Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

Nouran S. Abdelfattah; Ann Mullally

doi:10.3791/56726

Methodenartikel

Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

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DOI:

10.3791/56726

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5. Januar 2018

Nouran S. Abdelfattah¹ , Ann Mullally¹^,²^,³

¹Division of Hematology, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, ²Broad Institute, ³Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Gezielte gen bearbeiten CRISPR/Cas9 hat das Verständnis der biologischen Funktionen der Gene erheblich erleichtert. Hier nutzen wir die CRISPR/Cas9-Methodik zu Modell Calreticulin Mutationen in hämatopoetischen Zellen Zytokin-abhängige um ihre onkogenen Aktivität zu studieren.

Zusammenfassung

Gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) ist eine adaptive Immunsystem in Prokaryoten, die von Wissenschaftlern, RNA-geführte Nukleasen wie CRISPR-assoziierten (Cas) 9 für standortspezifische eukaryotische Genom zu generieren umgewidmet worden bearbeiten. Genom-Engineering von Cas9 wird verwendet, um effizient, leicht und robust endogene Gene in vielen biomedizinisch relevante Säugetieren Zelllinien und Organismen ändern. Hier zeigen wir ein Beispiel dafür, wie die CRISPR/Cas9 Methode um zu verstehen, die biologische Funktion von bestimmten genetischen Mutationen zu nutzen. Wir modellieren Calreticulin (Carl) Mutationen im murinen Interleukin-3 (mIL-3) abhängigen Pro-B (Ba/F3) Zellen durch Lieferung von einzelnen Guide RNAs (SgRNAs) gezielt den endogenen Carl Locus in der jeweiligen Region wo einsetzen und/oder Löschung (Indel ) Carl Mutationen bei Patienten mit myeloproliferative Neoplasmen (MPN), eine Art Blutkrebs. Die SgRNAs erstellen Doppelstrang Brüche (DSB) in der gezielten Region, die von nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) um Indels in verschiedenen Größen geben ausgebessert werden. Dann setzen wir den standard Ba/F3 zellulären Transformation Assay, die Wirkung der physiologischen Ebene Ausdruck von Carl Mutationen auf hämatopoetischen zellulären Transformation zu verstehen. Dieser Ansatz kann auf andere Gene, ihre biologische Funktion in verschiedenen Säugetieren Zelllinien zu studieren angewendet werden.

Einleitung

CRISPR/Cas9 hat vor kurzem revolutioniert gezielte Genom-Bearbeitung in lebenden Zellen und Organismen. Es ist ein äußerst leistungsfähiges Werkzeug für die biomedizinische Forschung geworden und wird derzeit als ein möglicher Weg für Therapie von Erbkrankheiten¹genutzt werden. Die Grundlage für alle Genome editing-Tools stützt sich auf die Schaffung einer Nuklease-induzierten DNA gestrandeten Doppelunterbrechung (DSB) auf der genomischen Lokus geändert werden. Die DSB können durch nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) oder unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR)²^,³repariert werden....