Eine effiziente In-vitro- Umsetzung-Methode durch eine Transcriptionally geregelten Schönheit Schlafsystem verpackt in eine Integration defekt Lentivirale Vektor

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um stabile Integration eines Gens von Interesse des menschlichen Genoms durch das transcriptionally regulierte Dornröschen -System zu erreichen. Vorbereitung der Integration von defekten Lentivirale Vektoren, die in-vitro- Transduktion von menschlichen Zellen und molekulare Tests auf Zellen ausgestrahlt werden gemeldet.

Zusammenfassung

Das Transposon Sleeping Beauty (SB) ist ein nicht-viralen Integration System mit nachgewiesener Wirksamkeit für Gentransfer und funktionelle Genomik. Um die SB-Transposon-Maschinen zu optimieren, sind ein transcriptionally geregelten hyperaktiv Transposase (SB100X) und T2-basierte Transposon beschäftigt. In der Regel werden die Transposase und Transposons vorübergehend von Plasmid Transfektion und SB100X Ausdruck wird angetrieben von einem konstitutiven Promoter. Hier beschreiben wir eine effiziente Methode um die SB-Komponenten an menschliche Zellen zu liefern, resistent gegen verschiedene physikalische und chemische Transfektion Methoden, SB100X Ausdruck zu steuern und stabil integrieren ein Gen des Interesses (GOI) durch eine "Ausschneiden und einfügen" SB Mechanismus. Der Ausdruck der hyperaktive Transposase wird durch das Tet-ON-System, häufig verwendet, um die Genexpression seit 1992 kontrollieren streng kontrolliert. Das gen des Interesses wird von invertierte Wiederholungen (IR) der T2 Transposons flankiert. Beide SB-Komponenten werden bei der Integration verpackt defektive Lentivirale Vektoren vorübergehend in HEK293T Zellen hergestellt. Menschliche Zellen, Zell-Linien oder primäre Zellen aus menschlichen Gewebe sind in-vitro- vorübergehend mit viralen Vektoren ausgestrahlt. Nach Zugabe von Doxycyclin (Dox, Tetracyclin analog) in das Kulturmedium eine Feinabstimmung der Transposase Ausdruck wird gemessen und ergibt eine dauerhafte Integration der das gen des Interesses in das Genom der behandelten Zellen. Diese Methode ist effizient und für die Zell-Linie (z. B. HeLa-Zellen) und primäre Zellen (z. B. menschliche primären Keratinozyten) und stellt somit ein wertvolles Werkzeug für Gentechnik und therapeutischer Gentransfer.

Einleitung

Die hyperaktiven SB100X Transposase gekoppelt an das T2-basierte Transposon wurde bereits in präklinischen Gen Therapie Anwendungen^1,2,3, Genom Änderungen^4,5, verwendet und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) Neuprogrammierung^6,7. In der Regel werden die SB-Komponenten vorübergehend von Plasmid Transfektion und starken konstitutiven Promoter treibt den Ausdruck der Transposase. Dennoch, trotz der verbesserten neuen Methoden der Transfektion Lieferung vo....

Protokoll

(1) Plasmide eingesetzt

Hinweis: Plasmid pCCL-PGKrtTA2^S-M2 wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Zappavigna (Universität von Modena und Reggio Emilia, Modena, Italien). Die pCMVSB100X Plasmid trägt die kodierende Sequenz des hyperaktiven Transposase und pT2/BH Transposon Plasmid wurden freundlicherweise von Prof. Z. Ivics (Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Deutschland) und Prof. Z. Izvak (Max-Delbruck-Centrum für Molekularmedizin, Berlin, (Deutschland).

1. Folgen Sie für alle Klonen in Escherichia Coli (E. Coli) die Klonen Strategie der Wahl und Restriktionsenzym Verfahren oder PCR-Amplifi....

Ergebnisse

Mit dem Verfahren präsentiert hier drei IDLV Vektoren tragen die regulierten SB-Komponenten (SB100X, rtTA2^S-M2 und T2-GFP Transposon) wurden verpackt und verwendet, um effizient und straff regulieren das SB-System in den menschlichen Zellen. Abbildung 1A zeigt ein Schema für in-vitro- Transduktion von HeLa-Zellen, die durchgeführt wurde, die transkriptionelle Regulierung der SB Transposase mit die beste Dosis Kombination der beiden IDLV Ve.......

Diskussion

Hier beschreiben wir eine allgemein zugängliche Methodik ein GOI stabil in das Genom der Zielzellen von Dornröschenzu integrieren-Umsetzung vermittelt. Obwohl das SB-System entwickelt wurde, um ein nonviral Verfahren für die Bearbeitung von Genom zu schaffen, ist die effiziente Bereitstellung der Integration Maschinen (Transposase und T2 Transposon) obligatorisch. Daher wurde eine virale Lieferung von SB-Komponenten um das SB-System auf kaum transfectable Primärzellen verwenden, in den letzten Jahren

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium mit 4,5 g/L Glukose ohne L-Glutamin	Lonza	BE12-614F	Zellkulturmedium.
HyClone Fetal Bovine Serum (USA), charakterisiert	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum, das HEK293T Zellkulturen für die Produktion lentiviraler Partikel verwendet wird.
Penicillin 10.000 UI/ml, Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagenzien für Zellkulturmedium.
L-Glutamin 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagenz für Zellkulturmedium.
Natriumchlorid (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagenz für die HBS 2X-Herstellung.
HEPES Buffer, 1M Vorrat in normaler Kochsalzlösung	Lonza	BE17-737E	Reagenz für die HBS 2X Vorbereitung.
Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4· 2H2O), 99,5	Merck	106580	Reagenz für die HBS 2X-Vorbereitung.
Salzsäure - ACS Reagenz 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagenz für die HBS 2X-Herstellung.
Steriles Wasser für Injektionszwecke	Fresenius		Kabi-Reagenz zur Herstellung von HBS 2X.
0,45 &Mikro; m PESS Filter	Whatman	10462100	Filter zur Entfernung von Zelltrümmern aus dem Virusüberstand.
Polyallomer Beckman Röhrchen	Beckman Coulter	326823	Röhrchen zur Konzentration von IDLV-Vektoren durch Ultrazentrifugation.
PBS-1X ohne Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Puffer für die Zellwäsche und die Resuspension lentiviraler Partikel.
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(optional) Puffer für die Resuspension lentiviraler Partikel.
HIV-1 Gag p24 Immunocapture Kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit für die IDLV-Partikeltitration.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagenz zur Verbesserung der Transduktionseffizienz.
Trypsin (10X) 2,5% in HBSS ohne Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagenz zur Ablösung von HeLa-Zellen (Stammlösung, zu verdünnen).
Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagenz zur Herstellung von Trypsin-Arbeitslösung.
0,5 % Trypsin-EDTA, kein Phenolrot (10X)	GIBCO	15400-054	Reagenz zur Ablösung von Keratinozyten (Stammlösung, zu verdünnen).
Spender-Rinderserum, neuseeländische Herkunft	GIBCO	16030-074	Serum für Schweizer Maus 3T3-J2 Zellkultur (Feeder-Schicht).
Schinken" s F12 Medium	GIBCO	21765	Medium für Keratinozyten.
Fötales Rinderserum	Lonza	DE14-801F	Serum für HeLa-Zellkulturmedium.
Fötales Rinderserum, qualifiziert, Australien Herkunft	GIBCO	10099-141	Serum für humanes primäres Keratinozyten-Kulturmedium.
Insulin aus der Bauchspeicheldrüse des Rinders	Sigma-Aldrich	I5500	Reagenzien für das Wachstum von Keratinozyten.
Adenin	VWR	1152-25	Reagenzien für das Wachstum von Keratinozyten.
Hydrocortison	VWR	3867-1	Reagenzien für das Wachstum von Keratinozyten.
Choleratoxin aus Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagenzien für das Wachstum von Keratinozyten.
Trijodthyronin	Sigma-Aldrich	T5516	Reagenzien für das Wachstum von Keratinozyten.
Humane EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagenzien für das Wachstum von Keratinozyten.
Monoklonaler APC-konjugierter Anti-Feeder-Antikörper der Maus	Miltenyi Biotech	130-096-099	Zur Markierung der Feeder-Schicht.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA-Aufreinigungskit.
SuperScript III Reverse Transkriptase	Life Technologies	18080051	Reverse Transkriptase-Kit.
Desoxynukleotid-Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagenz für die semiquantitative PCR.
Ultrareines DNase/RNase-freies destilliertes Wasser	(beliebig)	-	Reagenz für die semiquantitative PCR und für die qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq-Polymerase.
Agarose, für die	Molekularbiologie Sigma-Aldrich	A9539	Reagenz für die Agarose-Gelelektrophorese.
UltraPure FSME-Puffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagenz für die Agarose-Gelelektrophorese, zu verdünnen (1X) in ddH2O.
Ethidiumbromid	Sigma-Aldrich	E1510	Reagenz für die Agarose-Gelelektrophorese.
Doxycyclin	Sigma-Aldrich	D-9891	Wirkstoff zur Induktion der Transposase-Expression in HeLa-Zellen und in Keratinozyten
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix einschließlich Primer und Sonde.
15 ml Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen mit hoher Klarheit, konischem Boden, mit Schraubverschluss mit Domdichtung, sterile	Falcon Corning		352096-Röhrchen für die Zellentnahme und die Vorbereitung der Vektorverdünnung.
150 mm TC-behandelte Zellkulturschale mit 20 mm Gitter, sterile	Falcon Corning	353025	Zellkulturschale für die Virusproduktion.
6-Well-Multiwell-Zellkulturplatte mit klarem, TC-behandeltem Boden und Deckel, einzeln verpackte, sterile	Falcon Corning		353046-Zellkulturplatte für HeLa und humane primäre Keratinozytentransduktion.
Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, Volumen 1,5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Röhrchen für die Verdünnungsvorbereitung.
Safe-Lock Mikrozentrifugenröhrchen, Volumen 2	mL Eppendorf	0030 120.094	Röhrchen für die Verdünnungsvorbereitung.
0,2ml PCR-Röhrchen mit flachen Verschlüssen, RNase-, DNase-, DNA- und PCR-Inhibitor-freien	(beliebigen)		Röhrchen für die semiquantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well-Reaktionsplatte mit Barcode, 0,1 mL	Applied Biosystem	4346906	96-Well-Lösung für qRT-PCR.
5 ml Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden, ohne Kappe	BD Falcon 352052		Röhrchen für die Durchflusszytometrie-Erfassung.
Serologische Einwegpipetten, Polystyrol, einzeln verpackt, steril (verschiedene Volumina)	beliebig)	-	Pipetten für sterile Gewebekulturanwendungen.
Filterspitzen, steril und RNase-, DNase-, DNA- und Pyrogenfrei (unterschiedliche Volumina)	beliebig)	-	Filterspitzen für sterile Gewebesammlungen und molekularbiologische Anwendungen.
pH-Messgerät	(beliebig)	-	Gerät zur Messung von HBS 2X pH.
PCR Thermocycler	(beliebig)	-	Equipment für semiquantitative PCR.
Agarose-Gelelektrophorese-Geräte	(beliebig)	-	Geräte für die Agarose-Gelelektrophorese der semiquantitativen PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2			BD-Durchflusszytometer.
7900HT Schnelles Real-Time-PCR-System	Applied Biosystem	7900HT	Equipment für qRT-PCR.
Tischzentrifugen für die effiziente Probenverarbeitung in Zellkulturanwendungen, gekühlt, mit Mikrotiterplatten-Eimern.	(beliebig)	-	Zentrifuge für die Zellkulturaufbereitung und Spinokulation.
Optima L-90K Ultrazentrifuge, ausgestattet mit SW32TI Rotor	Beckman		für die Produktion von lentiviralen Partikeln.
Ausrüstung für Zellkultur- und Molekularbiologielabore (z. B. Laminar-Flow-Haube der Klasse II für Arbeiten mit BSL2-Materialien, Zellkultur-Inkubatoren, Kühl- und Gefrierschränke (+4 ° C, -20 &Grad; C, -80 &Grad; C), Mikropipetten und Pipettierhilfen).
Laborschutzkittel, Handschuhe, Gesichtsschutz gemäß den Regeln und Vorschriften des Instituts, insbesondere für die Produktion und Transduktion lentiviraler Partikel.

von %(( Coulter-Ultrazentrifuge