Methodenartikel

Eine Quantitative Dot Blot Assay für AAV Titration und seine Verwendung für funktionale Bewertung von Adeno-assoziierten Virus Assembly-aktivierende Proteine

DOI:

10.3791/56766

⸱

12. Juni 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Manuskript beschreibt einen einfach Dot Blot Assay für die Quantifizierung der Adeno-assoziierte Virus (AAV) Titer und deren Anwendung zur Untersuchung der Rolle von Montage-aktivierende Proteine (AAPs), eine neuartige Klasse von nichttragenden virale Proteine in allen AAV Serotypen, bei der Förderung der Versammlung des Capsids verwandt und heterologen AAV-Serotypen abgeleitet.

Zusammenfassung

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Während Adeno-assoziierte Virus (AAV) als eine attraktive Vektor für die Gentherapie weithin anerkannt ist, dient es auch als Modell für das Verständnis der Biologie Virus Virus. In letzterer Hinsicht hat die jüngste Entdeckung eines nichtbauliche AAV-Proteins, Montage-aktivierende Protein (AAP), bezeichnet ein neues Licht auf die Vorgänge bei Einbau der viralen Kapsid VP Proteine in einem Kapsid vergossen. Obwohl viele AAV Serotypen AAP für die Montage benötigen, wir haben vor kurzem berichtet, dass AAV4, 5, und 11 sind Ausnahmen von dieser Regel. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass AAPs und montierten Capsids der verschiedenen Serotypen zu verschiedenen subzelluläre Kompartimente zu lokalisieren. Diese unerwartete Heterogenität in den biologischen Eigenschaften und Funktionsrollen der AAPs unter verschiedenen AAV Serotypen unterstreicht die Bedeutung der Studien über AAPs aus verschiedenen Serotypen abgeleitet. Dieses Manuskript beschreibt einen einfach Dot Blot Assay für AAV Quantifizierung und seine Anwendung auf AAP Abhängigkeit und Serotyp Spezifität in Kapsid Baugruppe zu beurteilen. Um das Dienstprogramm des Dot-Blot Assays zu demonstrieren, brachen wir um zu charakterisieren, Kapsid Montage- und AAP Abhängigkeit der Schlange AAV, ein zuvor fußgelenkes Reptil AAV, sowie AAV5 und AAV9, die bisher gezeigt wurden, AAP-unabhängige und AAP-abhängige Serotypen, beziehungsweise. Der Test ergab, dass die Schlange AAV Kapsid Montage erfordert Schlange AAP und kann nicht durch AAPs aus AAV5 und AAV9 gefördert werden. Der Test zeigte auch, dass im Gegensatz zu vielen gemeinsamen Serotyp AAPs, die Förderung der heterologen Kapsid Montage durch Kreuz-Ergänzung, Schlange AAP Versammlung des AAV9 Capsids nicht fördert. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Wahl der Nuklease erheblich das Auslesen des Dot-Blot Assays beeinträchtigt, und somit eine optimale Enzym Auswahl entscheidend für erfolgreiche Beurteilung der AAV-Titer ist.

Einleitung

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Adeno-assoziierte Virus (AAV) ist ein kleines, unbehüllte, einzelsträngige DNA-Virus mit einem Genom von ca. 4,7 Kilobases (kb). Die AAV-Genom enthält offene Lesung Frames (ORFs) für die Rep und GAP Gene. Im Jahr 2010 wurde eine bislang nicht identifizierte Elementoptionen Protein kodiert, indem ein + 1 Rahmen verschoben ORF im AAV2 GAP gen von Sonntag Et Al. entdeckt und festgestellt, dass eine entscheidende Rolle bei der Montage des AAV2 Kapsid VP Monomer Proteine in einer viralen Kapsid1. Dieses neuartige Protein wurde Montage-aktivierende Protein (AAP) nach der Rolle benannt spielt es bei der Förderung von Kapsid Montage1.

ORFs für AAP schon identifizierten Bioinformatically in den Genomen von allen Parvoviren innerhalb der Gattung Dependoparvovirus, aber nicht in das Genom der Viren von verschiedenen Gattungen des Parvovirus Familie1,2. Funktionelle Studien dieses neuartigen Proteins konzentrierten sich zunächst auf der AAP vom Prototyp AAV2 (AAP2), die die wesentliche Rolle der AAP2 etabliert hat, bei der Ausrichtung unmontiert VP Proteine der Nukleolus für ihre Ansammlung und Bildung in vollem Umfang Capsids1,3,4montiert. Die Unfähigkeit der AAV2 Capsids zusammenzubauen in Ermangelung von AAP Ausdruck wurde unabhängig von mehreren Gruppen, einschließlich der unsrigen bestätigt1,2,3,4,5 . Nachfolgende Studien zur AAV Serotypen 1, 8 und 9 bestätigt die wichtige Rolle der AAPs im Kapsid Montage als VP3 Monomer Proteine AAV1, 8 und 9 waren nicht in der Lage, eine komplett montierte Kapsid bei fehlender Co Ausdruck von AAP2zu bilden.

Vor kurzem, durch Ansätze, die die Verwendung des quantitativen Dot blot Assays, untersuchten wir die Fähigkeit der AAV1, 12 VP3 Monomere zusammenzubauen in Capsids in der Abwesenheit von AAP Ausdruck und die Fähigkeit des AAP1 bis 12 Montage VP3 Monomere von zu fördern heterologen Serotypen. Diese Studie hat ergeben, dass AAV4, 5 und 11 VP3 Monomere können ohne AAP zusammenstellen. Darüber hinaus ergab, dass acht von zwölf AAP-Serotypen wir untersuchten (d.h.alle außer AAP4, 5, 11 und 12) angezeigt eine breite Fähigkeit, Kapsid Montage der heterologen AAV Serotyp Capsids, während AAP4, 5, 11 und 12 angezeigt unterstützen eine wesentlich begrenzten Möglichkeiten in dieser Hinsicht6. Diese vier Serotypen sind phylogenetisch weit entfernt von den anderen AAP Serotypen2,3. Darüber hinaus hat die Studie erhebliche Heterogenität in subzellulären Lokalisierungen von verschiedenen AAPs6aufgedeckt. Darüber hinaus die Studie hat vorgeschlagen, dass der enge Vereinigung von AAP mit montierten Capsids und Nukleolus, das Markenzeichen der AAV2 Kapsid Versammlung, nicht unbedingt zu anderen Serotypen, einschließlich AAV5, verlängert werden 8 und 9, die Nukleolus Ausschluss von anzeigen montierte Capsids6. Deshalb der Erkenntnissen aus der Studie bestimmten Serotyp AAP nicht breit anwendbar auf alle AAP Biologie. Solch rätselhafte Natur der AAP Biologie unterstreicht die Notwendigkeit, die Rolle und Funktion der einzelnen AAP von kanonischen und nicht-kanonischen AAV-Serotypen zu untersuchen.

Die biologische Rolle von AAP in Kapsid Baugruppe kann beurteilt werden, durch die Bestimmung, dass vollständig verpackt AAV Viruspartikel Titer in menschlichen embryonalen Niere (HEK) 293-Zellen, die am häufigsten verwendeten Zelllinie für AAV Vektor Produktion, mit oder ohne AAP Protein produziert Ausdruck. Die Standardmethoden für AAV Quantifizierung sind quantitative PCR (qPCR)-basierte Assays7,8 und quantitative Dot-Blot-basierte assays9. Andere Methoden zur AAV Viruspartikel Quantifizierung wie Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay10,11 oder optische Dichte Messung12 sind nicht ideal für Proben, die aus vielen verschiedenen AAV-Serotypen abgeleitet oder Proben mit Verunreinigungen (grobe Lysates oder Kultur, Medien), die oft für AAV Forschung verwendeten Proben kontaminiert. QPCR wird derzeit am häufigsten für AAV Quantifizierung verwendet; Allerdings ist es notwendig zu erkennen, mögliche Vorbehalte des qPCR basierende Assays, als der Test Systemfehler und bedeutende Titer Variationen13,14führen können. PCR-basierte Testsysteme betroffen sind eine Reihe von potenziell Störfaktoren, wie das Vorhandensein von kovalent geschlossenen terminal Haarnadeln in PCR-Vorlagen, die Verstärkung13hemmen. Sogar eine erfahrene Person Potenzial einführen kann Störfaktoren in einer qPCR-basierten Test unwissentlich13. Im Gegensatz dazu sind quantitative Dot-Blot Assays eine klassische Molekularbiologie-Technik, die beinhaltet keine Genom Verstärkung und verwendet ein viel einfacheres Prinzip mit einem minimalen Risiko von Fehlern im Vergleich zu qPCR basierende Assays. Die Methode ist weniger technisch anspruchsvoll; die Untersuchungsergebnisse sind daher auch von unerfahrenen Personen einigermaßen reproduzierbar.

In diesem Bericht beschreiben wir die methodischen Details eines quantitativen Dot Blot Assays wir routinemäßig für AAV Vektor Quantifizierung verwenden und geben Sie ein Beispiel von, wie den Test zur Untersuchung der Montage-Förderung der Rolle von AAPs gemeinsam anwenden Serotypen (AAV5 und AAV9) und eine zuvor fußgelenkes AAP von Snake AAV14. In der Natur AAV VP und AAP Proteine werden in der GUS von einem einzigen Gen (d.h., VP-AAP Cis-Ergänzung), während in der hier beschriebenen Test ausgedrückt, VP und AAP Proteine liefern wir in Trans aus zwei separaten Plasmide (d.h., VP-AAP Trans-Ergänzung). Da jede VP oder AAP Protein aus verschiedenen Serotypen von jeder unabhängige Plasmid ausgedrückt werden kann, wird es möglich, Heterologe VP-AAP-Kombinationen für Kapsid Assembly (d.h. VP-AAP Kreuz-Ergänzung) zu testen. Kurz, drückt AAV VP3 aus verschiedenen Serotypen in HEK 293 Zellen von Plasmid DNA Transfektion, ein AAV-Vektor-Genom in das Vorhandensein oder Fehlen des cognate Serotyps AAP oder in Anwesenheit einer heterologen Serotyp AAP zu verpacken. Nach der Produktion unterliegen Nährmedien und Zelle Lysates ein Dot Blot Assay, das virale Genom innerhalb der Kapsid Shell zu quantifizieren. Der erste Schritt des Dot-Blot Assays ist zur Behandlung von Proben mit einer Nuklease kontaminierenden Plasmid-DNA und unverpackten AAV Genome in Proben zu entfernen. Andernfalls würde die Hintergrund-Signale insbesondere erhöhen, wenn ungereinigten Proben analysiert werden. Darauf folgt dann durch eine Protease-Behandlung zu brechen viralen Capsids und Nuklease-resistente viraler Genome in Beispiellösungen freisetzen. Nächste, virale Genome sind denaturiert, getupft auf eine Membran und hybridisiert mit eine virale Genom-spezifische DNA-Sonde für die Quantifizierung. In der Beispiel-Test hier berichtet zeigen wir Ihnen, dass Snake AAV VP3 Schlange AAP Kapsid Montage und Schlange AAP fördert nicht die Montage des AAV9 Capsids im Gegensatz zu vielen der AAPs abgeleitet von AAP-abhängige Serotypen, die auch die Montage von fördern können Heterologe Serotyp Capsids. Zu guter Letzt berichten wir eine wichtige Einschränkung, qPCR oder Dot-Blot-basierte AAV Quantifizierung Tests, dass die Wahl der Nuklease die Untersuchungsergebnisse erheblich beeinträchtigt.

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Protokoll

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Hinweis: Die Rezepte für die Lösungen und Puffer benötigt für dieses Protokoll sind in Tabelle 1zur Verfügung gestellt. Das Protokoll beschrieben ist für die VP-AAP Kreuz-Ergänzung Dot Blot Assay, die Rollen der AAP Proteine in Kapsid Baugruppe zu studieren. Die Methode für allgemeinere quantitative Dot Blot Assays für die gereinigten AAV-Vektor-Titration wird im Abschnitt Vertreter Ergebnisse erklärt.

(1) Bau von VP3, AAP und AAV2 Rep Plasmide zum Ausdruck zu bringen

  1. Bau von pCMV-AAVx-VP3 (x = Serotypen)
    1. PCR-verstärken die gesamte VP3 ORF (1,6 kb) mit einem High-Fidelity-DNA-Polymerase und die folgenden Primerpaar: VP3 vorwärts, CTAA-RE1-CACC-N25 (die ersten 25 Nukleotide des VP3 ORF); VP3 Revers, TCTT-RE2-N25 (die letzten 25 Nukleotide des VP3 ORF).
      Hinweis: RE1 und RE2 sind Standorte für Restriktionsenzyme (REs) zum Klonen. CTAA und TCTT sind das Terminal 5' und 3' Tetranucleotides hinzugefügt, um Beschränkung Enzym Verdauung erleichtern nahe dem Ende der doppelsträngigen DNA. CACC ist eine Konsensussequenz Kozak.
    2. Klonen Sie die RE-digested PCR-Produkte zwischen den entsprechenden RE Seiten von Säugetieren Expressionsvektor, die der menschlichen Zytomegalievirus sofort Anfang (CMV-IE) Enhancer-Promoter für hochrangige Ausdruck verwendet.
      Hinweis: Für Molekulare Klonierung, verdauen Sie 5 µg Rückgrat Plasmid DNA mit einem Restriction enzyme(s) in einer Konzentration von 4 U/µg DNA für 1 h bei einer optimalen Temperatur. Erhöhen Sie für PCR-Fragmente die Einheiten von Enzymen verwendet (z.B., 10 U/µg des 1,6 kb VP3 ORF PCR Produktes) und eine längere Inkubationszeit (z.B., 4 h) durch eine Erhöhung der Anzahl der Anerkennung Beschränkungsenzymsites pro Längeneinheit. An anderer Stelle finden Sie einige hilfreiche Informationen in Molekularbiologie Enzyme und Klonen Verfahren einschließlich bakterielle Umwandlung15,16,17.
  2. Bau von pCMV-FLAG-AAPx (x = Serotypen)
    1. PCR-verstärken die gesamte AAP ORF (0,6 kb) mit Ausnahme der ersten Aminosäure mit einem High-Fidelity-DNA-Polymerase und die folgenden Primerpaar: AAP vorwärts, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 (25 Nukleotide aus der 4. Nukleotid in die AAP-ORF); AAP Revers, TCTT-RE2-N25 (die letzten 25 Nukleotide des AAP ORF).
      Hinweis: GACTACAAGGACGACGATGACAAA codes einen FLAG-Tag, das nachweislich keine schädlichen Auswirkungen4,5 haben aber kann verzichtet werden, wenn nicht notwendig.
    2. Klonen Sie die RE-digested PCR-Produkte die entsprechenden Standorte des Säugetier-Expressionsvektor mit der CMV-IE Enhancer-Promotor15,16,17.
  3. Bau des pHLP-Rep
    1. Digest 5 µg des Plasmids pAAV-RC2 (7,3 kb) mit 20 Einheiten der Xho I und Xcm ich, und reinigen die DNA mit einem kommerziellen DNA-Reinigung-Kit oder durch Phenol-Chloroform Extraktion.
      Hinweis: Entfernung von 1,8 kb Xho ich-Xcm, die ich aus den 7,3 kb pAAV-RC2 Plasmid Ergebnissen zu einem Verlust der Kapsid VP Proteinexpression unter Beibehaltung der Rep Proteinexpression fragmentieren.
    2. Stumpfen die DNA endet mit 6 Einheiten des T4-DNA-Polymerase, Agarose-Gel zu reinigen das 5,5 kb-DNA-Fragment und selbst verbinden das gereinigte Fragment mit 50 bis 100 ng DNA und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase laut Hersteller Empfehlung15.
    3. Folgen Sie dem standard bakterielle Umwandlung Verfahren in Schritt 1.1.2 verwiesen Anmerkung.
  4. Überprüfen Sie, ob das Plasmid durch Beschränkung Enzym Verdauung und Sequenzierung15,18konstruiert.
  5. Durchführen Sie Plasmid Minipreps oder Maxipreps mit im Handel erhältlichen Kits zu einer ausreichenden Menge an Plasmid DNA für die nachgelagerten AAV Produktion Experimente.

2. Herstellung von AAV in HEK 293 Zellen von Plasmid DNA Transfektion (Cross-Ergänzung Assay)

  1. HEK 293 Kulturzellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM)-hohe Glukose (4,5 g/L) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin und Streptomycin-Mix und 1 mM L-Glutamin in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % Kohlendioxid (CO2).
    Hinweis: AAV-Titer variieren erheblich je nach Quelle der HEK-293-Zellen.
    Achtung: Obwohl bei AAV behandelt werden kann Biosafety level 1 (BSL1) Containment, BSL2 Containment empfiehlt sich für HEK 293 Zelle arbeiten.
  2. Am Tag-1 (24 h vor Transfektion)Platte 6 – 7 x 105 HEK 293 Zellen/Brunnen in 2 mL des Mediums komplette im Schritt 2.1 in einem 6-Well Chicoréeblätter beschrieben. Dadurch wird in der Regel ca. 90 % Konfluenz am nächsten Tag.
  3. Tag 0: Transfektion
    1. Vorbereitung zur DNA-Transfektion
      1. Stellen Sie sicher, dass Zellen ca. 90 % Konfluenz erreicht haben.
      2. Wärmen Sie sich DMEM ergänzt mit 1 % Penicillin und Streptomycin-Mix und 1 mM L-Glutamin aber ohne 10 % FBS (d.h.serumfreien Medium) in einem 37 ° C-Wasserbad.
      3. Lassen Sie die Polyethylenimine (PEI) Lösung auf Zimmertemperatur kommen.
    2. Vorbereitung der Plasmid-DNA-Gemisch
      1. Mischen Sie die Plasmiden in 96 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne CaCl2 oder MgCl2 in sterilen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, wie in Tabelle 2angegeben. Der Gesamtbetrag der DNA ist 2 µg/Brunnen.
        Hinweis: Die Mengen für Plasmid DNA-Lösung können ignoriert werden, wenn sie geringer sind. Lautstärkeeinstellung wird empfohlen, wenn das Gesamtvolumen der Plasmid-DNA-Lösungen ≥10 µL ist.
    3. PEI Transfektion
      1. Die PBS-Plasmid DNA-Mischung (wie oben beschrieben vorbereitet) fügen Sie 4 µL PEI-Lösung (1 mg/mL hinzu). Der letzte Band ist ca. 100 µL (5 % Volumen des Kulturmediums). Wirbel die Rohre kurz und die DNA: PEI Mischung für 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      2. Während des Wartens auf die 15 min Inkubation in Anspruch, ersetzen Sie das Kulturmedium mit vorgewärmte serumfreien Medium im Schritt 2.3.1.2 beschrieben.
      3. Einmal die 15-min Inkubation der DNA: PEI Mischung ist abgeschlossen, kurz Drehen der Rohre mit einem Microcentrifuge, die Flüssigkeit auf den Boden der Rohre zu sammeln und die DNA: PEI Mischung tropfenweise hinzufügen das Kulturmedium in jede Vertiefung der HEK-293-Kultur-Platte. Sanft schütteln Sie die Platten und wieder in einen Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2.
      4. Pflegen Sie die Zellen in diesem Transfektion Medium bis zur Ernte am Tag 5 (keine mittlere Änderung ist erforderlich).
  4. Am Tag1 und Tag2beobachten Sie, dass transfizierten Zellen mit pCMV-GFP Plasmid unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop Transfektion Effizienz bewerten.
    Hinweis: für die Fluoreszenz-Mikroskopie, hier ein 10 X / 0,25 numerische Apertur-Ziel in Kombination mit einer 10 × Okular verwendet wurde, und 450-490 nm Anregung Bandpassfilter und 515 – 565 nm Emission Bandpassfilter eingesetzt wurden. Die obige Bedingung ergibt normalerweise mehr als 70 % Transfektion Effizienz. Zellen können einige morphologischen Veränderungen (z. B. Zellen sind schlank geworden) aufgrund der Serum-freie Zustand aufweisen.
  5. Auf 3 – 5 Tageweiterhin die transfizierten Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2Kultur.
  6. Am Tag 5sammeln Sie Zellen und Virus-haltigen Medium in 15 mL konische Polypropylenröhrchen pipettieren rauf und runter oder durch kratzen mit einem Schaber Zelle.
  7. Speichern Sie die Proben bei-80 ° C bis zur Verwendung.

(3) Dot-Blot Assay für AAV Quantifizierung

  1. Wiederherstellung der Viruspartikel
    1. Tauen Sie schnell die gefrorenen Rohre in einem 37 ° C-Wasserbad. Wirbel der Rohre kräftig für 1 min um die Rückgewinnung von AAV aus Zellen zu maximieren.
    2. Pellet-die zellenrückstand durch Zentrifugieren bei 3.700 x g bei 4 ° C für 10 Minuten. 200 µL des Überstands von jedes Rohr nehmen und in einen beschrifteten Microcentrifuge Schlauch mit einem Schraubverschluss für Dot-Blot Assay übertragen werden.
      Hinweis: Aliquot der restlichen überstand in Microcentrifuge Rohre und gefroren bei-80 ° C für eine spätere Verwendung aufbewahren. Hier Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen befestigt mit Schraubverschlüssen und ein o-Ring verwendet wurden. Enge Abdichtung ist erforderlich, um das Austreten von AAV und Phenol-Chloroform zu verhindern.
  2. Behandlung mit Serratia Marcescens Endonuklease
    1. Bereiten Sie Mix A und Mix B Reagenzien (Tabelle 3). Fügen Sie 10 µL Mix a und 10 µL Mix B in jedes Rohr. Wirbel der Rohre für 5 s, kurz Drehen der Rohre, um die Flüssigkeit auf den Boden der Rohre zu sammeln und inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C mindestens 1 h.
      Hinweis: Gemisch A enthält NaOH und pH-Wert für die Behandlung mit S. Marcescens Endonuklease optimiert. Mix-B ergänzt Magnesium. Konzentration von S. Marcescens Endonuklease in handelsüblichen Enzym Aktien variieren. Das Volumen der S. Marcescens Endonuklease muss entsprechend angepasst werden, um 200 U/mL zu machen, nach dem Hinzufügen von Mix A und Mix-B in Röhren im Schritt 3.2.1.
      Hinweis: Eine längere Inkubationszeit kann bis zu 4 h, Hintergrund Signale verringern.
    2. Am Ende der Inkubation kurz Drehen der Rohre mit einer Benchtop-Zentrifuge, Kondensation und Lösung von oben und seitlich der Rohre zu sammeln.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Proben können auf-20 ° C oder-80 ° c eingefroren gelagert werden
  3. Proteinase K Behandlung
    1. Bereiten Sie das Mix C-Reagenz (Tabelle 3). Fügen Sie 180 µL Mix C in jedem Rohr. Wirbel der Rohre für 5 s, kurz Drehen der Rohre und inkubieren Sie die Rohre bei 55 ° C für 1 h.
      Hinweis: Die EDTA in den Mix C-Reagenz bilden freie Magnesium-Ionen und inaktiviert S. Marcescens Endonuklease.
    2. Am Ende der Inkubation lassen Sie Proben auf Zimmertemperatur kommen, und kurz drehen Sie der Rohre mit einer Benchtop-Zentrifuge, Kondensation und Lösung von oben und seitlich der Rohre zu sammeln.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Proben können auf-20 ° C oder-80 ° c eingefroren gelagert werden Um das Protokoll fortzusetzen, brüten Sie die Rohre bei 55 ° C für 5 bis 10 min, SDS-Kristalle enthalten im Puffer vollständig aufzulösen.
  4. Phenol-Chloroform Extraktion und Ethanol Niederschlag
    1. Fügen Sie 200 µL Phenol-Chloroform zu den Proben und Wirbel, die sie für 1 min. Drehen Sie die Proben in einem Microcentrifuge bei ≥16, 100 X g ≥5 min bei Raumtemperatur.
      Achtung: Phenol-Chloroform sollten in einem chemischen Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA; behandelt werden d. h., Nitril-Handschuhe, Schutzbrille oder Gesichtsschutz und Laborkittel mit langen Ärmeln).
    2. 320 µL der wässrigen Schicht (160 µL zweimal mit einer Pipette P200) auf einen neuen standard Microcentrifuge Schlauch (80 % der wässrigen Flüssigkeitsvolumen) übertragen.
      Hinweis: Es ist von entscheidender Bedeutung, die gleiche Menge an wässriger Lösung zwischen den Proben zu nehmen, sonst verliert der Assay quantitative Genauigkeit.
    3. Bereiten Sie das Mix D Reagenz (Tabelle 3). 833 µL Mix D in jedes Rohr hinzufügen. Wirbel der Rohre für 5 s, und die Rohre bei-80 ° C ≥20 min inkubieren.
      Hinweis: D-Mix ist eine Mischung aus Ethanol, Natriumacetat und Glykogen für bequeme Ethanol Fällung von DNA. Proben können bei-80 ° C bei diesem Schritt gespeichert werden und das Protokoll kann später wieder aufgenommen werden.
    4. Zentrifuge Proben mit einem Microcentrifuge bei ≥16, 100 X g bei 4 ° C für ≥15 min. überstand abgießen und einmal auf einem sauberen Papiertuch tupfen. Ca. 500 µL 70 % Ethanol in jedem Röhrchen genommen Wirbel der Schläuche für 5 s und Zentrifuge die Rohre mit einem Benchtop Microcentrifuge bei ≥16, 100 X g bei 4 ° C für ≥5 min.
    5. Der Überstand abgießen und einmal auf einem sauberen Papiertuch tupfen. Trockene Pellets bei 65 ° C; Pellets können vollständig getrocknet werden.
      Hinweis: Verwenden Sie eine Pipette nicht überschüssige Ethanol zu entfernen, die bleibt nach Beflecken der Rohre. Pellets können auch über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet werden. Das Protokoll kann hier angehalten und getrockneten DNA-Pellets können bei Raumtemperatur für mehrere Tage mit geschlossenem Rohr Deckel gelagert werden.
  5. Wiederfreisetzung der viralen DNA in TE-Puffer
    1. Lösen Sie die DNA-Pellets in 120 µL TE-Puffer durch Schütteln jedem Röhrchen für 30 min bis 1 h bei Raumtemperatur.
  6. Dot-blot
    1. Erarbeitung von Plasmid DNA-Normen
      1. Verdünnen Sie AAV Vektor Genom Plasmid DNA zu 10 ng/µL in Wasser oder Tris-HCl-Puffer (10 mM, pH 8,0). Nehmen Sie 25 µL dieser Verdünnung und Digest mit einer entsprechenden Restriktionsenzym für 1 h nach dem Plasmid DNA, in einem Reaktionsvolumen von 50 µL zu linearisieren.
        Hinweis: Wir machen einen doppelten Satz von Verdauung (siehe Schritt 3.6.4.1). Das entsprechende Enzym sollte eine sein, die die Plasmid-DNA außerhalb der Dot-Blot Sonde-Bindung Region schneidet. Der Einfachheit halber kann die verdünnte Plasmid-DNA regelmäñig (25 µL/Rohr) und gespeichert bei-20 ° C für eine spätere Verwendung eingefroren. Das Plasmid DNA zu verdauen, während die Rohre im Schritt 3.5.1 schütteln werden. Das Plasmid DNA standard nicht zu verdauen.
      2. Die Röhrchen mit den verdauten Plasmid DNA standard 450 µL Wasser oder TE hinzufügen und gut mischen. Übertragen Sie 70 µL dieser Mischung zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 1.330 µL Wasser oder TE, eine verdünnte Plasmid standard (25 Pg/µL) zu machen.
      3. Folgen Sie Tabelle 4 um eine Reihe von zweifache Verdünnungsreihen (600 µL/Rohr) zu erstellen. Die Verdünnungen mischen durch Vortexen für 5 s.
    2. Denaturierung der Standards und virale DNA-Proben
      1. Jeder standard Verdünnung 600 µL 2 x alkalische Lösung hinzufügen. Mischen Sie gut durch Vortexen für 5 bis 10 S. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
      2. Jede virale DNA-Probe 120 µL 2 x alkalische Lösung hinzufügen. Mischen Sie gut durch Vortexen für 5 bis 10 S. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
    3. Das Dot-Blot Gerät einrichten
      1. Mit Schere, Schnitt eine Membran blotting (z.B. Zeta-Sonde) auf eine geeignete Größe für die Anzahl der Proben und Standards. Genießen Sie die Membran mit Wasser für 10 min vor dem Inverkehrbringen ein Dot-Blot-Apparat. Ungenutzte Brunnen auf der Membran Apparat zu decken.
        Hinweis: Behandeln Sie die Membran mit einer sauberen Pinzette. Um leere Brunnen zu decken, kann die leichte blaue Schutzfolie, die mit der Membran kommt verwendet werden. Lassen Sie sich nicht die Membran zum Trocknen vor dem verbindlichen Muster und Normen. Weitere Informationen über die Montage und Nutzung des Geräts finden Sie in der Benutzer manuell19.
      2. Fügen Sie Wasser in die Vertiefungen, die Samples geladen werden. Gelten Sie Vakuum und ziehen Wasser durch die Brunnen auf Fehler zu überprüfen und erneut testen, wenn feste. Festziehen Sie Schrauben wieder beim Einsatz von Vakuum zu enge Abdichtung zu gewährleisten.
        Hinweis: Unvollständige Abdichtung kann Probe zwischen den Wells austreten.
      3. Sobald Wasser komplett durchgezogen, lassen Sie das Vakuum vollständig (d. h., das Vakuum mannigfaltige sollte offen für Luftdruck).
    4. Laden von Standards und Proben auf den Dot-Blot-Apparat
      1. Gelten Sie 400 µL jeder verdünnte Plasmid DNA standard für jedes gut, und führen Sie vier Fahrspuren der standard Verdünnungen. Verwenden Sie zwei separate Aliquote des standard Digest und laden Sie jeweils in zweifacher Ausfertigung. 200 µL/Well jeder virale DNA-Probe anwenden.
        Hinweis: Wenn Sie die restlichen ~ 40 µL denaturierten Proben, verdünnte Proben (z.B.10-divisibel verdünnten Proben mit 20 µL Probe plus 180 µL 1 x Lauge) vorbereitet und ausgelöscht, wenn nötig.
      2. Wenden Sie sanfte Vakuum ziehen die DNA-Lösungen durch den Brunnen an.
        Hinweis: Vakuum Druck muss angepasst werden, durch teilweise ein drei-Wege-Ventil öffnen, so dass der Unterdruck auf den Punkt angewendet wird blot Apparate sowie die Atmosphäre (d. h.mit den Absperrhahn Armen positioniert ein ca. 45° Winkel wo es macht ein lauter Saug Geräusch).
      3. Sobald alle Brunnen geleert haben, lassen Sie das Vakuum durch Anpassen der drei-Wege-Ventil. Fügen Sie 400 µL 1 x alkalische Lösung in jede Vertiefung, die Standards und Proben enthalten. Warten Sie 5 min vor der Anwendung wieder Vakuum um den Brunnen zu leeren.
      4. Wenden Sie erneut das Vakuum in der gleichen Weise (siehe Schritt 3.6.4.2).
      5. Dot-Blot-Apparat unter Vakuum zu zerlegen, die Membran zu entfernen und spülen Sie ihn mit 2 X SSC. Legen Sie die Membran auf einem sauberen Papiertuch mit der DNA-gebundene Seite nach oben entfernen überschüssige 2 X SSC.
      6. UV-Crosslink getupft DNA auf der Membran mit einem entsprechenden UV-Vernetzer; die Membran ist jetzt bereit für die Hybridisierung.
        Hinweis: Für UV-Vernetzung können nasse Membranen verwendet werden. Die getrocknet, UV-vernetzte Membranen können bei Raumtemperatur gelagert werden. Weitere Informationen finden in der Tabelle der Materialien.
  7. Hybridisierung und waschen
    1. Die Hybridisierung-Puffer in einem 65 ° C Wasserbad erwärmen.
    2. Enzymatisch beschriften einer DNA-Sonde mit radioaktiven α -32P dCTP und reinige es mit handelsüblichen Kits nach Empfehlung des Herstellers.
      Hinweis: Wir verwenden eine Sonde von 0,5-2,0 kb in der Länge von einem Enhancer-Promotor-Region oder einer Protein-kodierenden Sequenz in das virale Genom. Obwohl dieses Protokoll 32P-markierten radioaktiven Sonden für Signalerkennung nutzt, nicht radioaktiv Chemolumineszenz oder fluoreszierende Sonden können auch verwendet werden (siehe Abschnitt Diskussion ).
    3. Legen Sie die Membran in einer Hybridisierung-Flasche mit der DNA-gebundene Seite nach oben, Spülen der Membran mit 5 mL vorgewärmt Hybridisierung Puffer und den Puffer zu verwerfen. Dann fügen Sie 10 mL vorgewärmte Hybridisierung Puffer und stellen Sie die Flasche in einem rotierenden Hybridisierung Ofen bei 65 ° C. Für ≥5 min drehen.
    4. Denaturieren Sie Hitze-20 µL 10 mg/mL geschert Hering oder Lachs Spermien-DNA-Lösung und die 32P-markierten Sonde (≥107 cpm) für 5 min, indem die Rohre auf einen Block Heatset bei 100 ° C. Dann Snap-Chill sie auf Eis für ≥2 min, kurz, Spin und halten Sie auf dem Eis bis zur Verwendung.
      Achtung: Für radioaktive DNA-Sonden müssen 1,5 mL Röhrchen mit Schraubverschluss und o-Ring verwendet werden.
    5. Fügen Sie schnell die denaturierten Spermien-DNA und radioaktiven Sonde auf die Hybridisierung-Puffer in der Hybridisierung Flasche und schütteln Sie die Flasche für 10 s zu mischen. 65 ° C Ofen die Flasche wieder und inkubieren Sie die Flasche mit Rotation bei 65 ° C ≥4 h.
    6. Sobald Hybridation abgeschlossen ist, stoppen Sie die Rotation, herausnehmen Sie die Hybridisierung Flasche und Gießen Sie dann die radioaktiven Sonde Lösung in ein 50 mL konische Röhrchen mit einer auslaufsicheren Stecker Dichtungskappe. Speichern Sie die Sonde in einen geeigneten Behälter, platziert in einem Kühlschrank für radioaktive Stoffe bezeichnet.
      Hinweis: Gebrauchte Hybridisierung Puffer mit einer Sonde, die bei 4 ° C gelagert wird kann mindestens 5 Mal wiederverwendet werden indem man die 50 mL konische Rohr mit einer auslaufsicheren Stecker Dichtungskappe, die Hybridisierung Puffer im Wasserbad 100 ° C für 5 min enthält.
    7. Waschen Sie die Membran mit waschen Puffer auf 65 ° c erhitzt Die Hybridisierung Flasche 20 bis 30 mL Waschpuffer hinzufügen und für 5 min. wiederholen dies Waschen 2 weitere Male drehen.
      Hinweis: Messen Sie Radioaktivität Waschlösungen und zeichnen Sie es ggf. vom örtlichen Institut.
    8. Legen Sie beim Waschen der Membran eine imaging-Bildschirm auf ein Bild-Radiergummi für 5 min Phosphor.
    9. Entfernen Sie nach der dritten Wäsche die Membran aus der Hybridisierung Flasche zu, entfernen Sie überschüssigen Puffer auf der Membran mit Papiertüchern und legen Sie die Membran in einem durchsichtigen Kunststoff Papierhalter. Überprüfen Sie die radioaktiven Signale auf der Membran mit einem Geigerzähler. Setzen Sie die gelöschten Phosphor bildgebenden Bildschirm an die Membran für 10 min, je nach der Intensität des Signals zu übernachten.
    10. Scannen Sie den Bildschirm mit einem Phosphor-Bild Scan-System und erhalten Sie die Daten auf Signalintensität jedes Punktes zu.
  8. Datenanalyse
    1. Zeichnen Sie eine Standardkurve mit Tabelle und Daten-Analyse-Software (z.B.Excel).
      Hinweis: Log-Log-linearer Regression wurde verwendet, um eine standard Kurve zeichnen.
    2. Nanogramm-Äquivalent (ng-Eq) für jede der viralen DNA-Proben durch Interpolation zu bestimmen. Der ng-Eq ist die Menge an das Plasmid DNA verwendet, um eine Standardkurve zu zeichnen, die die Anzahl der viralen DNA-Moleküle entspricht. Wenn die Länge der das Plasmid DNA ist 8.000 bp, 1 ng-Eq einsträngige AAV virale DNA entspricht 2.275 x 108 Partikel.
      Hinweis: Die ng-Eq kann die Zahl der Viruspartikel durch die folgenden Gleichungen konvertiert werden:
      Gleichung zur Berechnung einzelsträngiger AAV-Partikel; DNA-Quantifizierung; Molekulargenetische Formel.
      Gleichung zur Berechnung doppelsträngiger AAV-Partikel unter Verwendung der Plasmidlänge; wissenschaftliche Formel.
      Die Anzahl der AAV Partikel werden herkömmlich als "Vg" (Vektor Genome) oder "DRP" (DNase ich beständig Teilchen) ausgedrückt.
    3. Berechnen Sie die AAV-Konzentrationen der Ausgangsstoffe. Weil die gepunkteten virale DNA 66,7 % stellt Prozentuale Berechnungsformel: (320/400 × 200/240 × 100%) für die Datenanalyse. die virale DNA in den Ausgangsstoffen, 1 ng-Eq entspricht 1,7 x 109 Partikel/mL Mathematische Gleichung Berechnung Formel, Verhältnis Division Multiplikation Wissenschaftliche Notation .
      Hinweis: Diese Korrektur ist nicht erforderlich, wenn die virale DNA in das Ausgangsmaterial enthaltenen auf eine Membran ohne Verlust ausgelöscht wird (siehe Abbildung 1).

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein repräsentatives Ergebnis der quantitativen Dot Flecken für die Quantifizierung der gereinigten AAV Vektor Bestände in großem Maßstab produziert ist in Abbildung 1dargestellt. Mit dieser Dot-Blot Assay war der Titer einer doppelsträngigen AAV2G9-CMV-GFP Vektor Aktie ermittelt. Der Vektor wurde durch zwei Runden der Cäsiumchlorid (CsCl) gereinigt-Dichtegradienten Ultrazentrifugation durch Dialyse als zuvor beschriebenen20gefolgt. In ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Bericht wird die Nützlichkeit des quantitativen Dot-Blot Assays AAV AAPs und ihre Rolle im Kapsid Montage studieren beschrieben. Erkenntnisse aus diesen Studien bieten detaillierte Einblicke in die angeborenen Unterschiede in den Prozess der AAV Kapsid Montage und die funktionale Rolle der AAPs zwischen verschiedenen Serotypen. In dieser Hinsicht der AAV VP3-AAP Kreuz-Ergänzung Dot blot Test ergab, dass die Schlange AAV VP3 eine strenge Abhängigkeit auf die Co Expression von seinen Verwandten AAP Kapsid Montage...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken für die Bereitstellung von uns mit dem pEMBL-CMV-GFP-Plasmid Xiao Xiao an der University of North Carolina in Chapel Hill. Wir danken Christopher Cheng und Samuel J. Huang für kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt von Public Health Service (NIH R01 NS088399 und T32 EY232113) gewährt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BenzonaseMilliporeSigma1016970001Haupttext als Serratia marcescen endonuclease bezeichnet.
DNase IRoche4716728001im Haupttext als DNase I Enzym A bezeichnet.
DNase IInvitrogen18047019im Haupttext als DNase I Enzym B bezeichnet.
DNase INew England BiolabsM0303Lwird im Haupttext als DNase I Enzym C bezeichnet.
1,5 mL Attached O-Ring Screw Cap MikrozentrifugenröhrchenCorning430909
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenThermo Fisher Scientific05-408-129
15 mL Konisches Polypropylen-RöhrchenCorning352097
3 M NatriumacetatTeknovaS0298
50 mL Konisches Polypropylen-RöhrchenCorning430291
AAV-293-ZellenAgilent240073HEK-293-Zelllinie, die für die Verpackung von AAV-Virionen optimiert ist.
AccuGENE 0,5 M EDTA-LösungLonza51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8,0Lonza51238
AccuGENE 10% SDSLonza51213
AccuGENE 1X TE BufferLonza51235
Bio-Dot-GerätBio-Rad1706545
RinderserumalbuminMilliporeSigmaA3294
Cell LifterCorning3008
ChloroformMilliporeSigma372978
DNA Extractor KitWako Pure Chemical Industries295-50201Dies wird für quantitative Dot-Blots auf gereinigten Viren verwendet. Wir verwenden nur ein halbes Volumen aller Reagenzien in jedem Schritt, der für das Protokollschema 2 in dem vom Hersteller bereitgestellten Handbuch empfohlen wird.
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)-hoher Glukosegehalt (4,5 g/L)Lonza12-614F
ElectroMAX DH10B ZellenThermo Fisher Scientific18290015
Ethanol 200 ProofDecon Labs2716
Fötales RinderserumVWR1500-500
Ficoll 400Alfa AesarB22095bezeichnet als Polysaccharose 400.
FluoreszenzmikroskopZeissAxiovert 40 CFL
GlykogenRoche10901393001
Hering Spermien DNAInvitrogen15634-017
HybridisierungsröhrchenThermo Fisher Scientific13-247-150
ImageQuant TLGE Healthcare Life SciencesImageQuant TL
L-Glutamin 200 mMLonza17-605E
Magnesiumchlorid HexahydratMilliporeSigmaM0250
MicroPulser ElektroporatorBio-Rad1652100
Mini Quick Spin DNA-SäulenMilliporeSigma11814419001
pAAV-RC2 VektorCell Biolabs IncVPK-422
Penicillin/Streptomycin 10K/10KLonza17-602E
Phosphatgepufferte KochsalzlösungLonza17-516F
Phosphorimaging-BelichtungskassetteGE Gesundheitswesen Life SciencesVerschiedene
Phosphorimaging-BildschirmeGE Gesundheitswesen BiowissenschaftenVerschiedene
Plasmid-Maxi-KitQIAGEN12162
Platinum Pfx DNA-PolymeraseInvitrogen
PolyethyleniminPolysciences Inc23966-2
PolyvinylpyrrolidonMilliporeSigmaP5288
Prime-It II Random Primer Labeling KitAgilent Technologies300385
Primer AAP Forward (N25 Nukleotide aus dem 4. Nukleotid im AAP ORF, RE1 ist eine Restriktionsenzymstelle für die Klonierung): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA
CGACGATGACAAA-N25		MilliporeSigmaCustom Primer
Primer AAP Reverse (N25 sind die letzten 25 Nukleotide des AAP ORF, RE2 ist eine Restriktionsenzymstelle für die Klonierung): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Primer VP3 Forward (N25 die ersten 25 Nukleotide des VP3 ORF, RE1 ist eine Restriktionsenzymstelle für die Klonierung): CTAA-RE1-CACC-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 sind die letzten 25 Nukleotide des AAP ORF, RE2 ist eine Restriktionsenzymstelle für die Klonierung): TCTT-RE2-N25MilliporeSigmaCustom Primer
Proteinase K SolutionInvitrogen25530-049
RestriktionsenzymeNew England BiolabsVerschiedene
Lachsspermien DNAInvitrogen15632011
serologische PipettenThermo Fisher Scientific13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
NatriumchloridThermo Fisher ScientificS271-10
Natriumcitrat Tribasisches DihydratMilliporeSigmaC8532
T4 DNA-PolymeraseNew England BiolabsM0203L
ThermocyclerEppendorf6321000515
Gewebekultur Behandelt 6-Well-Platten-Corning
Tris BaseThermo Fisher ScientificBP152-5
Typhoon FLA 7000GE Healthcare Life Sciences28955809
UltraPure Buffer-Saturated PhenolInvitrogen15513-047
UV CrosslinkerSpectrolineXLE-1000Es wird der optimale Vernetzungsmodus verwendet, der eine UV-Energiedosis von 120 mJ/cm2.
Zeta-SondenmembranBio-Rad162-0165
im 11708013353046

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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