Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Zusammenfassung

In diesem Artikel präsentieren wir Methoden zum isolieren und Stromazellen Knochenmarkzellen und Blutstammzellen von Röhrenknochen Maus unterscheiden. Zwei verschiedene Protokolle sind nachgiebig unterschiedliche Zellpopulationen geeignet für Erweiterung und Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten und Osteoklasten vorgestellt.

Zusammenfassung

Knochenmark-Stromazellen Zellen (BMSCs) bilden eine Zellpopulation, die routinemäßig als eine Darstellung von mesenchymalen Stammzellen verwendet in-vitro-. Sie befinden sich in dem Knochenmark Hohlraum neben hämatopoetischen Stammzellen (HSCs), die roten Blutkörperchen, immun Stammväter und Osteoklasten hervorrufen können. So, Extraktionen der Zell-Populationen von der Knochenmark resultiert eine sehr heterogene Mischung aus verschiedenen Zell-Populationen, die Herausforderungen im experimentellen Design und Interpretation der Daten zu verwirren können. Mehrere Isolation und Kulturtechniken wurden im Labor entwickelt, um mehr oder weniger homogenen Bevölkerungen von BMSCs und HSCs Invitrozu erhalten. Hier stellen wir zwei Methoden zur Isolierung von BMSCs und HSCs aus Maus Röhrenknochen: eine Methode, die eine gemischte Bevölkerung von BMSCs und HSCs ergibt und eine Methode, die versucht, die zwei Zellpopulationen zu trennen Abkommen beruht auf. Beide Methoden liefern Zellen geeignet für osteogene und adipogenen Differenzierung Experimente sowie Funktions-Tests.

Einleitung

Primären murinen BMSCs werden häufig als in-vitro- Modell von mesenchymalen Stammzellen seit ihrer Entdeckung in den frühen 1980er Jahren¹verwendet. Kulturen der Kunststoff-anhaftende Zellen aus dem Knochenmark Hohlraum der langen Knochen gespült pflegen in der Tat, die Fähigkeit, differenziert in Osteoblasten, Osteoklasten, Chondrozyten oder Adipozyten in vielen Studien^{2,3, 4 , 5}. ist eine einzigartige Gewebe bestehend aus vielen unterschiedlichen Zellpopulationen einschließlich, aber nicht beschränkt auf, B....

Protokoll

Alle experimentelle Verfahren wurden von der institutionellen Animal Care und Use Committee am Maine Medical Center Research Institute zugelassen.

1. Sammlung Röhren Vorbereitung

1. Machen Sie BMSC Kulturmedien durch die Ergänzung von Minimum wesentliche Medium α (MEM α) mit 10 % fötalen Rinderserum und 1 % von Penicillin/Streptomycin.
2. Platz 100 µL BMSC Kulturmedien in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. 3 Knochen passen in der Regel in einer einzigen Röhre also entsprechend vorbereiten.
3. Kürzen Sie die Enden von 200 µL Pipettenspitzen genug, so dass sie in die Zentrifuge Rohre passen. Setzen Sie die Tipps in den Rohr....

Ergebnisse

Überblick über die Zellkulturen
Die beiden Kulturtechniken ermöglichen die Beurteilung der Differenzierung auf eine Mischpopulation BMCs bestehend aus BMSCs und HSCs (Total BMCs, Abb. 1A) oder eine Bevölkerung von BMSCs von HSZ (Anhänger BMSCs, Abbildung 1 b) aufgeteilt. 48 Stunden, nachdem die Zellen aus dem Knochenmark isoliert werden und (Abbildung 1 beschichtet), sie schnell b.......

Diskussion

In diesem Artikel werden zwei Methoden der Kultur des BMSCs mit ihren Vorteilen und Einschränkungen vorgestellt. Zellen aus dem Knochenmark zu isolieren, ist ein relativ müheloses Prozess. Erlangung einer Zellpopulation, die repräsentativ für die mesenchymalen Stammzellen oder osteoclastic Vorfahren kann jedoch aufgrund der vielfältigen zellulären Umgebung des Hohlraums Knochenmark eine Herausforderung sein.

Kultivierung der Gesamtheit der Knochenmark-Inhalte bietet einen engen Darstellung von.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
200 Mio. Jahre L Pipettenspitzen	Rainin	17014401
1,5 mL Zentrifugenröhrchen	USA Scientific	1615-5500
15 mL konisches Röhrchen	VWR	89039-668
konisches 50-ml-Röhrchen	VWR	89039-660
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sigma-Aldrich	21-040-CM
Ethanol	Fisher Science	04-355-451
Sezierwerkzeuge
70 μ m Filter	BD Falcon	352350
0,25 % Trypsin	Gibco	25200
Kimwipe	VWR	82003-820
Paraformaldehyd (PFA)	Elektronenmikroskopie Wissenschaft	15710
Alkalische Phosphatase Kit	Sigma-Aldrich	86R
Silbernitrat	Sigma-Aldrich	S6506
Natriumthiosulfat	Sigma-Aldrich	S7026
Öl Rot O	Sigma-Aldrich	O0625
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
neutral gepuffertes Formalin	Sigma-Aldrich	F5554-4L
Whatman-Filter Grade 1	Sigma-Aldrich	Z274852
Tartratbeständige saure Phosphatase Kit	Sigma-Aldrich	387A
Glutaraldehyd	Elektron	16220
MEMα	Gibco	12571
Fötales Rinderserum	VWR	97068-085
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
β-Glycerinphosphat	Sigma-Aldrich	G9891
Ascorbinsäure	Sigma-Aldrich	A4544
DMEM Hoher Glukose	Sigma-Aldrich	D5796
Rosiglitazon	Cayman Chemical	717410
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634
IBMX	Sigma-Aldrich	I5879
Dexamethason	Sigma-Aldrich	D4902
RANKL	Peprotech	310-01
mCSF	Peprotech	315-02
Axio Observer Wechselrichtermikroskop	Zeiss

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