Fertigung-Verfahren und Doppelbrechung Messungen für die Gestaltung von magnetisch reagieren Lanthanoid-Ionen chelatisierenden Phospholipid-Baugruppen

Stéphane Isabettini; Mirjam E. Baumgartner; Peter Fischer; Erich J. Windhab; Marianne Liebi; Simon Kuster

doi:10.3791/56812

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Methodenartikel

Fertigung-Verfahren und Doppelbrechung Messungen für die Gestaltung von magnetisch reagieren Lanthanoid-Ionen chelatisierenden Phospholipid-Baugruppen

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DOI:

10.3791/56812

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3. Januar 2018

Stéphane Isabettini¹ , Mirjam E. Baumgartner¹ , Peter Fischer¹ , Erich J. Windhab¹ , Marianne Liebi² , Simon Kuster¹

¹Laboratory of Food Process Engineering, ETH Zurich, ²MAX IV Laboratory, Lund University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Fertigung-Verfahren für stark magnetisch reagieren Lanthanoid-Ionen chelatisierenden Polymolecular Baugruppen werden vorgestellt. Die magnetische Antwort richtet sich nach der Montage Größe, die durch Extrusion durch Nanopore Membranen zugeschnitten ist. Die Assemblys magnetische Alignability und temperaturbedingte strukturelle Veränderungen werden durch Doppelbrechung Messungen, eine kostenlose Technik, NMR- und kleinen Winkel Neutronenstreuung überwacht.

Zusammenfassung

Bicelles sind abstimmbaren scheibenartigen Polymolecular Baugruppen gebildet aus einer Vielzahl von Lipid-Mischungen. Anwendungen reichen von Membran-Protein strukturelle Studien durch Kernspinresonanz (NMR), nanotechnologischen Entwicklungen einschließlich der Bildung von optisch aktiven und magnetisch umschaltbar Gele. Solche Technologien erfordern hohe Kontrolle der Montage Größe, magnetische Resonanz und thermischen Widerstand. Mischungen von 1,2-Dimyristoyl -sn- Glycero-3-Phosphocholin (DMPC) und seine Lanthanoid-Ionen (Ln^{3 +}) chelatisierenden Phospholipid-Konjugat, 1,2-Dimyristoyl -sn- Glycero-3-Phospho-Ethanolamin-Diethylenglykol Triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), in stark magnetisch reagieren Baugruppen wie DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} montieren (molares Verhältnis 4:1:1) Bicelles. Einführung von Cholesterin (Chol-OH) und Steroid-Derivate in der Bilayer führt zu einem anderen Satz von Assemblys bietet einzigartige physikalisch-chemischen Eigenschaften. Für eine gegebene Lipidzusammensetzung ist die magnetische Alignability proportional zur Bicelle Größe. Die Komplexierung von Ln^{3 +} führt zu noch nie da gewesenen magnetische Antworten in Bezug auf Größe und Ausrichtung Richtung. Die Thermo-Reversible reduzieren der scheibenartigen Strukturen in Vesikeln beim Erhitzen können Anpassung die Assemblys Dimensionen durch Extrusion durch Membranfilter mit definierten Porengrößen. Die magnetisch anreihbar Bicelles werden regeneriert, durch kühlen auf 5 ° C, wodurch Einbaumaße durch die Vesikel Vorläufer definiert. Hierin, dieses Fertigung-Verfahren erläutert und die magnetische Alignability der Baugruppen wird durch Doppelbrechung Messungen unter 5,5 T Magnetfeld quantifiziert. Die Doppelbrechung Signal, aus dem Phospholipid Bilayer ermöglicht weitere Überwachung der Polymolecular Veränderungen in der Bilayer. Diese einfache Technik ist komplementär zur NMR-Experimente, die häufig eingesetzt werden, um Bicelles zu charakterisieren.

Einleitung

Bicelles sind scheibenartige Polymolecular Baugruppen aus zahlreiche Lipid-Mischungen gewonnen. ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ sie sind für die strukturelle Charakterisierung von Membran Biomoleküle durch NMR-Spektroskopie verbreitet. ⁶ ^, ⁷ jüngste Bemühungen sollen jedoch das Feld der Anwendungsmöglichkeiten zu erweitern. ⁵ ^, ⁸ ^, ⁹ das am meisten untersuchte Bicelle System besteht aus einer Mischung von 1,2-Dimyristoyl -sn- Glycero-3-Phosphocholin (DMPC), die planar Bestandteil der Versammlung und 1,2-Dihexanoyl -sn- Glycero-3-Phosphocholin (DHCP) Phospholipid über den Rand. ¹ ^, ² ^, ³ die molekulare Geometrie der Phospholipide, die Komposition der Bilayer bestimmen die Architektur der selbstgebaute Polymolecular Struktur. ⁴ ^, ⁵ Ersatz DHCP mit DMPE-DTPA erzeugt sehr magnetisch reagieren und einstellbaren Bicelle Systeme. ¹⁰ ^, ¹¹ DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (molares Verhältnis 4:1:1) Bicelles assoziieren mit vielen mehr paramagnetischen Lanthanoid-Ionen (Ln^{3 +}) auf der Bilayer Oberfläche, wodurch eine verbesserte magnetische Antwort. ¹⁰ im übrigen ersetzt die wasserlösliche DHCP-Moleküle mit DMPE-DTPA/Ln^{3 +} ermöglicht die Bildung von Verdünnung-resistente Bicelles. ¹¹

Die magnetische Alignability planare Polymolecular Baugruppen wird durch ihre insgesamt magnetische Energie diktiert,

figure-introduction-1 (1)

wo B die magnetische Feldstärke ist, figure-introduction-2 die magnetische Konstante, n die Aggregation Anzahl und figure-introduction-3 der molekularen diamagnetische Suszeptibilität Anisotropie der Lipide der Bilayer zu komponieren. Daher ist die Reaktion der DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} Bicelles auf magnetische Felder durch ihre Größe (aggregierte Zahl n) und der molekularen diamagnetische Suszeptibilität Anisotropie Δχ zugeschnitten. Letzteres wird leicht durch Änderung der Art der Chelat Ln^{3 +}erreicht. ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ Introducing Cholesterin (Chol-OH) oder anderen Steroid Derivate in der Bilayer bietet die Möglichkeit des Tunings die aggregierte Anzahl n und der magnetischen Suszeptibilität Δχ der Baugruppen. ¹¹ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ für einen gegebenen Lipidzusammensetzung enthalten größere Baugruppen mehr Lipide in der Lage, einen Beitrag zur E-_Mag (größer aggregierte Zahl n), was zu mehr Einlaufkästen Arten. Die Größe der DMPC/DHCP Bicelles ist z. B. konventionell durch Optimierung der kompositorischen Lipidkonzentration Verhältnis oder insgesamt gesteuert. ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² auch wenn dies in DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} Bicelles möglich ist, ihre Thermo-Reversible Umwandlung von Bicelle zu Bläschen auf Heizung Angebote Schneiderei Optionen hinzugefügt. Mechanische bedeutet wie Extrusion durch Membranfilter ermöglicht die Gestaltung der Vesikel. Die magnetisch anreihbar Bicelles werden beim Abkühlen auf 5 ° C regeneriert und ihre Dimensionen sind aus der Vesikel-Vorstufen diktiert. ¹¹ Herein, wir konzentrieren uns auf das Potenzial der mechanischen Fertigung Verfahren mit DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molares Verhältnis 4:1:1) oder DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (Molverhältnis 16:4:5:5) als Bezugssysteme. Der Prozess funktioniert analog bei der Arbeit mit anderen Ln^{3 +} als Tm^{3 +}. Die breite Palette von Möglichkeiten, die diese Techniken sind in Abbildung 1 hervorgehoben und an anderer Stelle ausführlich erläutert. ²³

figure-introduction-4
Abbildung 1: Schematische Übersicht über die möglichen Herstellung Verfahren. Die studierten magnetisch Einlaufkästen Ln^{3 +} Komplexbildner Polymolecular Baugruppen bestehen aus entweder DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molares Verhältnis 4:1:1) oder DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (Molverhältnis 16:4:5:5). Die trockenen Lipid-Film wird mit einem 50 mM-Phosphat-Puffer auf einen pH-Wert von 7,4 hydratisiert und die gesamten Lipidkonzentration beträgt 15 mM. Eine effektive Hydratation der Lipid-Film erfordert entweder Einfrieren Auftauen Zyklen (FT) oder Heizen und kühlen Zyklen (H & C). H & C Zyklen sind notwendig, Proben nach dem letzten Einfrieren Auftauen Schritt regenerieren oder regenerieren Proben über einen längeren Zeitraum hinweg eingefroren aufbewahrt, wenn sie ohne weitere Extrusion verwendet werden sollen. Diese Schritte werden von Isabettini Et al.ausgiebig diskutiert. ²³ maximal anreihbar Polymolecular Baugruppen werden erreicht, liefern verschiedene Montage-Architekturen basierend auf der Lipidzusammensetzung. Die Bicelle Größe und magnetische Alignability ist abstimmbaren durch Extrusion (Ext) durch Nanopore Membranfilter. Dargestellten Ausrichtung Faktoren A_f wurden berechnet aus 2D kleiner Winkel Neutron (SANS) Streubildern einer DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (Molverhältnis 16:4:5:5) Probe extrudiert über 800, 400, 200 oder 100 nm Poren. SANS Messungen sind ergänzende Mittel zur Quantifizierung der Bicelle Ausrichtung, die im Detail hier nicht abgedeckt werden. ¹¹ ^, ¹⁶ die A-_f reicht von-1 (parallele Neutronenstreuung oder senkrechte Ausrichtung des Bicelles in Bezug auf die Richtung des Magnetfeldes) bis 0 für isotrope Lichtstreuung.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.

Die Struktur des Bicelles wurde durch eine Vielzahl von Charakterisierung Techniken ausgiebig untersucht. ¹³ die Ausrichtung des Bicelles, einem Magnetfeld ausgesetzt wurde quantifiziert, entweder mithilfe NMR-Spektroskopie oder kleinen Winkel Neutron Streuexperimente (SANS). ⁵ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁴ ^, ²⁵ sind jedoch die Verschiebung und Verbreiterung der NMR Spitzen Auftritt im Beisein von Ln^{3 +} gravierende Einschränkungen der Methode. ¹⁵ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸ obwohl SANS Experimente nicht leiden diese Einschränkung, alternative und mehr zugängliche Techniken sind wünschenswert für routinemäßige Quantifizierung von magnetisch induzierte Ausrichtung von Baugruppen in Lösung. Doppelbrechung Messungen sind eine vergleichsweise einfache und praktikable Alternative. Analog zeigen NMR-Experimente, Doppelbrechung Messungen wertvolle Informationen über Lipid Umgestaltungen und Lipid-Phasen in der Bilayer auftreten. Darüber hinaus sind geometrische Transformationen, die in der Polymolecular-Versammlung mit wechselnden Umweltbedingungen wie Temperatur überwacht. ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ magnetisch induzierte Doppelbrechung Δn′ wurde verwendet, um verschiedene Arten von Phospholipid-Systeme zu studieren. ¹³ ^, ²⁹ ^, ³⁰ Doppelbrechung Messungen auf der Grundlage der Phasenmodulation Technik in einem Magnetfeld ist eine praktikable Methode, um Ausrichtung des Bicelles zu erkennen. ¹² ^, ¹⁶ ^, ¹⁸ ^, ²⁹ ^, ³¹ ^, ³² die Möglichkeit der Untersuchung von Bicelles mit Doppelbrechung in hohen Magnetfeldern bis zu 35 T zeigte auch von M. Liebi Et al. ¹³

Wenn polarisiertes Licht ein anisotropen Materials tritt, wird es in einer ordentlichen und außerordentlichen Welle gebrochen. ¹¹ die zwei Wellen haben unterschiedliche Geschwindigkeiten und werden durch eine Verzögerung δ in Phase verschoben. Der Grad der Behinderung δ gemessen und in eine Doppelbrechung Signal umgewandelt figure-introduction-5 , den Grad der Anisotropie in der materiellen mit zu quantifizieren

figure-introduction-6 (2)

wo λ ist die Wellenlänge des Lasers und d ist die Dicke der Probe. Phospholipide sind optisch anisotropen und ihre optische Achse deckt sich mit ihren langen molekularen Achsen parallel zu den Kohlenwasserstoff-Schwänzen. ¹¹ ^, ¹² keine Retardierung wird gemessen, wenn die Phospholipide in Lösung nach dem Zufallsprinzip orientiert sind. Retardierung wird gemessen, wenn Phospholipide parallel zueinander ausgerichtet sind. Der magnetisch induzierte Doppelbrechung figure-introduction-7 haben einen positiven oder negativen Vorzeichen abhängig von der Orientierung der Moleküle in das magnetische Feld; siehe Abbildung 2. Phospholipide, die parallel zur x-Achse ausgerichtet führt zu einer negativen figure-introduction-8 , während die ausgerichteten entlang der z-Achse zur Folge haben einer positives figure-introduction-9 . Keine Doppelbrechung wird beobachtet, wenn die optische Achse mit der Richtung der Lichtausbreitung fällt, wie die Phospholipid Parallel zur y-Achse ausgerichtet.

figure-introduction-10
Abbildung 2: Ausrichtung der Phospholipide und der entsprechenden Zeichen der magnetisch induzierte Doppelbrechung figure-introduction-11 . Das Zeichen des gemessenen figure-introduction-12 richtet sich nach der Ausrichtung des Phospholipid im Magnetfeld. Gestrichelte Linien zeigen die optische Achse des Moleküls. Das Licht ist um 45° polarisiert und breitet sich in y-Richtung. Das Magnetfeld B befindet sich in Z-Richtung. Diese Zahl wurde von M. Liebi geändert. ¹¹ Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Im Falle einer isotropen kolloidale Suspension von Bicelles wird die Ausrichtung durch die Anordnung der Phospholipide in der Bilayer induzierte Nullung Retardierung δ verloren gehen. Die Bicelles müssen auch ausrichten, um die optisch aktive Phospholipide in ihre Bilayer, verursacht eine Verzögerung δ von polarisiertem Licht orientieren. Infolgedessen ist die Doppelbrechung sensible Werkzeug, das magnetische Alignability Polymolecular Baugruppen zu quantifizieren. Bicelles ausgerichtet senkrecht zum Magnetfeld ergibt eine Positive figure-introduction-13 , während die parallel ausgerichtet eine Negative erbringt figure-introduction-14 . Das Schild hängt von der Ausrichtung des Setups und kann mit einer Referenzprobe überprüft werden.

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Protokoll

1. Herstellung Verfahren für DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molares Verhältnis 4:1:1) und DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (Molverhältnis 16:4:5:5) Polymolecular Baugruppen

Erste Vorbereitungen
1. Waschen der Gläser durch Spülen einmal mit Ethanol stabilisiert Chloroform (> 99 % Chloroform) und mit Druckluft trocknen.
2. 2 unterschiedliche 10 mg/mL Stammlösungen der DMPC und DMPE-DTPA in Ethanol-stabilisiertes Chloroform zu produzieren (> 99 % Chloroform), eine 10 mM-Stammlösung von Chol-OH in Ethanol-stabilisiertes Chloroform (> 99 % Chloroform) und einer 10 mM Vorratslösung TmCl₃ in Methanol.
3. Bereiten Sie ein 50 mM Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,4 durch Mischen 0,121 g Natrium Dihydrogen Phosphat Dihydrat und 0,599 g wasserfreies di-Natrium Wasserstoff Phosphat in 100 mL Reinstwasser H₂O.
Vorbereitung der trockenen Lipid-film
1. Wiegen Sie die benötigten Mengen an amphiphilen (DMPC, DMPE-DTPA und optional Chol-OH) und Ln^{3 +} Stammlösungen in separaten 3 mL Glas Snap-Tassen mit einer Spritze 2,5 mL Glas.
  1. Für ein 3 mL Probenvolumen von DMPC/DMPE-DTPA / Tm3 + (molares Verhältnis 4:1:1, insgesamt Lipidkonzentration 15 mm), in 3,6435 g der DMPC Vorratslösung, 1,4731 g DMPE-DTPA-Stammlösung und 0,7126 g der Vorratslösung TmCl₃ wiegen.
  2. Für ein 3 mL Probenvolumen von DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (Molverhältnis 16:4:5:5, total Lipidkonzentration 15 mm) in 2,9148 g der Vorratslösung DMPC, 1,4731 g DMPE-DTPA-Stammlösung, 1,0749 g der Chol-OH-Stammlösung und 0,7126 g wiegen die TmCl₃ -Stammlösung.
    Achtung: Chloroform und Methanol sind giftig und flüchtige bei Raumtemperatur. Arbeiten unter einer Abzugshaube und umgehend mit der Massenmessungen fortfahren.
2. Übertragen Sie die Inhalte des Snap-Cups bis 25 mL Runde untere Kolben. Spülen Sie jede Snap-Tasse in die Rundboden-Flasche mit ca. 2,5 mL des entsprechenden Lösungsmittels.
3. Entfernen Sie das Lösungsmittel im Vakuum in einem Drehverdampfer bei 40 ° C. Festlegen der Ausgangsdruck, 30 000 Pa bis der Großteil der Lösungsmittel entfernt. Reduzieren Sie den Druck bis 100 Pa und trocknen die Probe unter Drehung für ein Minimum von 2 h. erhalten einen einheitliche trocken Lipid-Film auf die Glaswände des Kolbens.
4. Legen Sie die trockenen Lipid-Film für 1 Minute unter einen stetigen Strom von Argon zu vermeiden Lipidoxidation in Luft und speichern die Probe in der Tiefkühltruhe vor Rehydratation.
Hydratation der trockenen Lipid-film
1. Fügen Sie 3 mL Phosphatpuffer in den Rundboden-Kolben, eine total Lipidkonzentration von 15 mM zu erreichen.
2. Führen Sie ein Einfrieren Auftauen (FT) Zyklus durch Eintauchen des Kolbens unter Drehung in flüssigem Stickstoff bis es gefroren ist gründlich (der Flüssigstickstoff hält Sieden), dann Hitze zurück bis zu 60 ° C indem man die Probe für 5 min in ein Wasserbad, wirbeln die Küvette kontinuierlich zu den Schmelzprozess zu unterstützen. Gelten 30 s vortexen vor jeder Gefrierzyklus bei die Probe flüssig ist zugunsten die Hydratation der Lipid-Film.
  Hinweis: Keine Lipid-Film sollte an den Kolben Wänden sichtbar sein, nachdem die zweite Einfrieren Auftauen Zyklus.
3. Wiederholen Sie 1.3.2 zu insgesamt fünf Mal. Schließen Sie die Flasche mit einer Kappe zu vermeiden unnötige Verdunstung des Phosphatpuffer, wenn die Probe heiß ist. Das Protokoll kann angehalten werden, wenn die Probe gefroren ist.
4. Fahren Sie mit zwei Heizen und kühlen (H & C) Zyklen zu stabilisieren die Probe aus der letzten eisigen Schritt oder halten bis zu zwei Monate lang gefroren. Erhitzen Sie die Probe auf 40 oder 60 ° C für DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molares Verhältnis 4:1:1) oder DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (Molverhältnis 16:4:5:5), bzw. vor Abkühlung auf 5 ° C 1 ° C/Min., pflegen die Probe 5 min bei der maximalen und minimalen Temperaturen des Zyklus.
5. Nun, entweder bestimmen die Doppelbrechung Signal der Probe in einem äußeren Magnetfeld (Schritt 2) oder weitere Extrudieren die Probe die Bicelle Dimensionen und magnetische Alignability (Schritt 1.4) anpassen.
  Hinweis: DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molares Verhältnis 4:1:1) Proben sind hauptsächlich bestehend aus Bicelles mit einer mittleren hydrodynamischen Durchmesser D_H 70 nm eine Anzahlverteilung ergab gewonnenen dynamische Lichtstreuung (DLS) Messungen bei 5 ° C. Diese Proben enthalten auch größere Polymolecular Baugruppen mit einer mittleren D_H 500 nm eine Intensitätsverteilung ergab. DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (Molverhältnis 16:4:5:5) Proben sind höchst Polydisperse mit typischen Intensitätsverteilungen enthüllt eine mittlere D_H 700 nm, während die Anzahl Verteilungen eine Bevölkerung zeigen von kleineren dominiert Bicelles in der Größenordnung von 200 nm. Weitere detaillierte Größenverteilung und Cryo Transmission Electron Microscopy Bilder dieser Proben wurden von Isabettini Et Al. berichtet ²³
Extrusion von Polymolecular Baugruppen.
1. Montieren Sie den Extruder, wie in Abbildung 3dargestellt. Verwenden Sie Handschuhe und Pinzette mit Kieselsäure Rohre für Handhabung zu schützen. Befeuchten Sie das Filterpapier (5) mit ein paar Tropfen des Puffers, um eine optimale Platzierung der Membranfilter (6) zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass das Papier keine Falten hat, nach dem Platzieren der o-Ring (7) an der Spitze.
  Hinweis: Im Extrusionsverfahren wurde getestet auf Membranfilter (6) mit einem Porendurchmesser von 800, 400, 200 und 100 nm; siehe Abbildung 7.
2. Legen Sie das Wasserbad auf 40 ° C für DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molares Verhältnis 4:1:1) Proben oder 60 ° C für DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (Molverhältnis 16:4:5:5) Proben um die Bildung von extrudierbaren Vesikeln zu garantieren.
3. Verbinden Sie den Extruder mit einer unter Druck stehenden Stickstoff-Flasche mit einem Hochdruck-PVC-Rohr (> 4 MPa) mit Serto-Adapter ausgestattet und extrudieren Sie das flüssige Material durch die Membran. 1 MPa Druck ist in der Regel erforderlich für Extrusion durch Membranfilter (6) mit einem Porendurchmesser von 200 nm und höher. 1,5 bis 2,5 MPa sind erforderlich für die kleineren Membranfilter (6) mit einem Porendurchmesser von 100 nm.
  Hinweis: Ändern die Membranfilter, wenn ungewöhnlich hohe Drücke (> 2,5 MPa) sind erforderlich, um die Probe Extrudieren (Dies ist das erste Zeichen einer Verstopfung).
4. Öffnen Sie die Abdeckung (10) und legen Sie die Probe mit einer 2 mL-Glas-Pipette. Dann schließen Sie die Abdeckung (10) und öffnen Sie das Druckventil (12) halten Sie das Probenröhrchen Outlet (2). Schließen Sie das Druckventil (12) nach der Extrusion-Zyklus abgeschlossen ist, entlüften und weiter mit dem nächsten Zyklus.
  Hinweis: Lassen Sie die Probe nicht im Kontakt zu lange mit dem heißen doppelwandigen Behälter (8), übermäßige Probenverlust durch Verdunstung zu vermeiden.

30-60 s ist genug Zeit für eine 3 mL Probe im Extruder equilibrate vor dem Öffnen des Druckventil (12).

Fahren Sie mit 10 Extrusion Zyklen für einen bestimmten Membran Pore Dimension wie in Abbildung 3dargestellt. Die meisten Bicelle Systeme werden extrudiert 10mal durch Membranen mit einem Porendurchmesser von 200 und einem anderen 10mal durch Membranen mit einem Porendurchmesser von 100 nm, Probe Vergleichbarkeit zu gewährleisten.

Jetzt bestimmen Sie die Doppelbrechung Signal der Probe in einem äußeren Magnetfeld (Schritt 2).

figure-protocol-1
Abbildung 3: Labor-Extruder für Bicelle und telson Vorbereitungen verwendet. Der Extruder setzt sich aus den unteren bis: Mount (1), (2) Probe Raum mit Kunststoff Auslaufrohr 2,4 mm (Innendurchmesser) und o-Ring (3) und (4) große und kleine stabilisierende Mesh (5) Filterpapier, (6) Membranfilter, (7) o-Ring (8) doppelwandigen Behälter sammeln (9. ) top-Cover mit Einlauf und Druck Verbindung, (10) Abdeckung, (11) Schmetterling Schrauben (12) Druckventil. Eine Skizze des montierten Extruders wird von der rechten Seite angezeigt. Stickstoff (N₂) erfolgt über einen Druckbehälter und doppelwandige Behälter (9) mit einem Wasserbad zur Temperaturregelung verbunden ist. Die Probe wird 10 Extrusion Zyklen für jede gegebene Membran Filter Porendurchmesser (Beispielpfad in blau dargestellt). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

(2) Doppelbrechung Messungen der DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molares Verhältnis 4:1:1) und DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (Molverhältnis 16:4:5:5) Polymolecular Baugruppen.

Bauen Sie und verbinden Sie die Doppelbrechung Setup wie in Abbildung 4 dargestellt und versorgen Sie die entsprechenden elektronischen Elemente mit Strom. Stellen Sie nicht die PEM, die Probe und den zweiten Polarisator in der Laser-Pfad in diesem Stadium. Zu vermeiden, erkennen von zurückgestreute Laserlicht durch reflektierende Oberflächen, zum Beispiel Aluminium Spiegelhalter mit schwarzem Papier abdecken.
Passen Sie die Spiegel um die Laserstärke am Detektor, vertreten durch die Intensität des Gleichstroms zu maximieren aus dem Tiefpassfilter in Abbildung 4 bgewonnen.
Achtung: Tragen Sie geeigneten Augenschutz, wenn die Spiegel einstellen und mit einem Laser-Sicherheit-Trainer zu konsultieren Sie, wenn Laser zum ersten Mal bearbeiten.
Biegen Sie die erste gekreuzten linearen Polarisator (gepflegt senkrecht zu den einfallenden Laserstrahls) zur Maximierung der .

figure-protocol-4
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Doppelbrechung Setup und Anschlüsse für die optischen Signale. A) einen supraleitenden Elektromagneten liefert ein 5,5 T Magnetfeld. Das Licht von einem Diodenlaser bei 635 nm ist von zwei gekreuzten Polarisatoren polarisiert. Spannungsoptische Modulator PEM-90 arbeitet mit 50 KHz mit einer Amplitude₀ von 2,405 rad und platziert zwischen zwei Polarisatoren. Die Probe liegt in den Magneten zwischen PEM und den zweiten Polarisator. Non-polarisierende Spiegel lenkt das Licht durch die verschiedenen Elemente und schließlich von einem Photodetektor erfasst wird. Die erste und zweite harmonische figure-protocol-5 und figure-protocol-6 des AC-Signals werden überwacht, erlaubt die Berechnung der Doppelbrechung Signal geben Informationen über die magnetische Alignability des Ln^{3 +} chelatisierenden Polymolecular Baugruppen. Die Probe-Küvette ist mit einem externen Wasserbad zur Temperaturregelung (blau) verbunden. Die Temperatur der Probe wird mit einem Temperaturfühler (rot) überwacht. B) das Signal von der Photo-Detektor wird eine zweite Bestellung Sallen-Key Tiefpass-Filter (24 V AC Stromversorgung) mit einer Trennfrequenz von 360 Hz durch ein ±12 VDC Tunnelschnur Stromversorgungskabel (3) zugeführt. Der Tiefpassfilter Auszüge der Gleichanteil figure-protocol-7 und liefert sie an die PC-Schnittstelle (4) über ein Ω Kabel BNC 50. Das Signal aus dem Photo-Detektor ist auf die zwei Lock-in Verstärker geliefert (das Extrahieren der ersten und zweiten harmonisches figure-protocol-8 und figure-protocol-9 ) durch ein BNC 50 Ω Kabel (1) & (2). Die harmonischen Intensitäten werden durch eine Phase-Sensitive-Erkennung erkannt. Infolgedessen wird das PEM-Signal als Referenzsignal der Lock-in-Verstärker (1f-Ausgabe von PEM in der ersten Lock-in-Verstärker und 2f-Ausgabe in der zweiten, verbunden mit BNC 50 Ω Kabel) verwendet. Die Ausgangssignale werden auf die PC-Interface-Einheit durch BNC 50 Ω Kabel geliefert. Analoge Erwerb Einheiten GFP-AI-110 und GFP-CB-1 digitalisieren das Signal, das über eine RS 232-Kabel für die Überwachung an den Computer übertragen wird. Temperaturfühler Typ K ist auch an die PC-Schnittstelle angeschlossen wo analoge Erwerb Einheiten GFP-CB-3 und GFP-TC-120 das Signal digitalisieren vor der Übertragung auf den Computer über eine RS 232-Kabel für die Überwachung. (C) Bild des schematischen Setups in B. Kernelemente vorgestellt werden identifiziert, mit entsprechenden Zahlen von 1 bis 4. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ort der zweiten gekreuzten linearen Polarisator senkrecht zu den einfallenden Laserstrahls, wie in Abbildung 4Adargestellt. Minimierung der durch den zweiten Polarisator in einem 90°-Winkel die erste festlegen.
Ort der spannungsoptische Modulator (PEM) bei 0° zwischen zwei gekreuzten lineare Polarisatoren und senkrecht zu den einfallenden Laserstrahls wie in Abbildung 4Adargestellt. Passen Sie PEM auf eine Frequenz von 50 kHz und Amplitude A0, 2,405 rad an, wie in Abbildung 5Agezeigt. Der Gleichanteil wird dadurch unabhängig von Doppelbrechung und steigert die .
Hinweis: Die optische Achse des PEM kann abgestimmt werden, um ein paar Grad konstant zu halten in Luft vor der Messung einer Probe.
Warten Sie 1 Stunde nach dem Einschalten der Laser- und elektronische Geräte, das Signal zu stabilisieren.

Das Signal ist stabil, sobald der Auto-Ausstieg der Lock-in Verstärker konstant bleibt.

Legen Sie die Probe in einem temperaturgeregelten Quarz Küvette mit einer Weglänge von 10 mm und verbinden Sie es mit einer externen Wasserbad anfänglich bei 5 ° C.

Platzieren Sie ein 0,5 mm dicken Typ K Thermoelement (Temperaturfühler) direkt in der Probe zur Überwachung der Temperatur der Probe. Stellen Sie sicher, dass die Sonde mit dem Laserlicht nicht stört, indem man ein Weißbuch in der Laser-Pfad (nach der Küvette) und auf der Suche nach Schatten durch die Sonde verursacht.
Hinweis: Es ist ein 2-3 ° C Unterschied zwischen der Aufnahme der Temperatur des Wasserbades und die Temperatur der Probe.

Platzieren Sie die Küvette in die Bohrung des Magneten, wie in Abbildung 4Adargestellt. Das Laserlicht breitet sich horizontal durch die Probe, durch nicht polarisierenden Spiegel abgelenkt und von einem Photodetektor erkannt.
Hinweis: Der Laser richtet sich nach unten, durch die Probe und sichern Sie den gleichen Pfad um Faraday Effekte (z. B. die Drehung der Polarisationsebene des Lichtes durch das Magnetfeld verursacht, wenn hinunter abgebrochen wird, bei seiner Rückkehr in die entgegengesetzte Richtung) zu berücksichtigen.

Wenden Sie einen stetigen Luftstrom der komprimierten Luft bei Raumtemperatur und 10000 Pa auf die Küvette zur Vermeidung von Kondensation des Wassers auf die Zellwände, die reduzieren die Intensität des Signals und Lärm zu erhöhen. Dies ist besonders wichtig bei der Messung bei 5 ° C.

Erkennen der erste und zweite harmonischen figure-protocol-13

und

des AC-Signals mit zwei Lock-in Verstärker. Auto phase Lock-in Verstärker durch Drücken der Taste (2) in Abbildung 5 b gezeigt und die Empfindlichkeit einstellen, wie in Abbildung 5 b (1) gezeigt. Stellen Sie sicher, dass es nicht mehr als vier rote Balken auf die Verstärker wie in Abbildung 5 b (3) gezeigt, dass Signal Überlastung zu vermeiden. Notieren Sie sich die Beschäftigten Empfindlichkeit für beide Lock-in-Verstärker in das Programm Tesla_Magnet_Const_V092 , wie in Abbildung 5 (8) dargestellt. Das Programm ist als ergänzende Information zur Verfügung gestellt.

Rampe das Magnetfeld bis 5,5 T durch die Lieferung von Strom an den Magneten durch das Programm Tesla_Magnet_Const_V092 , wie in Abbildung 5 (5) dargestellt.

Erhalten der Doppelbrechung figure-protocol-15

Gleichung 2, wo die Retardierung wird berechnet mit
figure-protocol-16

(3)
wo

und

sind Bessel Funktionen der ersten Art, mit figure-protocol-19

und

. ¹¹ ^, ¹³ ^, ¹⁸ ^, ³³ ^, ³⁴ plot die Retardierung im Programm Tesla_Magnet_Const_V092, wie in Abbildung 5 (4) dargestellt.
Hinweis: Die Verzögerung vom Programm sollte nicht, die Doppelbrechung Signal zu berechnen, wenn zwei Lock-in Verstärker nicht mit der gleichen Empfindlichkeit arbeiten verwendet werden (siehe Punkt 2.12). Die protokollierten harmonischen Intensitäten figure-protocol-21

und

durch die Empfindlichkeit der Lock-in Verstärker zu den korrekten Abmessungen multipliziert werden müssen. Darüber hinaus muss die Doppelbrechung Signal gemessen unter einem Magnetfeld normalisiert werden durch Subtraktion der mittlere Doppelbrechung Signals erhalten bei 0 T.

Überwachen Sie die Probe Doppelbrechung Signal auf konstante oder Änderung der Temperatur (1 ° C/min) durch die Regulierung der Temperatur des Wasserbades verbunden, die Küvette in Abbildung 4dargestellt.

Melden Sie sich die experimentellen Daten durch Ausfüllen der experimentellen Beschreibung in Abbildung 5 (8), bietet einen Dateinamen (9) und drücken der Taste "START Log" (10).

figure-protocol-23
Abbildung 5: Illustrationen der Erwerbstätigen Einstellungen und Programm Screenshots. A) PEM-Einstellungen: Retardierung 2,405 rad, Wellenlänge 635 nm, Frequenz 50 Hz. White Kreise zeigen welche Einstellungen aktiviert werden (USR = benutzerdefinierte Retardierung, LOC = lokaler Betriebsart). B) Lock-in Verstärker-Einstellungen. Die Empfindlichkeit (1) muss vor jeder Messung Bedarf Schritt 2.11 gewählt werden. Es sollte nicht mehr als vier rote Balken auf dem Display (3) um eine Signal-Überlastung zu vermeiden. Eine Überlastung tritt auf, wenn die rote led (1) einschaltet, so dass eine Messung unmöglich. Drücken Sie die Taste Auto Phase (2) vor jeder Messung. C) Screenshots des Programms Tesla_Magnet_Const_V092 als ergänzende Information zur Verfügung gestellt. Das Programm ermöglicht die Kontrolle des magnetischen Feldes und Aufzeichnung der alles, was die Signalausgänge als Funktion der Zeit. Die magnetische Feldstärke und Probentemperatur sind in (1) dargestellt. Die erste und zweite harmonische figure-protocol-24 und figure-protocol-25 des AC-Signals durch die zwei Lock-in Verstärker gemessen werden (2) dargestellt. Die Intensität des Gleichstroms figure-protocol-26 (3) aufgetragen ist. Die Retardierung berechnet wie in Schritt 2.13 beschrieben und dargestellt (4). Die magnetische Feldstärke ist in (5) festgelegt. Die direkte Messung der Temperatur aufgezeichnet durch das Thermoelement Typ K (6) präsentiert und die Ausgangssignale ( figure-protocol-27 und figure-protocol-28 ) (7). Zusätzliche Probeninformationen kann in (8) wie die Beschäftigten Empfindlichkeit der Verstärker, Beispielnamen, etc. eingefügt werden. Die Daten können protokolliert und in eine txt-Datei gemäß (9) exportiert werden. Starten und stoppen der Datenerfassung mit der Taste "START Log" (10). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Ergebnisse

Die Doppelbrechung Signal eines nicht-extrudierte DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molares Verhältnis 4:1:1) Probe wurde unter 5,5 T Magnetfeld überwacht, während eine Erwärmung und Abkühlung Zyklus von 5 bis 40 ° C und zurück mit einer Rate von 1 ° C/min (Abbildung 6). Die Doppelbrechung Ergebnisse bestätigten hohen magnetischen Achsen bei 5 ° C mit einem Wert von 1,5 x 10^-5, doppelt so stark wie bei den gemeldeten extrudierten Systemen.

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Diskussion

Eine detaillierte Darstellung der wie Doppelbrechung Messungen in Kombination mit SANS verwendet wurden Experimente um zu bewerten Methoden zur Erzeugung von sehr magnetisch reagieren Ln^{3 +}chelatisierenden Phospholipide Baugruppen ist in Isabettini Et al. ²³ die vorgeschlagene Herstellung Protokolle gelten auch für Baugruppen bestehend aus der längeren DPPC und BPUK-DTPA Phospholipide oder für solche, die chemisch veränderter Steroid Derivate in ihren Bilayer.

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren erkennen des Schweizer Nationalfonds zur Finanzierung der SMhardBi (Projekt Nr. 200021_150088/1). Die SANS-Experimente wurden an der Schweizer Spallation Neutronenquelle SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Schweiz durchgeführt. Die Autoren danken Dr. Joachim Kohlbrecher für seine Führung mit den SANS-Experimenten. Die Doppelbrechung Messaufbau unter hohen Magnetfeldern inspiriert aus der bestehenden Einrichtung im Hochfeld-magnetische Labor HFML, Nijmegen, Niederlande. Wir danken Jan Corsano, Bruno Pfister für seine Hilfe bei der Entwicklung der Elektronik der Doppelbrechung Setup und Daniel Kiechl für den Bau der Frameworks erlaubt feine und einfache Ausrichtung des Lasers und Dr. Bernhard Koller für laufende technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC)	Avanti Polare Lipide	850345P	>99%
1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamin-diethylentriaminpentaacetatsäure, Hexammoniumsalz (DMPE-DTPA)	Avanti Polare Lipide	790535P	>99%
Thulium(III)-chlorid	Sigma-Aldrich	439649	wasserfrei, Pulver, 99,9 % Spurenmetalle Basis
Dysprosium(III)-chlorid	Sigma-Aldrich	325546	wasserfrei, Pulver, 99,9 % Spurenmetalle Basis
Ytterbium(III)-chlorid	Sigma-Aldrich	439614	wasserfrei, Pulver, 99,9 % Spurenmetalle Basis
Chloroform	Sigma-Aldrich	319988	enthält Ethanol als Stabilisator, ACS-Reagenz ≥ 99,8%
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	≥ 99,9%
Cholesterin	Amresco	433	Reinstqualität
D2O	ARMAR Chemikalien	1410	99,8 Atom % D
Reinstwasser	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
elektronisches pH-Messgerät	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm Membranfilter	VWR	515-2028
Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm Membranfilter	VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm Membranfilter	VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm Membranfilter	VWR	515-2032
Whatmann Filterpapier	VWR	230600
25 ml Rundkolben	VWR	201-1352	14/23 NS
3 ml Glas-Schnappbecher	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
2,5 ml Glasspritze	Hamilton
Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat	Merk	1.06342	Salz zur Herstellung von Phosphatpuffer
di-Natriumhydrogenphosphat	Merk	1.06586	Salz zur Herstellung von Phosphatpuffer
Flüssigstickstoff	Carbagas	-
Druckbeaufschlagtes Stickstoffgas	Carbagas-200		bar
Flasche Lipid Extruder 10 ml	Lipex-Vollständig	ausgestattet mit Thermofass
Hochdruck-PVC-Schlauch	GR NETUM -		muss mehr als 4 MPa Serto
Adaptern	Sertot-Nitrilhandschuhe
	VWR-2
ml Glaspipetten	VWR	612-1702	230 mm langer
Diodenlaser	Newport	LPM635-25C
DSP Dual-Phasen-Lock-in-Verstärker	SRS	SR830
Fotodiodendetektor	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, Silizium, photoleitfähig
5,5 T Kryogen Magnetisch	Kryogen/Oerlikon		AG-12 bar He-gekühlt. RW4000/6000 Kompressor, RGD 5/100 TA Kryo-Kopf
Tiefpassfilter zweiter Ordnung	Eigenbau		Lineare Stromversorgung 24V DC, zweite Ordnung, Inbusschlüssel, Grenzfrequenz 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
Photoelastischer Modulator Hinds	instruments	PEM-90
Glan-Thompson Calcit Polarisator	Newport	10GT04	25,4mm
Durchmesser Quarz-Probenküvette	Hellma	165-10-40	Temperaturmesszelle, 0,8 ml, 10 mm Weglänge
Temperaturfühler			Thermocontrol-Typ K, 0,5 mm Durchmesser, Thermokoax
Nichtpolarisierende Spiegel	Newport	50326-1002	25,4 mm
RS 232 Kabel	National Instruments	189284-02	Zum Anschluss an den RS-232 Anschluss an der Vorderseite von Compact FieldPoint Controllern
BNC 50 & Omega; Kabel und Steckverbinder	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	8-Kanal-Analoges Spannungs- und Stromeingangsmodul für Compact FieldPoint
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01	Integrierter Anschlussblock für die Verdrahtung mit kompakten FieldPoint-I/O
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Integrierter isothermer Anschlussblock für die Verdrahtung von Thermoelementen mit dem Modul cFP-TC-120
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120	8-Kanal-Thermoelement-Eingangsmodul für Compact FieldPoint
cFP-1804	National Instruments	779490-01	Ethernet/Seriell-Schnittstelle für NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National Instruments	-
Industrielle Stromversorgung Versorgung	Traco Power	TCL 060-124	100-240V AC
Wasserbad	Julabo	FP40-HE	Kälte-/Heizungsumwälzpumpe

widerstehen

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Magnetische Baugruppen Lipidextrusion DMPC DMPE DTPA cholesteroldotierte Bicellen Ausrichtung durch Magnetfeld Bildung von Vesikelvorstufen temperaturgesteuerte Assemblierung Design polymolekularer Assemblierungen

Fertigung-Verfahren und Doppelbrechung Messungen für die Gestaltung von magnetisch reagieren Lanthanoid-Ionen chelatisierenden Phospholipid-Baugruppen