Method Article

Mikroskopie-basierten Methoden für die Beurteilung der Epithelzelle Migration bei der In-vitro- Wundheilung

DOI:

10.3791/56799

⸱

January 2nd, 2018

 ,  ,  , 
1Laboratorio de Oncología Molecular y TGF-β, IMIB-Arrixaca, 2Departamento de Enfermería, Facultad Enfermería, Universidad de Murcia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Manuskript wird beschrieben, wie Schnitt-ähnliche Läsionen am kultivierten Epithelzelle Monolagen günstig Modell Heilung in-vitro-, so dass für die Bildgebung durch konfokale gewickelt oder laser-scanning-Mikroskopie, und die bieten qualitativ hochwertige quantitative und qualitative Daten für das Studium Zelle Verhalten und die Mechanismen, die bei der Migration.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zellmigration ist obligatorisch für die Wundheilung. Erstellen von künstlichen Wunden an Tiermodellen Forschung führt oft zu teure und komplizierte experimentelle Verfahren, während möglicherweise fehlt in der Präzision. In-vitro- Kultur von epithelialen Zelllinien bietet eine geeignete Plattform für die Erforschung der Zelle Wanderungsverhalten der Wundheilung und die Auswirkungen der Behandlungen auf diese Zellen. Die Physiologie der Epithelzellen ist oft in nicht-Zusammenfluss Bedingungen untersucht; jedoch kann dieser Ansatz nicht natürliche Wundheilung Bedingungen ähneln. Stören die Epithel-Integrität mit mechanischen Mitteln erzeugt ein realistisches Modell, aber die Anwendung molekularer Verfahren behindern kann. Infolgedessen Mikroskopiertechniken basierend sind optimal für das Studium Epithelzelle Migration in-vitro-. Hier zeigen wir zwei spezifische Methoden, die künstliche Wunde kratzen Assay und der künstlichen Migration vorderen Assay, die quantitative und qualitative Daten über die wandernden Leistung von Epithelzellen bzw. erhalten können.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zellmigration ist erforderlich für die Wundheilung, da es für die endgültige Schließung der epithelialen Lücke und Wiederherstellung der gestörten Oberfläche1verantwortlich ist. Durchführung von künstlichen Wunden in Tiermodellen ermöglicht für die Replikation von diesem komplexen Prozess in in der Nähe von physiologischen Bedingungen2. Dieser Ansatz führt jedoch oft kostspieligen und komplizierten experimentellen Verfahren, die Präzision für die Untersuchung von unterschiedliche Prozesse, aufgrund der komplizierten Natur der Wundheilung Prozess möglicherweise fehlt.

In-vitro- Kultur von epithelialen Zelllinien bietet eine hilfreiche Alternative zu Tiermodelle zur Erforschung der Rolle von diesen Zellen in Wundheilung und die Auswirkungen der Behandlung auf Zelle Wanderungsverhalten. Die Physiologie der Epithelzellen wird oft von molekularen Techniken mit nicht-Zusammenfluss Kulturen3,4,5,6untersucht; die Störung der Epithel Integrität wird jedoch in der Regel durch feine mechanische Ritzlinien erreicht. In der Zellkultur impliziert dies, dass die Wunde Lücke zu vernachlässigende Zahl von Zellen ausgesetzt sein kann, und sie eine zu kleine Probe für molekularbiologische Techniken stellen. Jedoch können diese Läsionen auf der mikroskopischen Skala, unter Ausnutzung der angeborenen wandernden Eigenschaften einige epithelialen Zell-Linien wie die Mink Lunge Epithelzelle (Mv1Lu) oder die Zelle spontan verewigt menschlichen Keratinozyten (HaCaT) untersucht werden Linien.

Hier haben wir eine Methode für die Mikroskopie, die geeignet ist, quantitative Daten über die Migration von Epithelzellen im Rahmen der Wundheilung3,4,7,8. Darüber hinaus präsentieren wir weitere Methoden, die hilfreich sind, qualitativ molekulare und morphologische Veränderungen auf epithelialen Monolagen während der Migration zu studieren. Insgesamt bieten diese Methoden einen Rahmen um die Dynamik und die morphologischen Veränderungen Epithelzelle Verhalten und Reaktion auf Behandlungen mit einbezogen bei der Wundheilung zu untersuchen.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. künstliche Wunde kratzen Assay für Quantitative Studien

  1. Zelle Monolage Vorbereitung
    1. Arbeiten unter sterilen Bedingungen, Samen und Mv1Lu oder HaCaT Epithelzellen in Kulturflaschen mit Serum ergänzt Medium wachsen. Aktualisieren Sie Medium einmal alle 24-48 h. Nachdem Zellen Zusammenfluss von 80 % erreichen, lösen Sie Zellen unter Verwendung einer geeigneten Methode, d.h., Trypsinization9.
      Hinweis: Mv1Lu und HaCaT epithelialen Zelllinien mit EMEM und DEMEM Nährmedium kultiviert werden, mit 2 mM L-Glutamin ergänzt bzw. bei 37 ° C mit 5 % CO2kontrollierter Atmosphäre inkubiert. Jede Zelllinie muss gründlich untersucht werden, um festzustellen, Zellkonzentration und Timing erforderlich, um volle Konfluenz zu erreichen. In der Regel für Mv1Lu oder HaCaT-Zellen, 2-4 x 104 oder 4-6 x 104 Zellen/Brunnen, bzw. sind entkernt in einem 175 cm2 Kultur Kolben und bei 80 % Zusammenfluss ergibt bis zu 35 x 106 Mv1Lu oder 1 x 107 HaCaT-Zellen.
    2. Samen Sie in entweder einer Kultur 12-Well oder 24-Well-Platte in jede Vertiefung 2 mL der Zellen. Medium zu aktualisieren, sobald alle 24-48 h. sicher Zellzahlen sind hoch genug, um 100 % Zusammenfluss nach 2 oder 3 Tagen erreichen.
    3. Nachdem die Zellen Zusammenfluss erreicht haben, entfernen Sie das Serum ergänzt Medium zu und waschen Sie zweimal mit frischem serumfreien Medium. Halten Sie Zellen in serumfreien Medium für 24 h vor dem Verkratzen.
      Hinweis: Mv1Lu oder HaCaT-Zellen haben keine speziellen Substrat Anforderungen; jedoch sollte vor Beschichtung der Kultur Plattenoberfläche mit einer Poly-L-Lysin-Lösung für Zell-Linien trennen spontan in serumfreien Bedingungen anfällig,10gelten.
  2. Monolage kratzen
    1. Arbeiten in einer sterilen Umgebung, kratzen Sie die Monolayer Kultur durch das schmale Ende 20 µL und 200 µL steriler Mikropipette Tipp, abhängig von der gewünschten Breite Kratzer fest ziehen. Halten Sie die Spitze senkrecht zur Oberfläche Kultur Lücke Homogenität zu maximieren.
      1. Platzieren Sie die Kultur-Platten über eine dunkle Oberfläche deutlich die Zelle Monolage überwachen. Bei Bedarf führen Sie zwei senkrecht Kratzer (kreuzförmige) auf jedem Bohrloch bis zu 4 Migration Bereiche zu studieren.
    2. Waschen Sie freistehende Zellen durch sanft entfernen, Kultur und sanft hinzufügen frischen serumfreien Medium. Zwei Mal wiederholen, oder bis die meisten ungebundene Zellen entfernt worden sind.
  3. Experimentelle Verfahren und Datenerhebung
    1. Nehmen Sie bis zu 4 Vorbehandlung Referenzbilder zentriert auf die Kratzer Lücke von jeder gut mit einem invertierten Phasenkontrast-Mikroskop mit einer CCD-Kamera. Wählen Sie Interesse Bereiche ausrichten Mikroskop Feldrand bis zur angrenzenden Kreuzung von Kratzern.
      Hinweis: In der Regel sind Bilder aufgenommen mit einer 10-fach Vergrößerung und eine Bildgröße von 1.280 x 1.024 Pixel. Auswahl der Interessengebiete wie oben hilft für einfache Lokalisierung und Validierung von bis zu 4 Messungen pro Bohrloch beschrieben.
    2. Sobald alle Bilder gesammelt sind, benennen Sie Behandlung Brunnen; tauschen Sie das Medium in den Brunnen mit frischem Medium, das ausgewählte Behandlungen enthält.
      Hinweis: Alternativ können für Chemikalien oder Verbindungen, die nicht Kulturmedium Homogenität stören, Behandlungen direkt in das Kulturmedium geimpft werden.
    3. Inkubieren Sie zerkratzte Platte (37 ° C mit kontrollierter Atmosphäre mit 5 % CO2), bis die Bedingungen, unter Beobachtung erreichen 90 % Scratch Lückenschluss. Vermeiden Sie Vollsperrung.
      Hinweis: Insgesamt Lückenschluss hebt Nachbehandlung Bildersammlung Referenzflächen sind nicht nachweisbar und der Zeitbezug zum Schließen der Lücke kann nicht hergestellt werden. Im Falle von Mv1Lu oder HaCaT-Zellen sind 16-19 h verpflichtet, 90 % Zusammenfluss zu erreichen.
    4. Stoppen Sie die Zellwanderung durch die Fixierung der Zellen; ersetzen Sie sanft die experimentelle Kulturmedium mit 1 mL 4 % Formalin in PBS. 15 min bei RT inkubieren
    5. Waschen der Zellen, um überschüssige Formalin zu entfernen; ersetzen Sie sanft die Lösung in den Vertiefungen mit frischen PBS. Wiederholen Sie mindestens zwei Mal.
      Hinweis: In diesem Stadium können nach dem Abdichten, Platten bei 4 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.
    6. Die ursprüngliche Referenzflächen gefangen genommen, nachdem kratzen entnehmen Sie Nachbehandlung Referenzbilder von jedem Bohrloch. Verwenden Sie die gleiche Ausstattung (umgekehrte optische Phasenkontrast-Mikroskop mit einer CCD-Kamera) und passenden Bildeinstellungen (Vergrößerung und digitaler Auflösung/Dichte).
      Hinweis: Zellen, die einzeln zu migrieren und die Lücke unabhängig von der Bildung einer einheitlichen Front (z.B. MDA-MB-231 menschlichen Brustkrebszellen), können die Zeitverlauf Bilder die Berechnung der einzelnen Zelle Migration Geschwindigkeiten ermöglichen.
  4. Bildanalyse und Quantifizierung der migration
    1. Mittels Bildverarbeitungs-Software (z. B.ImageJ), definieren Sie Scratch Lücke Grenzen und bestimmen Sie die Lücke Oberfläche für bis zu vier Messungen in Vorbehandlung Bilder. Notieren Sie die Daten als "Vorbehandlung Lücke Oberfläche" (PREGAP). Wiederholen Sie den Vorgang für die Nachbehandlung Bilder. Notieren Sie die Daten als "Nachbehandlung Lücke Oberfläche" (POSTGAP).
      1. Öffnen Sie das aufgezeichnete Bild mit ImageJ. Legen Sie im Menü "Bild" Bildtyp auf 8 Bit. Im Menü "Vorgang" zum Untermenü "Filter" und "Varianz" Filter anwenden.
      2. Im Menü "Bild" geben Sie "anpassen", Untermenü und Schwelle in schwarz und weiß (B & W), stellen Sie sicher, "Dark Background" ist nicht aktiviert. Im Menü "Vorgang" zur "binär" Untermenü, und wählen Sie "Löcher füllen".
      3. Wählen Sie im Menü "analysieren" "Messungen" und aktivieren Sie "Raum" zu. Ziehen Sie den messbaren Bereich nach der Migration von Rand Kontur zur Abgrenzung somit der Lückenschluss.
      4. Wählen Sie im Menü "analysieren" "analysieren Partikel" und zeichnen Sie "Fläche" Werte für die gezeichnete Fläche Oberfläche.
    2. PREGAP und POSTGAP Gesamtfläche Werte in einem Arbeitsblatt zu quantifizieren, absolute Migration für jeden Satz von Einzelproben als Differenz der Lücke Oberflächenmessungen vorstellen: PREGAP − POSTGAP [beliebige Einheiten]. Darüber hinaus absolute Migrationsdaten jeder Bedingung zu Kontrollproben zu normalisieren: (Probe / Kontrolle) * 100 [%].
      Hinweis: Für Zellen, die einzeln zu migrieren und die Lücke unabhängig von der Bildung einer einheitlichen Front, (z.B., MDA-MB-231 menschlichen Brustkrebszellen), die absolute Migration kann berechnet werden durch zählen von Zellen in einer zentralen Streifen entweder in das Steuerelement oder die behandelten Proben.
    3. Plot-Quantifizierung Ausgänge (siehe Abbildung 1). Durchführen Sie statistische Analyse, wenn nötig.
Berücksichtigen Sie Studenten t-Test beim Vergleich von zwei Bedingungen oder Varianzanalyse Test für größere Anzahl von Bedingungen.

2. künstliche Migration vorderen Assay für topographische Studien

  1. Zelle Monolage Vorbereitung
    1. Legen Sie unter sterilen Bedingungen arbeiten, eine Schicht aus sterilisierten Runde Deckgläsern in leere Kultur Platten bis die Plattenoberfläche vollständig bedeckt ist.
      Hinweis: Passen bis zu 12 und 33 Deckgläsern auf 5 cm und 10 cm Durchmesser Teller, beziehungsweise.
    2. Samen Sie auf dem Kultur-Teller sanft eine angemessene Lautstärke von Zellen in einer Konzentration, die 100 % Zusammenfluss nach 2 oder 3 Tagen erlaubt. Sicherstellen Sie, dass keine Deckglas benachbarten Deckgläsern überlappt und verhindern Sie, dass Deckgläsern schweben durch sanften Druck mit einer sterilen Mikropipette Spitze. Aktualisieren Sie dem Medium alle 24-48 h.
      Hinweis: Jede Zelllinie muss gründlich untersucht werden, ermitteln Zellkonzentration und Timing erforderlich, um volle Konfluenz zu erreichen. In der Regel sind für Mv1Lu oder HaCaT-Zellen, 2-3 x 106 oder 2,5-4 x 106 Zellen/10 cm-Durchmesser Teller, bzw. ausgesät. Für kleinere Platten müssen Zellzahlen verkleinert werden.
    3. Nachdem die Zellen Zusammenfluss erreicht haben, das Serum ergänzt Medium zu entfernen und ersetzen mit frischen serumfreien Medium. Halten Sie die Zellen in serumfreien Medium für 24 h, bevor die künstliche Wunde durchgeführt wird.
      Hinweis: Mv1Lu oder HaCaT-Zellen haben keine speziellen Substrat Anforderungen; jedoch sollte vor Beschichtung der Kultur Oberfläche mit einer Poly-L-Lysin-Lösung für Zell-Linien des Abnehmens spontan in serumfreien Bedingungen anfällig,10gelten.
  2. Monolage Verwundung
    1. Bewegen Sie mit sterilen Pinzette sanft ein Deckglas auf einen sauberen 10 cm Teller mit frischen serumfreien Medium. Beschädigung der Monolage halten das Deckglas an der Peripherie mit einer Pinzette zu vermeiden. Vermeiden Sie übermäßigen Druck auf der Deckglas Bruch führen könnten.
    2. Erstellen Sie künstliche Wunden durch Ziehen einer sterilisierten Rasierklinge in einer Querlinie mittig auf den Deckgläsern. Ziehen Sie ca. 3-4 mm hin und her, um den zentralen Monolage Streifen vollständig zu entfernen. Sicherstellen Sie, dass keine Zellenrückstand der Verwundeten Kanten verbunden bleibt.
      Hinweis: bei einem Durchmesser von 12 mm Runde Deckglas, erfolgt der Schnitt in der Mitte von dem Deckglas. Stellen Sie sicher, einen Streifen von Zellen gegenüber der Hauptfront groß genug (mindestens 2 mm breit) um zu vermeiden, Kippen des Deckglases in den folgenden Schritten zu verlassen.
    3. Verwundete Deckgläsern mit Zellen nach oben, um eine saubere 6-Well-Platte mit mindestens 2 mL frisches serumfreien Medium zu übertragen. Passen Sie bis zu 4 verwundete Deckgläsern/gut.
    4. Vorsichtig waschen, zwei Mal mit frischen serumfreien Medium, freistehende Zellen zu entfernen.
  3. Versuchsdurchführung und Probenahme
    1. Tauschen Sie sanft das Medium in den Brunnen mit frischem Medium, das ausgewählte Behandlungen enthält.
      Hinweis: Alternativ können für Chemikalien oder Verbindungen, die nicht Kulturmedium Homogenität stören, Behandlungen direkt in das Kulturmedium geimpft werden. Gehen Sie mit Vorsicht, jede mögliche Zelle Loslösung zu vermeiden.
    2. Halten Sie die Platte in eine Zelle Brutmaschine (37 ° C, 5 % CO2) für das gewünschte experimentelle Timing.
    3. Stoppen Sie die Zellwanderung durch die Fixierung der Zellen; ersetzen Sie sanft die experimentelle Kulturmedium mit 1 mL 4 % Formalin in PBS. 15 min bei RT inkubieren
      Hinweis: Mal Kurs Experimente, entfernen Sie die Proben aus der Kultur-Platte und befestigen Sie sie in einer separaten Platte, Formalin-Dämpfe, die Auswirkungen auf die anderen, laufenden experimentellen Bedingungen zu vermeiden.
    4. Waschen der Zellen, um überschüssige Formalin zu entfernen; ersetzen Sie sanft die Lösung in den Vertiefungen mit frischen PBS. Wiederholen Sie mindestens zwei Mal.
      Hinweis: In diesem Stadium können nach dem Abdichten, Platten bei 4 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.
  4. Immunfluoreszenz (IF) und topologische Analyse
    1. Führen Sie IF Färbung und Bildgebung auf einzelnen Deckgläsern als an anderer Stelle beschrieben,3,4,11.
      1. Permeabilize für 10 min durch Eintauchen Deckgläsern in einer 0,3 % Triton x-100 Lösung mit PBS-Puffer.
      2. Block für 30 min mit der folgenden blockierende Lösung: 0,3 % Rinderserumalbumin; 10 % fötalen Rinderserum; 5 % Magermilch; 0,3 % Triton x-100 Lösung mit PBS-Puffer.
        Hinweis: Blockiert Lösung ohne Milch im Voraus vorbereitet und gespeichert werden kann bei-20 ° C.
      3. Inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer mit Primärantikörper in milchfreie blockierende Lösung verdünnt. Legen Sie die Deckgläsern kopfüber in die 15 µL Antikörper-Lösung für korrekte Verteilung zu gewährleisten.
        Hinweis: Die Antikörper arbeiten Verdünnung ist variabel und hängt von der Antikörper im Einsatz. Beispielsweise erfordert der Kaninchen-Anti-c-Jun-Antikörper eine Verdünnung von 1/100.
      4. Waschen Sie dreimal durch Eintauchen der Deckgläsern in einer in 0,1 % Triton x-100 Lösung in PBS.
      5. Inkubieren Sie die Deckgläsern in Sekundärantikörper verdünnt in milchfreie blockierende Puffer für 30 min.
        Hinweis: Die Antikörper arbeiten Verdünnung ist variabel und hängt von der Antikörper im Einsatz. Die Ziege-Anti-Kaninchen (488) benötigt beispielsweise eine Verdünnung von 1/400 für optimale Auflösung. Andere Kennzeichnung Reagenzien wie Phalloidin und Hoechst 33258 können in dieser Phase der Inkubation Puffer hinzugefügt.
      6. Waschen Sie dreimal durch Eintauchen der Deckgläsern in 0,1 % Triton x-100 Lösung in PBS.
      7. Montieren Sie die Deckgläsern kopfüber in ein 10 µL Montage Medien Tropfen (z.B.Vectashield) auf einen Objektträger gelegt. Verlassen Sie die Folien im Dunkeln bei Raumtemperatur über Nacht für die Montage mittlerer Verhärtung. Danach, bei 4 ° C im Dunkeln auf unbestimmte Zeit zu speichern.
    2. Erhalten Sie entweder Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie Bilder von strukturellen Veränderungen bei der Migration von Vorderkante.
      Hinweis: Topologische Studien können durch Fliesen Bilder von Migration von vorne auf die innere Monolage durchgeführt werden. Semi-quantitativen Studien sind möglich durch Software-basierte Analyse auf lokalen Fluoreszenz-Intensitäten.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Künstliche Wunde kratzen Assay für Quantitative Studien: Bewertung der epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) Förderung der Migration:

EGF ist ein bekannter Induktor von epithelialen Zellen Proliferation und Migration und damit eine Positivkontrolle zur Quantifizierung der Migration Förderung. Mv1Lu und HaCaT Zelle Monolagen dienten in der Wunde kratzen Assays und Vorbehandlung Bilder stammen. Nach der Inokulation mit 10 ng/mL EGF wurde...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auf Haut oder Schleimhaut-Störungen wird die Barrierefunktion durch die Aktionen der zahlreichen Zelltypen, einschließlich Fibroblasten oder epithelialen und immune Zellen wiederhergestellt. Gemeinsam, diese Zellen durchlaufen einen komplexen Prozess mit Apoptose, Proliferation, Differenzierung und allem, Fibroblasten und epithelialen Zell-Migration, die die ultimative Mechanismus für die Wiederherstellung des gestörten Gewebes verantwortlich ist und die Schließung der oberflächlichen Epithelzellen Lücke

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir wollen durch ältere Mitglieder des Labors geben, die helfen, verbessern und verfeinern Sie diese Techniken in den tatsächlichen Zustand: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada und Dr. Antonia Alcaraz-García. Wir sind verpflichtet, das Hospital Clínico Universitario Virgen De La Arrixaca für unterstützt nachdrücklich die Entwicklung dieser Techniken. Auch das Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Planen Sie Estatal ich + D + I und Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento De La Investigación (Grant-Nr.: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER "Una Manera de Hacer Europa". Wir danken auch Universidad de Murcia, IMIB Arrixaca und FFI für administrative Unterstützung und Hilfe. Schließlich wollen wir einen besonderen Dank an Dr. Isabel Martínez-Argudo und die Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico De La Fábrica de Armas, Universidad Castilla La Mancha Toledo für ihre freundliche Unterstützung in bereitwillig Abtretung geben die Biomedizin und Biotechnologie-Labor den gefilmten Teil dieses Papiers zu ermöglichen.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Biowest, Nuaillé, FrankreichL0102-500Optionaler Zuschlag von 10 % FBS
Eagles' s Minimum Essential Medium (EMEM)LonzaBE12 -662FOptionales 10 % FBS-Supplement
L-GlutaminLonzaBE17-605EAnwendung bei 2 mM
Fötales Rinderserum (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USADE17603A
Trypsin-EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO, USAT4049Bedarf verdünnen
Poly-L-LysinSigma-Aldrich, St Louis, MO, USAP9155
Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) (10x)Gibco von Life Technologies14200-067Verdünnung auf 1x
24-Well-KulturplattenBD FALCON//SARSTED734-0020
6-Well-KulturplattenSARSTEDT83-3920
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAE9644Gebraucht 10 ng/mL
Rundes DeckglasMENZEL-GLÄ SERMENZCB00120RA020KURZE SCHÄRFENTIEFE
Verstärkte Rasierklinge Nr. 743Martor (durch VWR)MARO743.50
200 µ l sterile Aerosol-PipettenspitzenVWR732-0541
20 µ l sterile Aerosol-PipettenspitzenVWR732-0528
Digitalkamera gekoppeltes PhasenkontrastmikroskopMotic SpainMoticam Kamera 2300 3,0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Konfokales MikroskopZEISS Microimaging, DeutschlandLSM 510 META
10 cm KulturschaleBD FALCON353003
Kaninchen polyklonaler Anti-c-Jun-AntikörperSanta Cruz Biotechnologiesc-1694Gebraucht 1:100
Anti-Kaninchen IgG (polyklonale Ziege) AF 488InvitrogenA11008Gebraucht 1:400
Hoechst-33258Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA14530Verwendet 1:1000
Alexa Fluor 594 Phalloidin (in Methanol) (rot)InvitrogenA12381Verwendet 1:100
RinderserumalbuminSanta Cruz BiotechnologieSC-2323
Triton X-100Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAT9284
MagermilchBD DIFCO232100
ImageJNational Institutes of Health, USARelease 1.50i
Zen LSM 510 BildverarbeitungssoftwareZEISS Microimaging, DeutschlandRelease 5.0 SP 1.1
Nach

References

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