Mikroskopie-basierten Methoden für die Beurteilung der Epithelzelle Migration bei der In-vitro- Wundheilung

Summary

Dieses Manuskript wird beschrieben, wie Schnitt-ähnliche Läsionen am kultivierten Epithelzelle Monolagen günstig Modell Heilung in-vitro-, so dass für die Bildgebung durch konfokale gewickelt oder laser-scanning-Mikroskopie, und die bieten qualitativ hochwertige quantitative und qualitative Daten für das Studium Zelle Verhalten und die Mechanismen, die bei der Migration.

Abstract

Zellmigration ist obligatorisch für die Wundheilung. Erstellen von künstlichen Wunden an Tiermodellen Forschung führt oft zu teure und komplizierte experimentelle Verfahren, während möglicherweise fehlt in der Präzision. In-vitro- Kultur von epithelialen Zelllinien bietet eine geeignete Plattform für die Erforschung der Zelle Wanderungsverhalten der Wundheilung und die Auswirkungen der Behandlungen auf diese Zellen. Die Physiologie der Epithelzellen ist oft in nicht-Zusammenfluss Bedingungen untersucht; jedoch kann dieser Ansatz nicht natürliche Wundheilung Bedingungen ähneln. Stören die Epithel-Integrität mit mechanischen Mitteln erzeugt ein realistisches Modell, aber die Anwendung molekularer Verfahren behindern kann. Infolgedessen Mikroskopiertechniken basierend sind optimal für das Studium Epithelzelle Migration in-vitro-. Hier zeigen wir zwei spezifische Methoden, die künstliche Wunde kratzen Assay und der künstlichen Migration vorderen Assay, die quantitative und qualitative Daten über die wandernden Leistung von Epithelzellen bzw. erhalten können.

Introduction

Zellmigration ist erforderlich für die Wundheilung, da es für die endgültige Schließung der epithelialen Lücke und Wiederherstellung der gestörten Oberfläche¹verantwortlich ist. Durchführung von künstlichen Wunden in Tiermodellen ermöglicht für die Replikation von diesem komplexen Prozess in in der Nähe von physiologischen Bedingungen². Dieser Ansatz führt jedoch oft kostspieligen und komplizierten experimentellen Verfahren, die Präzision für die Untersuchung von unterschiedliche Prozesse, aufgrund der komplizierten Natur der Wundheilung Prozess möglicherweise fehlt.

In-vitro- Kultur ....

Protocol

1. künstliche Wunde kratzen Assay für Quantitative Studien

1. Zelle Monolage Vorbereitung
   1. Arbeiten unter sterilen Bedingungen, Samen und Mv1Lu oder HaCaT Epithelzellen in Kulturflaschen mit Serum ergänzt Medium wachsen. Aktualisieren Sie Medium einmal alle 24-48 h. Nachdem Zellen Zusammenfluss von 80 % erreichen, lösen Sie Zellen unter Verwendung einer geeigneten Methode, d.h., Trypsinization⁹.
      Hinweis: Mv1Lu und HaCaT epithelialen Zelllinien mit EMEM und DEMEM Nährmedium kultiviert werden, mit 2 mM L-Glutamin ergänzt bzw. bei 37 ° C mit 5 % CO₂kontrollierter Atmosphäre inkubiert. Jed....

Results

Künstliche Wunde kratzen Assay für Quantitative Studien: Bewertung der epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) Förderung der Migration:

EGF ist ein bekannter Induktor von epithelialen Zellen Proliferation und Migration und damit eine Positivkontrolle zur Quantifizierung der Migration Förderung. Mv1Lu und HaCaT Zelle Monolagen dienten in der Wunde kratzen Assays und Vorbehandlung Bilder stammen. Nach der Inokulation mit 10 ng/mL EGF wurde.......

Discussion

Auf Haut oder Schleimhaut-Störungen wird die Barrierefunktion durch die Aktionen der zahlreichen Zelltypen, einschließlich Fibroblasten oder epithelialen und immune Zellen wiederhergestellt. Gemeinsam, diese Zellen durchlaufen einen komplexen Prozess mit Apoptose, Proliferation, Differenzierung und allem, Fibroblasten und epithelialen Zell-Migration, die die ultimative Mechanismus für die Wiederherstellung des gestörten Gewebes verantwortlich ist und die Schließung der oberflächlichen Epithelzellen Lücke

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)	Biowest, Nuaillé, Frankreich	L0102-500	Optionaler Zuschlag von 10 % FBS
Eagles' s Minimum Essential Medium (EMEM)	Lonza	BE12 -662F	Optionales 10 % FBS-Supplement
L-Glutamin	Lonza	BE17-605E	Anwendung bei 2 mM
Fötales Rinderserum (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA	DE17603A
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T4049	Bedarf verdünnen
Poly-L-Lysin	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9155
Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (10x)	Gibco von Life Technologies	14200-067	Verdünnung auf 1x
24-Well-Kulturplatten	BD FALCON//SARSTED	734-0020
6-Well-Kulturplatten	SARSTEDT	83-3920
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	E9644	Gebraucht 10 ng/mL
Rundes Deckglas	MENZEL-GLÄ SER	MENZCB00120RA020	KURZE SCHÄRFENTIEFE
Verstärkte Rasierklinge Nr. 743	Martor (durch VWR)	MARO743.50
200 µ l sterile Aerosol-Pipettenspitzen	VWR	732-0541
20 µ l sterile Aerosol-Pipettenspitzen	VWR	732-0528
Digitalkamera gekoppeltes Phasenkontrastmikroskop	Motic Spain	Moticam Kamera 2300 3,0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Konfokales Mikroskop	ZEISS Microimaging, Deutschland	LSM 510 META
10 cm Kulturschale	BD FALCON	353003
Kaninchen polyklonaler Anti-c-Jun-Antikörper	Santa Cruz Biotechnologie	sc-1694	Gebraucht 1:100
Anti-Kaninchen IgG (polyklonale Ziege) AF 488	Invitrogen	A11008	Gebraucht 1:400
Hoechst-33258	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	14530	Verwendet 1:1000
Alexa Fluor 594 Phalloidin (in Methanol) (rot)	Invitrogen	A12381	Verwendet 1:100
Rinderserumalbumin	Santa Cruz Biotechnologie	SC-2323
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T9284
Magermilch	BD DIFCO	232100
ImageJ	National Institutes of Health, USA	Release 1.50i
Zen LSM 510 Bildverarbeitungssoftware	ZEISS Microimaging, Deutschland	Release 5.0 SP 1.1