Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die Kombination von ganzen Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen und zwei-Photon imaging um Ca2 + Transienten im neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten zu erfassen.
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Methodenartikel
Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Kalzium (Ca2 +) Bildgebung ist ein mächtiges Werkzeug um die räumlich-zeitliche Dynamik der intrazellulären Ca2 + Signale in neuronalen Dendriten zu untersuchen. Ca2 + Schwankungen können durch eine Vielzahl von Membran und intrazellulären Mechanismen auftreten und spielen eine entscheidende Rolle bei der Induktion der synaptischen Plastizität und Regulierung von dendritischen Erregbarkeit. Daher ist die Möglichkeit, verschiedene Arten von Ca2 + Signale in dendritischen Filialen aufnehmen wertvoll für Gruppen studieren wie Dendriten Informationen zu integrieren. Das Aufkommen der zwei-Photonen-Mikroskopie hat solche Studien erheblich erleichtert durch die Bildgebung in lebender Gewebe, wie Lichtstreuung und lichtbedingten inhärenten Probleme zu lösen. Darüber hinaus durch Kombination von konventionellen elektrophysiologische Techniken mit zwei-Photon Ca2 + imaging, ist es möglich zu untersuchen, lokale Ca2 + Schwankungen in neuronalen Dendriten parallel mit Aufnahmen der synaptischen Aktivität in Soma. Hier beschreiben wir wie Sie diese Methode verwenden, um die Dynamik der lokalen Ca2 + Transienten (Katzen) studieren in Dendriten der GABAergen inhibitorischen Interneuronen. Die Methode kann auch angewendet werden, zum Studium dendritischen Ca2 + -Signalisierung in verschiedenen neuronalen in akuten Hirnschnitten.
Einleitung
Der Beitrag eines Neurons, Netzwerk-Aktivität richtet sich weitgehend nach der dynamischen Natur der synaptischen Eingänge, die er empfängt. Traditionell, stützte sich die vorherrschende Methode der Charakterisierung synaptische Aktivität in Nervenzellen auf somatische ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen von postsynaptischen Ströme, hervorgerufen durch elektrische Stimulation von Axonen der Passage. Einzige Aktivität der proximal befindet sich Synapsen wird jedoch in diesem Fall1wahrheitsgemäß gemeldet. Darüber hinaus wurden um die Synapse-spezifische Mechanismen zu beurteilen, Aufnahmen von Paaren von Neuronen und von Dendriten an einem bestimmt....
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Protokoll
Alle Versuche wurden gemäß den Richtlinien des Tierschutzes Tier-Schutz-Ausschuss des Université Laval und des Canadian Council on Animal Care durchgeführt.
1. Vorbereitung (Optional: bereiten Sie 1 Tag im Voraus)
- Bereiten Sie drei Arten von künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS) Lösung (Normal, Saccharose und Recovery-Lösungen, 1 L; siehe Tabelle 1). Anpassen die Osmolalität der Lösungen für 300 ± 10 mOsm25 und kühlen der ACFS Saccharose bis zu einem in der Nähe des Gefrierpunktes (0-4 ° C).
Hinweis: Die Verwendung von eine natriumarme Schneidelösung (ACFS-Saccharose) hilft die Leben....
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Ergebnisse
Mit den hier vorgestellten Protokoll, erhielten wir Katzen hervorgerufen durch somatische Stromeinspeisung und die elektrische Stimulation in Dendriten von Oriens/Alveus Interneuronen im Bereich CA1 des Hippocampus. Nach Patchen eines Neurons, identifiziert auf ihre Form und Position basierend, Wir erwarben Linescans über einem proximalen Dendriten an mehreren Punkten bei Entfernungen von Soma (Abbildung 1A) gegeben. Wir beobachteten eine Abnahme der Amplitud.......
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Diskussion
Die hier gezeigte Methode veranschaulicht, wie die Kombination der zwei-Photonen-Ca2 + Bildgebung und Patch-Clamp Elektrophysiologie verwendet werden kann, für das Studium dendritischen Ca2 + Signalisierung in neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten. Diese Methode ermöglicht eine Überwachung der beiden lokalen Ca2 + Erhebungen hervorgerufen durch elektrische Stimulation oder Backpropagating AP in dendritischen Segmenten und somatische Reaktion der Zelle. Dies macht es ein ausgezeichn.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt finanzielle oder sonstige Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Canadian Institutes of Health Research, Natur- und ingenieurwissenschaftlichen Forschung Rat (NSERC Discovery Grant) und der Savoy-Stiftung unterstützt. OC wurde durch ein Ph.d.-Stipendium von NSERC unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Tierischer Stamm: Maus CD1 | Charles River | 022 | |
| Isofluran | AbbVie Corporation | 0B506-099 | |
| CGP 55845 Hydrochlorid | Abcam ab120337 | ||
| Calciumchlorid | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| D-(+)-Glukose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesiumchlorid | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesiumsulfat-Heptahydrat | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Paraformaldehyd-Pulver, 95% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Kaliumchlorid | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Kaliumgluconat | Sigma-Aldrich | P1847 | |
| Natriumazid | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Natriumbicarbonat | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Saccharose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trizma Sockel | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trizma Hydrochlorid | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Natriumphosphat zweibasisches Dihydrat | Sigma-Aldrich | 71643< | |
| br/> Monohydrat Natriumphosphat | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazid | ThermoFisher | Scientific A10438 | |
| SR95531 (Gabazin) | Abcam | ab120042 | |
Adenosintriphosphat (ATP)-Tris | Sigma-Aldrich | A9062 | |
Guanosin (GTP)-Na+ | Sigma-Aldrich | G8877 | |
Oregon Green BAPTA-1 | ThermoFisher Scientific | O6812 | |
Phosphokreatin di(tris)-Salz | Sigma-Aldrich | P1937 | |
Streptavidin-konjugiertes Alexa-546 | ThermoFisher Scientific | S11225 | |
Pflaster Borosilikatglas Kapillaren | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Theta Borosilikatglas Kapillaren | Sutter Instrument | BT-150-10 | |
P-97 Flammender/Brauner Mikropipettenabzieher | Sutter Instrument | ||
TCS SP5 Konfokales Multiphotonenmikroskop | Leica Microsystems | ||
Chameleon Ultra II Ti:Saphir Multiphotonenlaser | Coherent | ||
| LAS AF Imaging Acquisition Software | Leica Microsystems | ||
Temperaturregler TC-324B | Warner Instruments | ||
MultiClamp 700B Verstärker | Molecular Devices | ||
Digidata 1440A Digitizer | Molecular Devices | ||
konfokal Übersetzer | Siskiyou | ||
Mikromanipulator | Siskiyou | ||
pClamp Datenerfassungssoftware | Molecular Devices | ||
A365 Konstantstrom-Stimulus-Isolator | World Precision Instruments | ||
Vibraplane Optischer Tisch | Kinetische Systeme |
Referenzen
- Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997). ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
