Methodenartikel

Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging

8.4K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/56801

⸱

26. Februar 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2Tuberculosis Research Section, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben die optische Bildgebung von Mäusen mit Mycobacterium Tuberculosis (Mycobacterium Tuberculosis) mit Reporter Enzym Fluoreszenz (REF) infiziert. Dieses Protokoll ermöglicht den sensitiver und spezifischen Nachweis von Mycobacterium Tuberculosis in präklinischen Tiermodellen für die Pathogenese, Therapie und Impfstoff-Forschung.

Zusammenfassung

Reporter-Enzym-Fluoreszenz (REF) nutzt Substrate, die spezifisch für Enzyme zur Bildgebung oder Aufdeckung von Fluoreszenz und Biolumineszenz in Zielorganismen von Interesse sind. Wir nutzen BlaC, ein Enzym, das konstitutiv durch alle M. Tuberkulose -Stämme ausgedrückt. REF ermöglicht schnelle Quantifizierung von Bakterien in der Lunge von infizierten Mäusen. Die gleiche Gruppe von Mäusen kann abgebildet werden, zu vielen Zeitpunkten, erheblich Kosten reduzieren, Auflisten von Bakterien schneller ermöglicht neuartige Beobachtungen in Wirt-Pathogen Interaktionen und statistische Aussagekraft zu erhöhen, da mehr Tiere pro Gruppe leicht gepflegt werden . REF ist extrem katalytische aufgrund der BlaC enzymatische Reporter sensitiver und spezifischer aufgrund der benutzerdefinierten Flourescence Resonanz Energietransfer (FRET) oder Fluorogenic Substrate verwendet. REF erfordert keine rekombinante Stämme, normale Wirt-Pathogen Interaktionen zu gewährleisten. Wir beschreiben die Bildgebung von M. Tuberkulose -Infektion mit einem Bund Substrat mit maximalen Emission bei 800 nm. Die Wellenlänge des Substrates ermöglicht empfindliche Tiefengewebe-Bildgebung bei Säugetieren. Wir skizzieren Aerosol-Infektion von Mäusen mit M. Tuberculosis, Anästhesie von Mäusen, Verwaltung der REF Substrat und optische Bildgebung. Diese Methode wird erfolgreich angewendet, zur Bewertung von Wirt-Pathogen Interaktionen und Wirksamkeit der Antibiotika gezielt M. Tuberculosis.

Einleitung

Die langsame Wachstumsrate von M. Tuberculosis ist ein Haupthindernis in schnelle Diagnose von Tuberkulose1,2,3. Während Kultur Diagnose dauert es Wochen basierte, Ergebnisse zu erzielen, hat säurefeste Abstrich diagnostische Einschränkungen4 Kinder5 und Patienten mit humanen Immundefizienz-Virus6,7. Optical imaging-Technologien wurden kürzlich als Alternative zu herkömmlichen Diagnoseverfahren für Tuberkulose8,9anerkannt. Fluoreszenz und Biolumineszenz können verwendet werden, um optisch M. Tuberculosis mit lebenden Tieren in Echtzeit-10,11,12,13,14Bild, 15,16,17,18,19. Optische Verfahren hat den Vorteil einer schnellen und spezifischen Beurteilung einer Infektion mit Mycobacterium Tuberculosis20,21,22.

Wir skizzieren Details für optische Bildgebung von M. Tuberculosis in live Mäuse mit REF. Diese Methode ist sehr spezifisch und sensitiv23,24 , und ähnlich wie bei anderen optischen Methoden ist weniger teuer als andere Methoden der Tuberkulose (TB) imaging25, einschließlich Computertomographie (CT)26, magnetische Magnetresonanz-Bildgebung (MRI)27und F-FDG-Positronen-Emissions-Tomographie/CT (F-FDG-PET/CT)28. REF nutzt benutzerdefinierte fluoreszierende oder biolumineszenten Substrate, die bei der Spaltung durch eine bakterielle Enzym eine fluoreszierende Produkt8,29zu produzieren. Daher hat es den Vorteil, dass eine rekombinante mykobakteriellen Reporter Belastung30,31. Der Bund Substrat beschrieben besteht aus einem Fluorochrom und einen Durstlöscher, verbunden durch ein β-Lactam-Ring, der durch BlaC (β-Lactamase), natürlich konstitutiv durch Tuberkulose-Komplex Mycobacterium8, ausgedrückt hydrolysiert 32. die Bakterien erzeugen direkt Signal durch REF katalytische Aktivität, die Verstärkung von vielen Größenordnungen und empfindliche Detektion von M. Tuberculosisermöglicht.

In dieser Studie verwendeten REF-Substrat hat ausgezeichnete Gewebe eindringen in lebenden Tieren und Hintergrund aufgrund seiner langen Wellenlänge reduziert. Mit dieses langwellige Substrat ist es möglich, einen Schwellenwert von Erkennung für M. Tuberculosis von fast 100 zu erreichen Koloniebildenden Einheiten (KBE) in Vitro und < 1000 KBE in den Lungen von Mäusen in Vivo (ganze Tier)8, 33. REF kann als ein Diagnosetool für Auswurf, klinischen Materials und sogar direkt bei Patienten mit Mikro endoskopische Systeme16,32,33,34 aufgrund seiner hohen Sensitivität und Spezifität verwendet werden. REF kann auf jede klinische Belastung von Tuberkulose angewendet werden, weil es ein natürlich produzierten bakterielle Enzym, BlaC, für die Erkennung in allen Sorten vorhanden verwendet. Diese Eigenschaften machen REF imaging ein wertvolles Werkzeug in der präklinischen Tuberkuloseforschung im allgemeinen therapeutischen Erleichterung sowie Impfstoff Auswertung und Analyse der Pathogenese, aber letztlich auch zur Diagnose Tuberkulose angewandt werden Patienten.

Protokoll

Tierexperimentellen Studien wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften, die durch die institutionellen Animal Care und Nutzung Committee of Texas A & M University durchgeführt. Prüfung und Genehmigung von Biohazard Sicherheitsbeauftragten oder Ausschuss in Ihrer Institution sein erforderlich.

Achtung: Alle Verfahren erfordern BSL3 Containment. Die Mitarbeiter sind verpflichtet, persönlichen Schutzausrüstung zu allen Zeiten zu tragen. Alle Manipulationen sind innen Biosafety Cabinet (BSC) durchgeführt und alle Kleie in Sharps Container entsorgt werden. Arbeit Oberflächen und BSC werden vor Beginn der Arbeit und nach der Arbeit mit gepuffertem Phenol und 70 % Ethanol gereinigt. Verfahren würde normalerweise auf Sicherheitsstufe 3 mit Mycobacterium Tuberculosiserfolgen, sondern für Illustration und Dreharbeiten Zwecke, veranschaulichen die Autoren diese Verfahren auf Biosafety Niveau 2 mit weniger virulenten Bakterien.

(1) Stämme und Kultur Bedingungen

Hinweis: M. Tuberculosis Stamm CDC1551 wird in dieser Studie verwendet, aber jede M. Tuberculosis -Belastung kann auf die gleiche Weise verwendet werden.

  1. Wachsen die Bakterien in M-OADC-TW (7H 9 Brühe ergänzt mit 0,5 % Glycerin, 10 % Ölsäure Traubenzucker komplexe ohne Katalase und 0,05 % Tween-80) mittlere stehen bei 37 ° C auf einem OD-600 von 0,5 (~ 0,2 x 107 KBE).
  2. Verdünnen Sie die Kultur in M-OADC-TW (Reihe von 01:10 Verdünnungen der Bakterien). Platte die Verdünnungen der Bakterien (105, 106107108) in dreifacher Ausfertigung auf selektive 7 H 11 Platten erlauben die Bestimmung der KBE.
  3. Vier Wochen bei 37 ° C oder bis Kolonien genau gezählt werden können inkubieren Sie die Platten.
  4. Zentrifugieren Sie das bakterielle Inokulum 8.534 x g für 5 min um eine Kugel zu erhalten. Waschen Sie die Tablette einmal mit 10 mL Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) und wieder auszusetzen das Pellet in 15 mL Kochsalzlösung (0,9 % NaCl).

(2) Aerosol Infektion der Mäuse mit einer Madison-Kammer

  1. Können Sie Mäuse, für eine Woche an die neue Umgebung gewöhnen.
  2. Wiegen Sie die Mäuse vor dem Laden sie in die Kammer.
  3. Drei Kabel in die Steckerleiste anschließen: die Hauptkammer macht, die Vakuumpumpe und der Luft-Kompressor, in dieser Reihenfolge.
  4. Schrauben Sie vorsichtig das Glasgefäß. Bringen das Glasgefäß zum Schrank Biosafety und fügen Herausforderung Inokulum ausgesetzt in 15 mL Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) zu erreichen ~ 104 - 106 KBE von Bakterien in der Lunge.
  5. Schließen Sie den Deckel von Glas im Kabinett der Biosicherheit. Legen Sie das Glas auf die Verneblereinheit und stellen Sie das vertikale Edelstahlrohr so ein, dass das untere Ende (Intake) etwa ein Viertel eines Zoll unter dem Niveau der Flüssigkeit im Glas ist.
  6. Laden Sie alle Tiere, die notwendig für das Experiment (Saal fasst bis zu 90 Mäuse) in die Kammer und schließen Sie die Riegel an der Tür.
  7. Überprüfen Sie die wichtigsten (Raum) air-Flow-Meter. Stellen Sie sicher, dass das Zentrum des Schwimmers (Kugel) ca. 50 L/min, gemessen auf der Skala auf der linken Seite betreibt.
  8. Drücken Sie die Schaltfläche "Start" auf dem Bedienfeld der Kammer. Legen Sie die Luftmenge durch den Kompressor Luft Durchflussmesser (die kleineren m links) als 4 L/min auf die Waage. Überprüfen Sie visuell, um sicherzustellen, dass die Herausforderung Inokulum vernebelt wird.
  9. Nach 15 min Wenn das rote Licht an der Vorderseite des Bedienfelds angezeigt wird und ein akustisches Signal das Ende des Laufs zeigt, Taste Reset auf der unteren rechten Ecke des Bedienfelds um den Timer zurückzusetzen.
  10. Halten Sie den kleinen roten Knopf an der Tür der Kammer, das Vakuum zu lösen.
  11. Öffnen Sie die Tür und entfernen Sie die Tiere. Setzen Sie die Mäuse wieder in ihren Käfigen.
  12. Zerstäuber Glas zu entfernen und in einem geschlossenen, auslaufsicheren Behälter legen. Stellen Sie den Behälter in die Bio-Sicherheit-Schrank und entsorgen Sie die Herausforderung-Suspension in einen dafür vorgesehenen Abfallbehälter.
  13. Legen Sie das gebrauchte Vernebler Glas innen ein Biohazard Beutel und Verschließen der Tasche für den Transport zu den Autoklaven.
  14. Am Ende des Verfahrens Infektion sprühen Sie das Innere der Kammer mit gepuffertem Phenol und 70 % Ethanol und lassen Sie die Kammer für 10 min sitzen.
  15. Dann wischen Sie alle zugänglichen Innenflächen sehr gründlich. Entsorgen Sie alle kontaminierten Papierhandtücher, etc.. in den Biohazard-Papierkorb. Autoklaven den Papierkorb, Abfallbehälter und Vernebler Gläser verwendet.
  16. Platziere die Tiere zurück in das Containment-Zimmer bis zu den bildgebenden Zeit-Punkt.
  17. Am Tag der Bildgebung übertragen Sie die Tiere in einem sekundären Container auf den bildgebenden Raum.

3. Tier Anästhesie

  1. Die Mäuse mit Isofluran verwenden eine benutzerdefinierte Gasanlage Anästhesie zu betäuben.
  2. Wiegen Sie jedes der zwei Aktivkohlefilter Kanister befindet sich oben auf die Anästhesie-Einheit.
  3. Ersetzen Sie durch einen neuen Kanister, wenn das Gewicht 50 g über das Ausgangsgewicht ist.
  4. Überprüfen Sie die Vaporizer Gerät dafür ausreichend Isofluran für das Verfahren.
  5. Platzhalter in der bildgebenden Kammer Bugnase. Legen Sie die Anzahl der Nase Kegel für das Verfahren erforderlichen und verschließen Sie die verbleibenden Öffnungen mit der Nase Kegel-Blocker.
  6. Schalten Sie die Sauerstoffzufuhr aus dem Hochdruck-Zylinder und 55 Psi festgesetzt.
  7. Die Evakuierung-Pumpe befindet sich vor dem Anästhesie-Gerät einschalten und auf 8 L/min eingestellt.
  8. Schalten Sie den Sauerstoff-Schalter befindet sich vor der Anästhesie-Einheit.
  9. Schalten Sie den Gasstrom der Anästhesie Induktion Kammer die Strömung des Gases bei 1,5 L/min drehen den Gasstrom aufzubrechen.
  10. Schalten Sie den Gasstrom der bildgebenden Kammer der Strömung des Gases in 0,25 L/min drehen den Gasstrom aufzubrechen.
  11. Schalten Sie den Verdampfer Isoflurane und setzen Sie ihn auf 2-2,5 %. Passen Sie den Isofluran nach Anzahl und Gewicht der Tiere durch Drehen des Knopfes auf dem Verdampfer Isoflurane (2-2,5 % für eine Maus mit einem Gewicht von ~ 20 g; 4 % für ein Meerschweinchen mit einem Gewicht von 300 g) für das Experiment verwendet wird.
  12. Legen Sie die Mäuse in der Anästhesie-Kammer und schließen Sie den Deckel. Schalten Sie die Gaszufuhr an der Anästhesie Induktion Kammer.
  13. Verlassen Sie die Mäuse in der Anästhesie Induktion Kammer für 5-10 min bis vollständig betäubt.
  14. Sobald die Mäuse betäubt sind, gelten Sie eine optische Salbe für die Augen, sie während der Bildgebung zu schützen.
  15. Legen Sie die Mäuse in ventralen oder sternale liegen, so dass ihre Nasen in die Bugnase Anästhesie von Mäusen während der bildgebenden Verfahren zu erleichtern platziert werden.

(4) Reporter Enzym Fluoreszenz (REF) Bildgebung

  1. Injizieren Sie das Substrat (20 µM, 2,5 µL/g Gewicht) durch intraperitoneale Injektion in den infizierten sowie der Kontroll-Mäusen. Die Mäuse sind unter Narkose in der bildgebenden Kammer für weniger als 1 min.
  2. Starten Sie die imaging-System.
  3. Initialisieren Sie das System durch Anklicken initialisieren. Warten Sie, bis die Temperatur Bar auf grün wechselt.
    Hinweis: Die bildgebende Kammer besteht aus einer beheizten Plattform auf Körpertemperatur des Tieres während der Bildgebung.
  4. Für imaging-Erwerb Einstellung, wählen Sie Leuchtstofflampen | Trans-Beleuchtung für ganze Tier oder Epi-Beleuchtung für Lungengewebe, Struktur und Overlay in Übernahme der Systemsteuerung.
  5. B Sichtfeld für einzelne Maus und Lampe Niveau zu hoch gesetzt.
  6. Belichtungszeit auf Auto, mittlere binning, 2-3 für die f/Stop und Erregung Filter bei 745 nm und Emission Filter festgelegt, von 780 nm bis 840 nm.
  7. Klicken Sie für Sequenz-Setup auf Reihenfolge-Setup, wählen Sie 9-12 Trans-Beleuchtung Punkte im Bereich der Lunge.
  8. Klicken Sie auf erfassen, für die Bildaufnahme.
  9. Platzieren Sie den Mauszeiger wieder in den Käfig Post-Bildgebung.
  10. Überwachen Sie die Mäuse bis vollständig erholt oder zur Quantifizierung KBE, wenn zu einem Zeitpunkt des Experiments imaging zu opfern. Führen Sie einen modifizierten Karnofsky-Score um das Wohlergehen von Mäusen, die Post-imaging zu überwachen.

5. Analyse der REF imaging

  1. Öffnen Sie die imaging-Software.
  2. Laden Sie Bilddateien durch durchsuchen anklicken.
  3. Klicken Sie für spektrale Entmischung in der Werkzeugpalette auf Spectral Unmixing und klicken Sie auf die Spektren unmix verpflichtet. Klicken Sie auf Start zu entmischen.
  4. Klicken Sie für optische Flächenrückführung auf Oberfläche Topographie.
  5. Wählen Sie Ausrichtung, dorsal, je nach Fell Maus, und klicken Sie auf Generate Oberfläche.
  6. Zeichnen Sie Bild zuschneiden und Schwelle Bild für eine Region von Interesse. Klicken Sie auf fertig.
  7. Gehen Sie für Orgel Registrierung zur Registerkarte Registrierung 3D optische Werkzeuge im Dropdown-Menü.
  8. Organe des Interesses an einer Orgel-Atlas zu registrieren.
  9. Passen Sie Orgel Größe oder Lage, um die generierten Oberflächentopographie mit Werkzeug "transformieren" ein-/befindet sich auf der Panel-Registrierung Tools an.
  10. Rufen Sie fluoreszierende Tomographie 3D-Rekonstruktion (FLIT), und wählen Sie analysieren tab. Wählen Sie die Bilder für die Analyse einbezogen werden, Bildtyp, normalisiert Übertragung Fluoreszenz (NTF) Effizienz, klicken Sie auf Start.
  11. Überprüfen Sie auf alle auswählen und in der Registerkarte "Datenvorschau" zu rekonstruieren.
  12. Gehen Sie für die Quantifizierung der Fluoreszenz Region von Interesse (ROI)-Tools, ROI Cube, die Orgel von Interesse hinzuzufügen und passen Sie Cube Größe zur Deckung die Orgel von Interesse. Klicken Sie auf 3D ROIs zu messen.
  13. Im Fenster ROI Messungen zur ROI 3D-Messungen, wählen Sie Datentyp an Quelle Voxel-Messungen-Einheit auf PmolM-1cm-1.
  14. Sichern Sie und exportieren Sie das Ergebnis der FLIT 3D-Rekonstruktion Analyse in einer Abbildung oder Daten-Datei.

(6) Quantifizierung der Bakterien von KBE

  1. Die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium 0,1 mL (390 mg/mL) einschläfern.
  2. Suchen Sie nach Pedal Reflex durch Zusammendrücken der Pads der Füße von Mäusen um sicherzustellen, dass keine reflex Reaktion.
  3. Explant das Lungengewebe von Mäusen, die mit einer sterilen Pinzette und Schere. Homogenisieren des Lungengewebes in 1 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
  4. 10-divisibel serielle Verdünnungen der Lunge Homogenat in sterilen 1 X PBS zu machen.
  5. Vor Ort für Beschichtung, drei Aliquote von 20 µL der jeweiligen Verdünnung auf der Agarplatte.
  6. Inkubieren Sie die Platten in einem Inkubator bei 37 ° C und Monitor für Bakterienwachstum.
  7. Anzahl der Kolonien in den einzelnen vor Ort nach der Inkubationszeit und express als KBE / mL durch Korrektur der Lautstärke und Verdünnung mit folgender Gleichung:
    KBE / mL = (C/V) x M
    Wo C = Kolonie zählt pro Spot, V = Volumen der Probe inokuliert auf jeder Platte (mL), und M = Multiplikationsfaktor (Kehrwert der Verdünnung verwendet).
    Hinweis: Wenn an einer Stelle für ein Probenvolumen von 0,002 mL bei einer Probenverdünnung von 10-411 Kolonien gezählt werden, werden unter Verwendung der Gleichung, die Anzahl der Kolonie berechnet
    (11/0.02) X 104 = 5,5 x 106 KBE / mL

Ergebnisse

REF Bildgebung von Mäusen zusammen mit nicht infizierten Kontrolle Maus mit M. Tuberculosis infiziert sind in Abbildung 1Adargestellt. Infizierte Mäuse produziert ein signifikant (P = 0,0057) höheren Fluoreszenzsignal aus der Lunge in 6 Wochen nach der Infektion im Vergleich zur Kontrolle auf Substrat Verwaltung. Ein typischen zeitlichen Verlauf der therapeutischen Wirksamkeit gegen M. Tuberculosis mit REF studieren konnte imaging bei Woche, 1, 2, 4, 6, 15, 24 nach der Infektion. Fluoreszenzintensität wird quantifiziert mit Epi-Beleuchtung für Lungengewebe (Abbildung 1B). Das ständig zunehmende Signal von Woche 2 Woche 6 in Lungen von infizierten Mäusen legt nahe, dass REF erfolgreich M. Tuberculosis in-vivoerkennen kann. Ein Tropfen in das Hintergrundsignal des Kontroll-Mäusen zu einem späteren Zeitpunkt (Abbildung 1B) könnte der Anstieg der Körper zugeschrieben werden Masse und Volumen von Mäusen über einen Zeitraum von 6 Wochen, wodurch die Erregung Wellenlänge Eindringen. FLIT 3D-Rekonstruktion von Fluoreszenz Quellen bei Mäusen mit M. Tuberculosis infiziert ist in Abbildung 2Avertreten. Die Bildsequenzen werden an mehreren Punkten der Trans-Beleuchtung in der Maus mit dem gleichen Anregung und Emission Filter-Serie erworben. Diese Bildsequenzen werden dann für FLIT 3D-Rekonstruktion für fluoreszierende Source-Distribution innerhalb der tierischen Thema verwendet. Abbildung 2 A-D zeigt die verschiedenen Richtungen (koronalen, sagittale und 2D-Einzelschicht) der Maus-Tomographie mit Lunge Orgel Registrierung. NTF-Effizienz Karten für die Überprüfung die Wiederaufbau-Qualität sind in Abbildung 2Evertreten. NTF ermöglicht Subtraktion der Hintergrund Lichtverlust von Trans-Beleuchtung Bilder durch ein zusätzliches Bild mit Graufilter eingefangen. Die Aufnahme mit dem spezifischen Erregung Filter (Abbildung 2E gemessen) ist auf das Getriebe Bild gemessen mit der gleichen Emission und eine offene Erregung Filter (Abbildung 2E - simuliert) geben normalisiert. das Signal durch das Substrat allein produziert. Die ähnliche gemessen und simuliert NTF Effizienz Profil sowohl horizontal (Abbildung 2F) und vertikale (Abbildung 2G) Profile mit fast 0 % prozentualen Fehler (Abbildung 2E % Fehler) bietet Hinweise auf eine gute Qualität 3D-Rekonstruktion mit reduzierten Artefakten und verbesserte Signal-Lokalisierung und Empfindlichkeit.

figure-results-1
Abbildung 1 . Bildgebung des M. Tuberculosis mit ref (A) in-Vivo Bildgebung von Mäusen nicht infizierten und bei 2, 4 und 6 Wochen nach der Infektion mit Mycobacterium Tuberculosis infiziert. Die Farbleiste stellt die Intensität der das Fluoreszenzsignal in Photonen pro Sekunde pro cm2 von Low (gelb), hoch (rot). (B) Quantifizierung der Fluoreszenzintensität von Mäusen mit M. Tuberculosisinfiziert. Fluoreszenz-Werte für beide Kontrolle (schwarz) und infizierte (rot) sind zusammen mit der Standardfehler für jeden Zeitpunkt vertreten. Die Bedeutung der Ergebnisse wurden ermittelt, indem Schüler t-test, p -Werte der < 0,05 wurden als bedeutende. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-2
Abbildung 2 . FLIT 3D-Rekonstruktion von Fluoreszenz Quellen bei Mäusen mit M. Tuberculosisinfiziert. Maus-Tomographie in verschiedene Richtungen vertreten; (A) koronalen, (B) sagittale, und (C) 2D-Einzelschicht mit (D) Lunge Orgel Registrierung. Die 3D Region of Interest (ROI) wird als eine rote Würfel in der Lunge für Quelle Messungen dargestellt. (E) NTF Effizienz Karten der gemessenen und simulierten für die Überprüfung der Wiederaufbau-Qualität. Die gemessenen und simulierte NTF-Effizienz-Profil wurde verglichen, die gute Qualität der 3D-Rekonstruktion (ähnliche gemessenen und simulierten NTF Effizienz). F) Horizontal "und" G) vertikale Signal Profile repräsentieren gemessenen (blau) und simuliert (rot) NTF Effizienzkurve. Die horizontalen und vertikalen roten Balken zeigen die Quellposition. Die Farbleiste stellt die Intensität der das Fluoreszenzsignal in Photonen pro Sekunde pro cm2 von Low (blau) zu hoch (rot). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Bei der Verwendung von bildgebender Verfahren, wie z. B. REF, gibt es Schlüsselstrategien, die Generierung von stabilen und konsistenten Daten zu ermöglichen. Optische Verfahren erzeugt Streulicht im Gewebe, die die Tiefe der Penetration, auswirken können, da es schwierig ist, in alle Richtungen emittierte Licht einzufangen. Verwendung von einem in der Nähe von Infrarot-Fluorophor (NIR) Substrat für REF Bildgebung mit einer Anregung und Emission Wellenlänge in der Querange von 700-900 nm ermöglicht minimale Absorption das Fluoreszenzsignal durch Säugetier-Gewebe. Die benutzerdefinierten gestaltete Substrat wurde durch die Verknüpfung einer NIR Fluorophor, IRDye 800Cw einen Quencher gebaut IRDye QC-1, von einem Lactam-Ring ermöglicht Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer-basierte abschrecken. IRDye hat ausgezeichnete Gewebe eindringen und Licht Streuung Eigenschaften und hat keinen keine offensichtlich schädliche Wirkung auf Säugetiere36, aus dem Blut und Organe durch 24 h. Fluoreszenz ausgeglichen signalisieren deutlich erhöht, ab 4 h nach Substrat-Verwaltung erreichen maximale Ebenen 6 h nach Verabreichung.

Die bakterielle infektiöse Dosis, die Art der Verwaltung von infektiöse Dosis und das Substrat sowie Zeitpunkte der imaging-Post-Infektion durch Pilotstudien durchführen sollten standardisiert werden, vor dem Einschiffen auf großen, komplexen, Experimente. Pilotstudien können erheblich reduzieren, Zeit und Kosten, wenn eine große Anzahl von Tieren imaging, weil ein Standardverfahren vor dem Ausführen der wichtigsten Experiment optimiert werden kann. Bakterielle Belastungen sollte ermittelt werden, in den Organen/Geweben von Interesse nach Ganzkörper-Bildgebung mit Trans-Beleuchtung und ex Vivo Lunge Bildgebung mit Epi-Beleuchtung um die Quelle des Signals zu überprüfen und bestimmen die Qualität der Korrelation mit bakteriellen Zahlen vorhanden8. Pilot-Studien bieten einen Einblick in die Schwelle der Erkennung, dynamischen Bereich der Technik sowie die Bestimmung der optimalen Versuchsbedingungen für die Bildgebung.

Die Hauptvorteile der Verwendung von REF Bildgebung im Vergleich zu anderen fluoreszenten und biolumineszenten Strategien sind seine hohe Sensibilität und die Fähigkeit zur natürlichen M. Tuberculosis Bild Stämme. REF imaging nutzt das katalytisch robuste Enzym BlaC, die in allen klinischen Isolaten von M. Tuberculosis und Tuberkulose-Komplex Stämme konserviert ist. Die große Empfindlichkeit des REF imaging ist aufgrund der raschen katalytische Rate von BlaC in Kombination mit Eigentumsvorbehalt gespalten fluoreszierende Produkts durch die Wirtszelle. Signalisieren Sie kontinuierlich erhöht, solange das Substrat zur Verfügung, wodurch nahezu unbegrenzte Aufbau des Signals innerhalb der infizierten Zellen und Gewebe ist. Diese erhöhte Empfindlichkeit des REF Bildgebung im Vergleich zu alternativen Ansätzen der Bildgebung ermöglicht spezifische Erkennung von M. Tuberculosis sowohl in Vitro und in Vivo8,23,24, 29.

REF imaging einsetzbar für bakterielle Erkennung ohne gentechnische Veränderungen ermöglichen die direkte Anwendung Infektionsmodell, entweder Labor Tiere8,37 oder menschlichen klinischen Materials29,38 . REF kann verwendet werden, zu erkennen und eine Vielzahl von Krankheitserregern39,40, Bild, da Fluorogenic Substrate für zahlreiche enzymatische Ziele außer BlaC wie Proteasen, Kinasen, Ureases und β-Galactosidases entwickelt werden können. Zeigt jedoch vorsichtig sein, dass das Ziel nachgedacht werden sollte um sicherzustellen es optimale Eigenschaften für die Bildgebung. BlaC stellt ein gutes Modell Enzym für Merkmale, die erfolgreiche Anwendung dieser Strategie sicherstellt. REF imaging bietet eine sofortige auslesen auf bakterielle Last in Lunge bei Infektionen, die stark Fortschritte beschleunigt im Studium der Tuberkulose Pathogenese, da die Bestimmung der bakteriellen Zahlen erfordert in der Regel drei bis sechs Wochen, aber auch in mehr schnellsten wachsenden Organismen, die diese Vorgehensweise sehr viel spart Zeit. REF kann auch verwendet werden, Karzinome an Tuberkulose, ein zentrales Problem bei der Diagnose von nodulären Läsionen in Patienten41,42zu unterscheiden. "REF" dient als neuartige Werkzeug, translationale Tuberkulose Bildgebung zu beschleunigen und kann auch für den Menschen potenziell ermöglicht schnellen Vorhersage von therapeutischen Ergebnissen angewendet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Isofluran-VETONE501027
CNIR800kundenspezifische synthetisierte
Fatal Plus-LösungVortech Pharmaceutical Ls, Ltd
7H9 Middlebrook-BouillonBD271310
OADC Middlebrook-AnreicherungBD212351
SporcidinRE-1284F
7H11 Middlebrook AgarBD212203
Madison Chamber
IVIS SpectrumPerkin Elmer124262
XGI-8-Gas AnästhesiesystemPerkin Elmer
Living Imaging SoftwarePerkin Elmer
Transparente NasenkegelPerkin Elmer
M. tuberculosis Stamm CDC1551ATCC
Weibliche BALB/C-Mäuse, 5-7 WochenJackson Laboratory

Referenzen

  1. Lewinson, D. M., et al. Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children. Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).
  2. Lee, J., et al. Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs. Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).
  3. Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).
  4. Behr, M. A., et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli. Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).
  5. Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).
  6. Monkongdee, P., et al. Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus. Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).
  7. Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence. Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).
  8. Yang, H. J., et al. Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate. J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).
  9. Nooshabadi, F., et al. Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with β-lactamase reporter enzyme fluorescence. J Biophotonics. , (2016).
  10. Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Using luciferase to image bacterial infections in mice. J Vis Exp. (48), (2011).
  11. Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis. Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).
  12. Andreu, N., et al. Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase. J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).
  13. Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria. PLoS ONE. 5 (5), 10777(2010).
  14. Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging. PLoS ONE. 11 (2), 0149932(2016).
  15. Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models. Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537(2013).
  16. Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope. Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A(2011).
  17. Zelmer, A., et al. A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging. J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).
  18. Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry. Front. Microbiol. 7, (2016).
  19. Ordonez, A. A., et al. Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).
  20. Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).
  21. Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. A humanized mouse model of tuberculosis. PLoS ONE. 8 (5), 63331(2013).
  22. Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).
  23. Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous β- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice. P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).
  24. Kong, Y., Cirillo, J. D. Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals. Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).
  25. Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. Imaging in tuberculosis. Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).
  26. Lee, K. S., Im, J. G. CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management. Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).
  27. Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging. J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).
  28. Soussan, M., et al. Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT. Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).
  29. Sule, P., et al. New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform. Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).
  30. Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity. Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).
  31. Kong, Y., et al. Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo. PLoS ONE. 11 (3), 0149972(2016).
  32. Xie, H., et al. Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe. Nature Chem. 4, 802-809 (2012).
  33. Nooshabadi, F., et al. Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of β-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe. Proc SPIE. 9715, 97150(2016).
  34. Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. Advances in tuberculosis diagnostics. Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).
  35. Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).
  36. Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats. Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).
  37. Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Front Microbiol. 8, 717(2017).
  38. 2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis. US patent. , 20150219653 A1 (2015).
  39. Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. A Covalent Reporter of β-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria. Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).
  40. Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of β-Lactamase in Staphylococcus aureus. Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).
  41. Ashizawa, K., et al. Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT. BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).
  42. Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study. BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Mycobacterium tuberculosis BildgebungAerosol Infektion bei M usenoptisches BildgebungssystemFRET Substrat 800 nmCFU QuantifizierungsmethodeLungengewebeanalyse3D FLIT RekonstruktionWirt Pathogen InteraktionenPr fung der Antibiotika Wirksamkeit
Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.