Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode

Summary

Kapillare isoelektrischen Fokussierung ist eine Antikörper-basierten, empfindsamen, hoher Durchsatz-Technik, ermöglicht detaillierte Charakterisierung von Proteinen und deren Isoformen von extrem kleinen biologischen Proben. Im folgenden beschreibt ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von spezifischen Proteinen und deren Isoformen robotisierte und automatisierte.

Abstract

Immunoblotting ist eine routinemäßige Technik in vielen Laboratorien zur Charakterisierung von Protein aus biologischen Proben geworden. Das folgende Protokoll bietet eine alternative Strategie, Kapillare isoelektrischen Fokussierung (cIEF), mit vielen Vorteilen im Vergleich zu herkömmlichen Immunoblotting. Dies ist ein Antikörper-basierte, automatisierte, schnelle und quantitative Methode, in der eine vollständige westlichen befleckenden Verfahren innerhalb einer ultradünnen Kapillare stattfindet. Diese Technik erfordert eine Gel auf eine Membran, Abisolieren von Flecken, übertragen und x-ray-Filme, die in der Regel für konventionelle Immunoblotting erforderlich sind. Hier werden Proteine getrennt nach ihrer Ladung (isoelektrischen Punkt, pI), Verwendung von weniger als einem Mikroliter (400 nL) des gesamten Proteins lysate. Nach Elektrophorese, sind Proteine auf die Kapillarwände durch UV-Licht-Behandlung, gefolgt von primären und sekundären (Meerrettich Peroxidase (HRP) konjugiert) immobilisierten Antikörper Inkubationszeit, dessen Bindung durch erkannt wird verbessert Chemilumineszenz (ECL), erzeugen ein Lichtsignal, die gefangen genommen und von einer – Coupled Ladegerät (CCD) Kamera aufgenommen werden kann. Das Digitalbild können analysiert und quantifiziert (Peakfläche) mit Software. Dieses Hochdurchsatz-Verfahren kann 96 Proben gleichzeitig bearbeiten; ist hochempfindlich, mit Proteindetektion im Bereich von Picogram; und produziert hoch reproduzierbare Ergebnisse durch Automatisierung. All diese Aspekte sind sehr wichtig, wenn die Menge von Proben (z.B., Gewebeproben und Biopsien) ein limitierender Faktor ist. Die Technik hat breitere Anwendungsmöglichkeiten, inklusive Screening von Drogen oder Antikörper, Entdeckung von Biomarkern und diagnostische Zwecke.

Introduction

Kapillare isoelektrischen Fokussierung (cIEF) ist eine automatisierte, Kapillar-basierte Immunoassay, der Proteine auf der Grundlage ihrer Ladung^1,2,3aufgelöst wird. Es ist hoch reproduzierbare und auflösen, Proteine und ihre posttranslational modifizierten Isoformen schnell und quantitativ. Es stellt eine Alternative zu herkömmlichen Methoden wie westliche Beflecken. Während westliche Beflecken sehr gut ist für die Anwesenheit von reichlich Proteine in leicht zugänglichen Proben bestätigen; Variabilität, Verbrauch und genaue Quantifizierung aller anwesenden Herausforderungen, insbesondere bei der Prüfung, biologische Gewebeproben. In der Tat Variabilität ist eine inhärente Problem in westliche Beflecken, denn es gibt zahlreiche Schritte, wie laden und Ausführen von SDS-PAGE Gelen, Transfer von Proteinen auf der Membran, Inkubation mit verschiedenen Reagenzien (zB., primäre und sekundäre Antikörper, ECL), und die Entwicklung auf x-ray Film⁴. Derzeit ist die western Blot-Technik bei der Umsetzung der digitalen Aufnahmetechnik Chemolumineszenz Signale (Western digital) verbessern. Vor kurzem, ein automatisiertes western Blot-System wurde entwickelt, nämlich die Kapillare westlichen, die ein Freisprech- und Gel-freies System ist. Der gesamte Test ist automatisiert nach das Laden von einem Probenteller (Proben mit allen notwendigen Reagenzien) in das System^3,4. Das Instrument wird alle Schritte wie Protein Trennung, Immobilisierung von Proteinen auf Kapillare Wand, Antikörper Inkubationen wäscht zwischen verschiedenen Stufen und Entwicklung und Quantifizierung der Chemilumineszenz-Signale. So bietet die Polizeichefs Verfahren hier vorgestellten höhere Auflösung und Empfindlichkeit.

Diese Methode ist empfindlich, da Signale generiert und von Pikogramm Proteine¹quantifiziert werden können. Die hohe Empfindlichkeit mit hervorragende Reproduzierbarkeit macht diese Technologie sehr nützlich für die Analyse von klinischen Proben. Es kann zu erkennen sowie Post translationale Modifikation (z. B. verschiedene phosphorylierten Proteine Isoformen) von Proteinen zu unterscheiden. Diese Technologie wurde erfolgreich verwendet, um unterschiedliche Signalisierung Wege^4,5 in klinischen Studien zur Entwicklung neuen Therapeutika in Krebs³zu sezieren, und es hat ein großes Potenzial für Protein Biomarker und Drug discovery .

Protocol

(1) Zell-Kultur, Stimulation und Lyse

Hinweis: Diese Methode kann mit vielen Zelltypen verwendet werden. Um die Methode zu veranschaulichen, ist ein Beispiel für die Verwendung von menschlichen nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) beschrieben.

1. Kultur Mediumwechsel auf Gelatine beschichtet, 10 cm Petrischalen in Endothelzellen basal Medium mit entsprechenden Ergänzung (siehe Tabelle der Materialien), und auch mit 5 % FCS, epidermalen Wachstumsfaktor (5 ng/mL), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF: 0,5 ng/mL), grundlegende FGF (10 ng/mL), Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor (20 ng/mL), Hydrocortison (0,2 µg/mL) und Ascorbinsäure (1 µg/mL).
2. Verhungern Sie Zellen über Nacht mit Endothelzellen basal Medium ergänzt um 1 % FCS und kein Wachstumsfaktor Zuschlag.
3. Aspirieren Sie alle mittelständischen, fügen Sie 2 mL Endothelzellen Kulturmedium ohne Wachstumsfaktoren (Hunger Medium) in eine Schüssel (Kontrolle), dann 50 ng/mL VEGF in 2 mL Kulturmedium Hunger in eine zweite Schüssel für 7 min.
4. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie Zellen 2 Mal mit Raumtemperatur 10 mL PBS.
5. Sicherzustellen, dass die Petrischalen auf Eis und halten sie es von diesem Schritt ab.
6. Jede 10 cm Platte 250-400 µL Eis kalt Lyse Puffer (Bicine/CHAPS; siehe Tabelle of Materials) mit wässrigen Protease Inhibitor Mischung und DMSO Inhibitor Mix (Phosphatase Inhibitoren; siehe Tabelle of Materials) hinzufügen. Schwenken Sie die Platte, um korrekte Berichterstattung zu gewährleisten und halten sie für 10 min auf Eis.
   Hinweis: Die Endkonzentration der Protease und DMSO-Inhibitor-Mix sollte 1 X.
7. Kratzen Sie die Zellen aus der Schale mit einer Zelle Schaber und Transfer zu einem vorgekühlt Microfuge Schlauch. Pipette oben und unten 5 Mal zur lyse der Zellen.
8. Kurz Beschallen Sie die Zellen bei 4 ° C. Legen Sie die sonikator wie folgt: Anzahl der Zyklen = 5, Kraft = niedrig, ON = 5 Sek., OFF = 30 s. Dieser Schritt ist im Preis inbegriffen, Nukleinsäuren zu brechen und nicht um Zellen lysiert.
   Hinweis: Beschallung mild zur Denaturierung von Proteinen verhindern sollte.
9. Wirbel der Röhre für 5 s (nicht ständig), 2 s zu einem Zeitpunkt (3 mal), und halten Sie auf dem Eis.
10. Klären Sie lysate durch Zentrifugation bei 14.000 x g für 15 min bei 4 ° C, dann sofort übertragen Sie den überstand zu einem sauberen vorgekühlt Microfuge Schlauch.
11. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bicinchoninic Säure (BCA) Protein Assay Kit⁴.
12. Stellen 10 µL Aliquots, Snap in Trockeneis oder flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.

2. Mix Probenvorbereitung (Berechnung für 150 µL Probe Mix)

1. Zuerst bereiten Sie eine Probe Verdünnungsmittel Mischung durch Zugabe von 1 µL DMSO-Inhibitor-Mix (50 X auf Lager) und 2 µL Protease-Inhibitoren (25 X auf Lager), 47 µL Probe Verdünnungsmittel (siehe Tabelle der Materialien), so dass die Endkonzentration von DMSO-Inhibitoren und Protease-Inhibitoren 1 X wird. Als nächstes Verdünnen der Protein-Lysaten mit der Probe Verdünnungsmittel Mix um die gewünschte Konzentration zu erhalten (siehe Punkt 2.3).
2. Bereiten Sie Ampholyte/Leiter/Protease-Inhibitor/DMSO-Inhibitor Mischung durch Zugabe von 3,325 µL standard ladder (siehe Tabelle der Materialien; 60 X auf Lager), 6 µL Protease-Inhibitor (25 X), 3 µL DMSO (50 X)-Inhibitor, 137.675 µL Ampholyte Premix (siehe Tabelle des Materialien). Wirbel der Schlauch mindestens 15 s insgesamt 5 s zu einem Zeitpunkt (3-4 mal), und halten Sie auf dem Eis.
3. Die Lösungen von Schritte 2.1 und 2.2 im Verhältnis 1:3, zu mischen, damit die Endkonzentrationen der DMSO, Protease-Inhibitoren und der pI-standard-Leiter 1 X, und die Proteine in der Kapillare die gewünschte Endkonzentrationen erreichen (z. B.50 µg/mL wurde verwendet für ( Abbildung 2).
   Hinweis: Proteinkonzentration in der Kapillare und gut sind die gleichen.
4. 10 µL Probe-Mix in den entsprechenden Brunnen nach 384-Well-Platte Assay Vorlage Layout zu laden (siehe Schritt 3 und Abb. 1) und halten Sie die Platte auf dem Eis.
5. Verdünnen Sie die primäre (pERK1/2, 01:50; ERK1/2, 1: 100; HSP 70, 1: 500) und sekundäre Antikörper (1: 300) mit Antikörper Verdünnungsmittel (siehe Tabelle der Materialien) und 10 µL des Primär- und 15 µL Sekundärantikörper in jede Vertiefung.
   Hinweis: In der Regel höherer Konzentration von Antikörpern sind erforderlich für Polizeichefs Assays im Vergleich zu konventionellen westlichen Flecken.
6. Mischen Sie Luminol und Peroxid XDR (Verhältnis 1:1; siehe Tabelle of Materials) zusammen und pipette 15 µL in jede Vertiefung.
   Hinweis: Mischen Sie diese Lösungen frisch vor jeder Inbetriebnahme und halten Sie auf dem Eis.
7. Sobald alle Reagenzien und Proben in die Platte pipettiert, Zentrifugieren der Platte bei 2.500 x g für 10 min bei 4 ° C, drehen Sie die Flüssigkeit und die Luftblasen zu entfernen. Wenn Bläschen noch vorhanden sind, entfernen Sie diese manuell mit einem dünnen PIPETTENSPITZE.
   Hinweis: Legen Sie nicht mehr als 20 µL der Probe oder Reagenzien pro Bohrloch; Andernfalls kann nicht die Instrument-Pipette richtig gewaschen werden. Achten Sie darauf, die Bedienungsanleitung des Herstellers alle Reagenzien vorzubereiten zu folgen.

3. entwerfen eine neue Test-Vorlage mit Systemsoftware (Abbildung 1)

1. Öffnen Sie die Systemsoftware, und klicken Sie auf "neu" aus dem Menü Datei.
2. Zum Bereich "Layout" und ordnen Lokationen für Reagenzien und Proben in einem 384 Well-Platte. Verbrauchen Sie bis zu 96 Wells pro 384-Well-Platte.
3. Nehmen Sie eine Reagenz Zuweisung vor, indem Sie auf einen Brunnen überall im Block. Markieren einer Zeile 12 Brunnen. Brunnen, z.B.von 1-12 oder 13-24, werden standardmäßig als Block zugewiesen.
4. Gehen Sie zu der Layout-Bereich-Tool-Leiste und legen Sie entweder eine leere Zeile-Block oder eine Probe, primär-, sekundär-, oder Luminol Zeilenblock. Jeder Block ist eine andere Farbe zugewiesen, so dass sie leicht zu unterscheiden sind.
   Hinweis: Klickt man einen Brunnen, ein schwarzer Rand um den Block sehen wo der neue Block im Bereich eingefügt werden. Ein Zeilenblock kann auch gelöscht werden.
5. Zum Bereich "Protokoll" und wählen Reagenz in der Platte. Dann klicken Sie auf eine Zelle in der Spalte Probe und wählen Sie das Reagenz aus dem Dropdown-Menü aus.
6. Wählen Sie auf diese gleiche Weise die Reagenz Standorte für die primär-, sekundär-, und Luminol für jeden Zyklus.
7. Klicken Sie auf die Zellen, ein zu einer Zeit, in der Spalte "primären oder sekundären Antikörper" und ändern Sie die Inkubationszeiten bei Bedarf.
   Hinweis: Eintrag Notizen für jeden Zyklus können auch hinzugefügt werden.
8. Fügen Sie Zyklen durch Klicken auf die Schaltfläche "hinzufügen" im Abschnitt Protokoll hinzu. 1 Zyklus, 4 Zyklen oder alle Zyklen (maximal 8 Zyklen kann dem Protokoll hinzugefügt werden).
   Hinweis: Es ist möglich, kopieren und Einfügen von Informationen in diesem Schritt: Wählen Sie einen Zyklus, gehen Sie zu bearbeiten, kopieren und einfügen.
9. Geben Sie Informationen im Zusammenhang mit der Probe, z. B. die Identität der primären und sekundären Antikörper, Katalognummern und Verdünnungen, etc., in den Bereich "Vorlage". Dies ist ein optionaler Schritt, der bei der nach einem Testlauf Analyse nützlich ist.
10. Speichern Sie die neue Test-Datei. Überprüfen Sie schnell, bevor Sie auf die Schaltfläche "Start", das Layout um sicherzustellen, dass alles in Ordnung ist.

4. Protokoll für Polizeichefs Geräteeinstellung

1. Festlegen Sie isoelektrischen Fokussierung Kapillarelektrophorese Trennung Bedingungen. Diese sollten 15.000 µW und 40 min, und die UV Immobilisierung soll betragen 80 s. Jedoch die UV Immobilisierung Zeit einstellbar im Bereich von 80-140 s und kann für das Protein des Interesses optimiert werden müssen.
   Hinweis: Ein Zeitpunkt für UV Immobilisierung kann für jeden Zyklus, aber nicht für jede Kapillare eingestellt werden.
2. Satz waschen 1-2 Wäschen für 150 s jedes waschen (Standard) und Primärantikörper Inkubation für 120 min.
3. Satz Waschen 2 bis 2 wäscht, für 150 s jedes waschen (Standard) und sekundäre Antikörper Inkubation für 60 min.
4. Legen Sie waschen 3, die 2 Wäschen für 150 sein sollte s jedes waschen (Standard).
5. Legen Sie Belichtungszeiten als Chemilumineszenz erkannt werden; Diese sollte 30, 60, 120, 240, 490 und 960 s. Alle Schritte (1 bis 8) werden in einer einzigen Kapillare durchgeführt werden.

5. Ausführen der Assay-Datei

1. Sobald alles fertig ist, klicken Sie auf Start um den Lauf zu beginnen. Die Software fordert Sie auf, den Abfall zum Nachfüllen von Wasser und die Kapillare Box, Cher und katholyt-der Ressource-Tablett, Waschpuffer hinzufügen hinzufügen zu entfernen und schließlich die Platte in den gekühlten Probenträger laden.
   Hinweis: Entfernen Sie den Deckel von der Kapillare Box, aber nehmen Sie nicht den Deckel von der Assay-Platte. Der Deckel von der Platte kann automatisch durch das Gerät bei Bedarf entfernt werden. Dies hilft, um Reagenz Verdunstung zu verhindern.
2. Ein paar Minuten nach dem Lauf gestartet wurde, eine Instrument Statusleiste wird auf dem Computerbildschirm angezeigt werden. Statusmeldungen und Statusanzeigen ersichtlich, das Instrument Stand entspricht.
   Hinweis: Zunächst wird das Instrument überprüfen, ob alles korrekt ist, bevor Sie fortfahren, um die Cher und katholyt-in das Fach Trennung pipette, Kommissionierung des ersten Blocks von 12 Kapillaren Entfernen des Deckels der Platte und platzieren die Proben aus der Probe ist Platte in die Kapillaren und dann schließlich in die Kammer für Elektrophorese.
3. Klicken Sie auf der geführten Übersichtsseite zu sehen, zwei Scheiben: Status und Trennung. Benutzer können den laufen Fortschritt anzeigen, und Filme der Trennung (12 Kapillaren eines jeden Zyklus) können gespeichert werden, wenn die Elektrophorese Schritt eines jeden Zyklus abgeschlossen ist. Um die Elektrophorese Trennung in einer Kapillare zu beobachten, spielen Sie die Trennung-Film für die Kapillare durch Klicken auf den gewünschten Zyklus und dann die Play-Taste in der Systemsteuerung.
4. Die geführte Datei kann automatisch nach Abschluss des Laufs gespeichert werden.

6. analysieren Sie die Daten (Abbildung S1)

1. Öffnen Sie die Datei ausführen, und wählen Sie die Registerkarte Analyse Bildschirm. In Abbildung S1Aist (Peaks) in das Beispieldiagramm angezeigten Daten aus der ausgewählten Kapillare (d.h. 4^th Kapillare von Zyklus 1).
2. Klicken Sie auf Bearbeiten und dann Analyse (Abbildung S1B). In diesem Stadium können Benutzer den pI-Bereich ändern, gelten die entsprechenden pI-Standard für ein bestimmtes Experiment, fügen Sie eine Spitze Passform und Peak-Namen hinzufügen.
   Hinweis: Wenn mit einem pH 5-8 Ampholyte premix (wie hier der Fall ist), die empfohlenen standard Leiter zu verwenden ist eine mit Gewebekulturen beschriftete Peptide mit pIs 4,9 6,0, 6.4, 7,0 und 7,3 und bei einem pH 3-10 Premix, die empfohlene Leiter gehört mit pIs von 4.0 , 4.9, 6.0 und 6,4 7,3. ²
3. Die Ergebnisse werden in der Registerkarte "Peaks"; für die Proben angezeigten Werte sind Position, pI, Spitze Höhe und Fläche, % Fläche, Spitze Breite und Signal-Rausch (S/N) (Abbildung S1C). Wählen Sie welche Daten verwenden, und exportieren Sie die Daten zur weiteren Analyse.
   Hinweis: Daten können nur nach der Kennzeichnung des Gipfel (Abbildung S1C) exportiert werden.

Results

Entwurf eines neuen Assays: Eine Test-Platte-Layout ist in Figur 1Adargestellt. Maximal, 96 Wells von 384-Well-Platte in Blöcken von 12 Brunnen für jede Bedingung (Antikörper) einsetzbar. Jeder Block von 12 Brunnen kann entweder von A1-A12 oder A13-A24 beginnen. Farbcodierte Zeilen erlauben es, Proben oder Reagenzien von einander zu unterscheiden. In der Assay-Vorlage (Abbildung 1 b), relevante Informationen dafü...

Discussion

Empfindlichkeit und Auflösung von Proteinen sind entscheidend für die Proteomik Forschung an biologischen Proben. Es ist großer Wert in der Lage, Proteine zu erkennen, die in kleinsten Mengen in den Zellen vorhanden sind. Polizeichefs bieten verbesserte Empfindlichkeit und Auflösung für den Nachweis von Proteinen und deren Isoformen⁴.

Diese Technologie wird erfolgreich in vielen Proteomic Forschung Berichte^5,6

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoPro 1000	ProteinSimple
Premix G2, pH 5– 8 (verschachtelt) Trenngradient, pH 2– 4 Stecker	ProteinSimple	040-972	Ampholyte Premix
DMSO Inhibitor Mix	ProteinSimple	040-510	Phosphatase-Inhibitoren; für cIEF 1:50 Verdünnung verwendet
Wässriger Inhibitor Mix	ProteinSimple	040-482	Protease-Inhibitor; für cIEF 1:25 Verdünnung verwendet
pI Standard Leiter 3	ProteinSimple	040-646	Für cIEF 1:60 Verdünnung verwendet
Probe Verdünnungsmittel	ProteinSimple	040-649
Antikörper-Verdünnungsmittel	ProteinSimple	040-309
Waschkonzentrat	ProteinSimple	041-108
Anolyte Nachfüllpackung	ProteinSimple	040-337
Katholyt Nachfüllfülle	ProteinSimple	040-338
Peroxid XDR	ProteinSimple	041-084
Luminol	ProteinSimple	040-652
Bicine/CHAPS Lysis Buffer	ProteinSimple	040-764
Kapillar-Ladungstrennung (1 Packung) für	ProteinSimple	CBS700
Assay-Kit für Platte/Deckel	ProteinSimple	040-663
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Kaninchen IgG (H+L)	Jackson Immunforschung	711-035-152	Für cIEF gebraucht (1: 300)
Peroxidase-AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson Immunforschung	715-035-150	Für cIEF gebraucht (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 Primärer Antikörper	Zellsignalisierung	9101	Für cIEF gebraucht (1: 50)
Pan Erk Primärer Antikörper	Zellsignalisierung	9102	Für cIEF gebraucht (1: 100)
Kompass Software	ProteinSimple
HUVEC	ATCC	PCS-100-010
MV2 (EBM-2)	PromoCell	& nbsp; C-22221	Basalmedium für Endothelzellen
Wachstumsmedium für Endothelzellen MV2 SupplementPack		PromoCell C-39221	Supplementierung auf MV2 über
VEGFA	PeproTech	100-20
Long R3	IGF Sigma-Aldrich	85580C/I1146	Insulinähnlicher Wachstumsfaktor
Bioruptor (Ultraschallgerät)	Diagenod	B01020001 BCA-Protein
Assay-Kit	Thermo Fischer Scientific	23225
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gele	Thermo Fischer Scientific	NP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Laufpuffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0001
NuPAGE Transfer Puffer (20X)	Thermo Fischer Scientific	NP0006
Immobilon PVDF Membran	Millipore	IPVH00010
Mikrofuge Röhrchen Vortexer
Zentrifuge
Mikrotiterplattenadapter für Zentrifugenpipetten
nbsp;
Tipps
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