Phthalsäure Acid Ester-Bindung DNA-Aptamer Auswahl, Charakterisierung und Anwendung eines elektrochemischen Aptasensor

Summary

Ein Protokoll für die in-vitro- Selektion und Charakterisierung von gruppenspezifischen Phthalsäure Acid Ester-Bindung DNA Aptameren wird vorgestellt. Die Anwendung von der ausgewählten Aptamer in einem elektrochemischen Aptasensor ist ebenfalls enthalten.

Abstract

Phthalsäure Acid Ester (PAEs) einer der wichtigsten Gruppen von persistenten organischen Schadstoffen. Die gruppenspezifische Erkennung von PAEs ist sehr erwünscht, aufgrund der schnellen Anbau von Artgenossen. DNA-Aptameren zunehmend als Erkennungselemente auf Biosensor Plattformen angewendet wurden, aber Auswahl Aptamere auf stark hydrophobe niedermolekularer Ziele, wie z. B. PAEs, wird selten berichtet. Diese Arbeit beschreibt eine Perle basierende Methode entwickelt, um gruppenspezifische DNA Aptameren, PAEs auswählen. Die Aminogruppe funktionalisiert Dibutyl Phthalat (DBP-NH₂) wie das Anker-Ziel wurde synthetisiert und an den Epoxy-aktivierte Agarose-Perlen immobilisiert ermöglicht die Anzeige der phthalic Estergruppe an der Oberfläche der Immobilisierung Matrix und Daher ist die Auswahl der gruppenspezifischen Bindemittel. Wir entschlossen die Dissoziation Konstanten der Aptamer Kandidaten durch quantitative Polymerisation Kettenreaktion gepaart mit magnetische Trennung. Die relativen Affinitäten und Selektivität der Aptamere für andere PAEs wurden durch die wettbewerbsfähige Assays bestimmt, wo die Aptamer-Kandidaten der DBP-NH₂ Pre begrenzt waren magnetische Beads angebracht und veröffentlicht, um den Überstand nach Inkubation mit die getesteten PAEs oder andere potenziellen störenden Substanzen. Die wettbewerbsfähigere Assay wurde angewendet, weil sie einen einfache Affinität Vergleich zwischen PAEs bereitgestellt, die keine funktionellen Gruppen für Oberfläche Immobilisierung hatte. Schließlich demonstriert die Herstellung eines elektrochemischen Aptasensor und benutzte es für Gromer und selektive Detektion von bis(2-ethylhexyl) Phthalat. Dieses Protokoll bietet Einblicke für die Aptamer-Entdeckung des anderen hydrophoben kleine Moleküle.

Introduction

Zusammen mit der rasanten wirtschaftlichen Entwicklung ist die Beschleunigung der Industrialisierung und Städtebau, Umweltbelastungen strenger als je zuvor. Typischen Umweltschadstoffen gehören Schwermetall-Ionen, Toxine, Antibiotika, Pestizide, endokrine Disruptoren und persistente organische Schadstoffe (POPs). Neben der Metall-Ionen und Giftstoffe, andere Schadstoffe sind kleine Moleküle, dass ganz oft bestehen aus einer Vielzahl von Artgenossen. Die giftigsten POPs zählen beispielsweise polychlorierte Biphenyle (PCB), polychlorierten Dibenzofuran (PCDFs), polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), polybromierten APEO Ether (PBDE), polychlorierten Dibenzo-....

Protocol

(1) Bibliothek und besser gekleideteres Design und Synthese

1. Die erste Bibliothek und Primer Design.
   Bibliothek (Pool₀): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3 "
   Grundierung (FP) weiterleiten: 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3 "
   Phosphoryliert rückwärts-Primer (PO₄- RP): 5'-PO₄- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3 "
2. Synthetisieren Pool₀FP und PO₄- RP mit standard Phosphoramidit Chemie^18,19,20, und reinigen Sie die DNA durch standard Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Results

Wir entwickelt und synthetisiert die Aminogruppe funktionalisiert Dibutyl Phthalat (DBP-NH₂) als Anker Ziel (Abb. 1F). Wir spielten dann die DNA-Aptamer-Auswahl der PAEs mit DBP-NH₂ als Anker Ziel und im Anschluss an das klassische Ziel Immobilisierung basierende Methode (Abbildung 2). In jeder Runde war eine pilot PCR durchgeführt mit der denaturierten Seite optimieren die Zykluszahl PCR (

Discussion

Ein herausragender Vorteil von Aptameren ist, dass sie erkannt werden, durch die in-Vitro -Methode SELEX, während Antikörper über in Vivo Immunoreactions generiert werden. Daher können Aptamere mit gewünschten Spezifität durchdachte experimentellen Bedingungen ausgewählt werden, während Antikörper auf physiologischen Bedingungen beschränkt sind.

Um die Trennung der gebundenen Sequenzen von freien Sequenzen zu erleichtern, mehrere modifizierten SELEX vor kurzem berichtet wurde.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV-2550	Shimadzu, Japan-Protokoll		, Abschnitt 3.8.2
DNA Engnine Thermocycler, PTC0200	BIO-RAD		Abschnitt 3.5.1.2 und 3.5.2
C1000 Touch	BIO-RAD		Abschnitt 5.3.6 und 6.3
VMP3 Mehrkanal-Potentiostat	Bio-Logic Science, Claix, Frankreich		Abschnitt 7.4, 7.8 und 7.11
Epoxid-aktivierte Sepharose 6B	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	10220020	Argarose-Kügelchen, Abschnitt 2.3 und 3.3
Dynabeads M-270 Carbonsäure-Magnetkügelchen	Invitrogen, USA	420420	magnetische Kügelchen, Abschnitt 5.2. und 5.3
Premix Taq Hot Start Version	Takara, Dalian, China	R028A-Polymerase	, Abschnitt 3.5.1.1
PARAFILM Dichtungsmembran	Bemis, USA	PM-996	Abschnitt 3.6.5
Lambda Exonuclease	Invitrogen, USA	EN0561	Abschnitt 3.7.1.2.Der 10-fache Reaktionspuffer wird zusammen mit der λ Exonuklease vom Anbieter bereitgestellt.
Dr. GenTLE Precipitation Carrier	Takara, Dalian, China	9094	Abschnitt 3.6.2 und 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA-Wiederherstellungskit	Sangon Biotech (Shanghai)	B511135	Abschnitt 4.2
SYBR Gold Nukleinsäure-Gelfärbung	Invitrogen, USA	1811838	Nucelinsäure-Farbstoff, Abschnitt 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq II	Takara, Dalian, China	RR820A	Polymerase-Mix, der Polymerase und dNTPs enthält, Abschnitt 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)	Sigma-Aldrich	CAS: 1132-61-2	Abschnitt 5.2.1
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC)	Invitrogen, USA	CAS: 25952-53-8	Abschnitt 5.2.2
N-Hydroxysuccinimid (NHS)	Sigma-Aldrich	6066-82-6	Abschnitt 5.2.3
mercaptohexanol (MCH)	Sigma-Aldrich	CAS: 1633-78-9	Abschnitt 7.7
Goldelektrode	Shanghai Chenhua	CHI101	Abschnitt 7.4. - 7.11
Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP)	Sigma-Aldrich	CAS: 51805-45-9	Abschnitt 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylenglykol)	Sigma-Aldrich	CAS: 651042-82-9	Abschnitt 7.7
Diethylhexylphthalat (DEHP)	National Institute of Metrology, China	CAS: 117-81-7	Abschnitt 7.11
Tween 20	Sigma-Aldrich	CAS: 9005-64-5	Polyoxyethyllen(20)-sorbaitanmonolaurat
Triton X-100	Sigma-Aldrich	CAS: 9002-93-1	nichtionischer oberflächenaktiver Wirkstoff
PBS	Sigma-Aldrich	P5368	10 mM Phosphatpuffer mit 1 M NaCl, pH 7,4