sie Schülerinnen und Schüler mit topischen Augentropfen mit Amix von 0,75 % Cyclopentolate und 2,5 % Phenylephrin. Richtige Anesthetization wird bestätigt, wenn das Tier nicht auf eine harte Prise in seine hintere Bein reagiert.
11. Legen Sie die Kaninchen mit dem Kopf nach dem Chirurgen. Verwenden Sie einen Deckel-Retraktor, um Augenlider und Nictitans Membran mit einem sterilen Tuch zur Minimierung des Risikos einer Kontamination zu entfernen. Verwenden Sie BSS Trockenheit während Narkose in beiden Augen zu verhindern.
12. Für Mikrochirurgie, Verwendung einer 2-Port (oder optional 3-Port) 25 G Transvitreal pars Plana Technik mit Trokare platziert in den gleichen Positionen wie in Schritt 1.3 und Abbildung 2beschrieben. Wenn die vorherigen Sclerotomies sichtbar sind, führen Trokar einführen angrenzend, aber nicht durch diese, zur Minimierung des Risikos von postoperativen Leckage.
    1. Setzen Sie einen einmaligen Gebrauch flache Kontaktlinsen auf der Hornhaut, die Netzhaut, mit synthetischen Tränen als Kontaktgel zwischen Auge und Kontaktlinse (Abbildung 1A) zu visualisieren.
    2. Injizieren Sie nach der richtigen Spitze Positionierung (siehe Schritte 1.3.5 und 1.3.6) 50 µL einer sanft gemischt hESC-RPE-Suspension (50.000 Zellen) subretinally. Ziel für die Mitte des Bereichs NaIO₃ vorbehandelt zeichnet sich durch einen charakteristischen "metallic" Endo-Beleuchtung-Reflex. Die neurosensorische Netzhaut sollte trennen leicht schaffen eine deutlich sichtbar auf. Bündig die Nadel mit sterilen H₂O dazwischen Kaninchen/nach verwenden, um die Nadel verstopfen durch Zelle zu vermeiden Klumpen. Änderung der Nadel bei Verstopfung wird bemerkt.
    3. Während der Injektion langsam zurückziehen der Nadelöhrs, aber stellen Sie sicher, dass die Spitze innerhalb der Lungenblase Rückfluß zu minimieren eingehalten wird.
    4. Nach dem Entfernen der Kanüle Endoillumation und Injektion der Trokare mit krallenbewehrten Pinzette zu entfernen, und üben Sie leichten Druck für 30 s, um die selbstdichtenden Naht-weniger Sclerotomies mit der Spitze oder der stumpfen Ende der Zange.
13. Postoperativ geben Sie 10 mL Kochsalzlösung subkutan, um Austrocknung zu verhindern. Geben Sie keine postoperative topische Steroide oder Antibiotika. Für Analgetika 0,5 mL Buprenorphin 0,3 mg/ml subkutan nach der Operation, als auch am Tag nach der Operation geben.
14. Nach der Verwendung waschen alle Instrumente durch Eintauchen für ein paar Sekunden, zunächst in 70 % igem Ethanol, zweitens in 45 % Ethanol, und schließlich in destilliertem Wasser. Richtig mit einem Papiertuch abtrocknen.
15. Besuchen Sie Tiere, bis sie wieder genügend Bewusstsein und Sie sie alle einzelnen Tangotanzen legen. Bei Bedarf (z.B. für Zwecke der Immunhistochemie) einschläfern von Tieren durch intravenöse Injektion von 100 mg/kg Pentobarbital.

3. in Vivo Retinal und subretinalen Imaging

1. Spectral-Domain optische Kohärenz Tomographie (SD-OCT) Gerät mit der mitgelieferten Software zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien), Cross-sectional b-Scans von den behandelten Tieren, laut Angaben des Herstellers zu erhalten. Um Bild Unschärfe zu vermeiden, achten Sie darauf, die Hornhaut feucht zu halten, durch alle 30-60 s mit topischen Kochsalzlösung spülen.
   1. Legen Sie den narkotisierten und Pupille Tiere (siehe Schritte 1.1 und 2.10) in eine verstellbare Halterung, einen ungehinderten Weg von der Lichtquelle Instrument der Kaninchen Netzhaut zu erhalten.
   2. Erhalten Sie mindestens 3 OCT Scans mit gleichzeitiger Infrarot-konfokalen scanning Laser Ophthalmoskopie (IR-cSLO) Reflexion Referenzbilder repräsentiert die oberen, mittleren und untere Teil der Injektionsbereich.
   3. De-Gesicht Fundus Bilder mit cSLO blau, grün, Infrarot- und mehrfarbigen laser Reflexion (d.h. mehrere gleichzeitige Laser-Farben), bzw. zu erhalten.
   4. Aufnahmen Sie blaues Licht Autofluoreszenz (BAF) Verwendung der Blaulicht-Laser-Fähigkeit des Gerätes SD-OCT.

Ergebnisse

Vertreter in Vivo Bilder von BAF, IR-cSLO und SD-OCT der normalen Albino Kaninchen Netzhaut sind in Abbildung 2dargestellt. Beachten Sie die verschiedenen Schichten der Netzhaut mit ihrer markanten Ebenen der Lichtreflexion von der SD-OCT Instrument erfasst.

In Abbildungen 1A und 1 b Abbildung, wird das Setup erstellen subretinalen...

Diskussion

In diesem Protokoll wird die Generation eines großen Augen Modells der GA und den präklinischen Einsatz für die Bewertung der hESC-RPE Integration in Vivo beschrieben.

Für die Übersetzung der regenerative Therapien für GA und damit verbundenen Krankheiten in die Klinik-⁷ist es wichtig, Entwicklung und Optimierung von Methoden, die die klinischen Methoden für Transplantation und Imaging treu zu erfassen. Das Kaninchen ist in dieser Hinsicht attraktiv: Es hat ein...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NutriStem hESC XF Differenzierung Medium – bFGF und – TGFb	Biological Industries	06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	12563-011
PBS ohne Ca2+ und Mg2+	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	14190-094
Zellsieb 40 μ m Nylon	VWR	732-2757
Nadel 30 G 0.5' ’; 0,3 mm x 13 mm	BD Mikrolanze	304827
Acrodisc 25 mm Spritzenvorsatzfilter	Acrodisc	PN4612
0,4 % Trypanblau	ThermoFisher Scientific Corp	15250061	Verwendung bei 0,2 %
NaIO3	Sigma-Aldrich Corp	S4007
BSS	Alcon Nordic A/S	65079550
70 % Ethanol	Solveco AB	1047
Ketaminol, 100 mg/ml	Intervet, Boxmeer	511519	Anwendung 35 mg/kg Ketamin
Rompun vet, 20 mg/ml	Bayer Animal Health	22545	Anwendung 5 mg/kg Xylazin
Triescence, 40 mg/ml	Alcon Nordic A/S	412915	2 mg intraviterielle
Cyklopentolat-phenylephrin, 0,75 % + 2,5 %	APL	321968	1 Tropfen in jedes Auge geben
Viscotears	Laboratoires Thé a	597562
Topische Kochsalzlösung	Apotea AB	7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL	Omnidea	77168	Verwenden Sie 100 mg/mL Pentobarbital
Verlängerungstube (Hammer)	MedOne Surgical Inc	3223
25 G/38 G Polytip subretinale Kanüle	MedOne Surgical Inc	3219	25 G/38 G
Einweg-Flachlinse	Volk
Barraquer Colibri Deckelretraktor	AgnTho's AB	42-020-030
Trokare ohne Ventil	Alcon Nordic A/S	8065751448
Krallenzange	Bausch & Lomb Nordic AB	ET1811
Alcon Accurus 400VS Vitrektomiegerät	Alcon Nordic A/S	8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrektomie TotalL Plus Pak	Alcon Nordic A/S	8065751493
SD-OCT Gerät	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+OCT	Verwenden Sie Heidelberg Eye Explorer Version 1.9.10.0
24-Well-Platten	Sarstedt	83.3922
Neubauer Hämozytometer	VWR	631-0925
Neuseeländische Albino-Kaninchen	Lidkö pings Kaninchenfarm, Schweden
hESC-RPE-Zellen			Siehe Referenznummer 1
Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml	Dechra	660500	0,5 mL Buprenorphin subkutan verwenden