Methodenartikel

Fisch Sperma Bewertung mit Software und Kühlgeräte

DOI:

10.3791/56823

⸱

28. Juli 2018

 , 
1PROiSER R+D S.L., 2Department of Cellular Biology, Functional Biology and Physical Anthropology, University of Valencia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren der Fisch Sperma Bewertung mit computerunterstützten Spermiogramm und Kühlgeräten. Die Software bietet eine schnelle, genaue und Quantitative Analyse von Fisch Spermienqualität basierend auf Motilität der Spermien, die ein nützliches Werkzeug in der Aquakultur Reproduktionserfolg zu verbessern sein kann.

Zusammenfassung

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Für die Qualitätsbewertung der Gameten gibt es innovative, schnelle und quantitative Techniken, die nützliche Hinweise für die Aquakultur liefern können. EDV-Systeme für Spermiogramm wurden entwickelt, um mehrere Parameter zu messen und eines der am häufigsten gemessenen ist die Beweglichkeit der Spermien.

Zunächst wurde dieser Computertechnologie für Säugetierarten, entwickelt, obwohl es auch für Fisch-Sperma-Analyse verwendet werden kann. Fische haben Besonderheiten, die Spermien Bewertung wie eine kurze Motilität Zeit nach der Aktivierung und in einigen Fällen Anpassung an niedrigere Temperaturen beeinflussen können. So ist es notwendig, sowohl Hardware als auch Software-Komponenten, Motilität Analyse effizienter für Fisch Spermiogramm machen zu ändern. Für Säugetier-Samenzellen wird die Heizplatte verwendet, um optimale Temperaturen von Spermien zu erhalten. Für einige Fischarten ist es jedoch vorteilhaft, eine niedrigere Temperatur zu verwenden, um die Dauer der Motilität, zu verlängern, da das Sperma weniger als 2 min. lang aktiv bleiben. Kühlgeräte sind daher notwendig, über die Zeit der Analyse, einschließlich auf dem optischen Mikroskop Proben bei konstanter Temperatur im Kühlschrank zu lagern. Dieses Protokoll beschreibt die Analyse der Fisch Samenzellenmotilität mit Software für Spermiogramm und neuen Kühlgeräten um die Ergebnisse zu optimieren.

Einleitung

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Die Wirksamkeit der Wiedergabe hängt von der Qualität der beiden Gameten (Eizellen und Spermien)1,2. Dies ist der wichtigste Faktor, der zur erfolgreichen Befruchtung, soll die Entwicklung von lebensfähige Nachkommen3,4beiträgt. Die günstige Bewertung der Gameten Qualität ist das beste Werkzeug für die Definition der Fruchtbarkeit Potenzial einer Probe.

Mischen von Sperma von mehreren Männern, ist eine gängige Praxis bei der Herstellung von vielen aquatischen Nutztierarten4. Jedoch die Spermien Variabilität zwischen Männern zu Spermien Wettbewerb führen kann und folglich nicht alle Männer tragen ebenso zu den gen-Pool-5. In diesem Sinne ist die korrekte Beurteilung der einzelnen Ejakulat/Spermien Features, z. B. Motilität, grundlegend für diskriminierend über einzelne männliche Fruchtbarkeit potenzielle informieren. Direkter Beobachtung der Beweglichkeit der Spermien kann ungenaue und subjektiven Daten produzieren, wie es erfordert Zeit und Erfahrung, führt zu einem Mangel an Konsistenz und Unvereinbarkeit der Ergebnisse6,7. Allerdings gibt es viele innovative, schnelle und quantitative Techniken, die eine zuverlässige Spermien Qualität Analyse2,4bieten können.

Computergestützte Spermiogramm wurde entwickelt, um genaue Daten über Spermien Qualität8bieten. Diese Technologie umfasst die Entwicklung von Software verbunden mit einem Phase-Kontrast-Mikroskop, mit dem die Beurteilung der Beweglichkeit der Spermien können. Ein limitierender Faktor der Motilität Parameter ist jedoch die Frame-Rate der Videokamera. Einzelne Bahnen auf Spermien basieren Spermien Kopf Zentroid Position in aufeinanderfolgenden Rahmen von Videoaufnahmen, die mit den flagellar Bewegung Muster3,9,10, korreliert ist 11. die wichtigsten kinetischen Parameter gemessen sind die lineare Geschwindigkeit (VSL), krummlinigen Geschwindigkeit (VCL) und durchschnittliche Bahngeschwindigkeit (VAP). VSL ist der Abstand zwischen den Start- und Endpunkt durch die Spermien geteilt durch Zeit genommen. VCL ist die reale Geschwindigkeit entlang der präzise Flugbahn genommen durch die Spermien. VAP ist die Geschwindigkeit auf eine abgeleitete geglätteten Weg der Flugbahn. Diese Parameter ermöglichen zusätzlichen kinetische Informationen, einschließlich Linearität (LIN), Geradheit (STR), wackeln (WOB) und schlagen Messungen wie Amplitude der seitlichen Kopfbewegung (ALH) und Beat-Kreuz Frequenz (BCF)4,10.

Die Sperma-Analyse-System wurde ursprünglich für Säugetierarten verwendet, und eine der Voraussetzungen für das System ist bei der Körpertemperatur des Spenders (etwa 37 ° C) betrieben. Diese Software könnte auch für Fischarten verwendet werden; Obwohl es einige Anpassungen, die Fehler der Spermien Analyseergebnisse zu reduzieren muss. Bei einigen Fischarten wie Salmoniden und Aal8,12tritt Befruchtung bei niedriger Temperatur (ca. 4 ° C)2,4. Kühlgeräte sollten so entwickelt werden, um unangenehme Arbeitsbedingungen zu vermeiden. Darüber hinaus Fisch Spermien sind in der Samenflüssigkeit unbewegten und erfordern einen osmotischen Schock, Motilität zu aktivieren. Für Süßwasserarten sollte das Aktivator Medium hypotone Osmolalität haben, während das Medium für Meerestiere hypertonen sein sollte. Allerdings könnte für einige Arten als Salmoniden, die Ionenkonzentration auch wichtig3,4,9sein. Nach der Aktivierung ist Fisch Sperma gekennzeichnet durch einen raschen Rückgang der Motilität (weniger als 2 min.)13,14 und hoher Geschwindigkeit, wird entscheidend für die optimale Bildrate zu zuverlässigen Daten15bestimmen.

Die Ziele dieser Studie sind design und Kühlanlagen für Fisch Spermaproben anwenden. Dieses Protokoll definiert zudem die optimale Frameraten für die Einrichtung von Standardprotokollen je nach Tierart zu bestimmen. Die Verwendung dieses Protokolls öffnet neue Türen im Zusammenhang mit Fisch bahnbrechenden Bewertung, mit der europäische Aal als Modell.

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Protokoll

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Verfahren mit tierische Probanden wurden genehmigt (2015/VSC/Erbse/00064) durch die allgemeine Ausrichtung der landwirtschaftlichen Produktion und Vieh an der Universitat Politècnica de València.

1. sammeln Sie Sperma aus reifen europäischen Aale in Gefangenschaft

Hinweis: Verwendung europäischer Aal Männchen im Becken mit Meerwasser und ein Kreislaufsystem bei konstanter Temperatur (20 ° C) beibehalten. Behandlung mit Hormonen durch wöchentliche intraperitoneale Injektion (humanes Choriongonadotropin (hCG); 1,5 IU pro g Fisch Körpergewicht). Akklimatisieren Sie allmählich mit 3 Tage in Süßwasser Fische gefolgt von Ersatz mit Meerwasser (1/3 des gesamten Wassers im Tank) alle 2 Tage bis zum Erreichen einer Salinität von 37,0 g/mL.

  1. Betäuben Sie Aal 24 h nach der Hormon-Injektion, Proben mit bessere Qualität der Spermien zu erhalten.
    1. Im Vorfeld die Narkose bereiten: 100 mL 70 % igem Ethanol 300 mg Benzocain hinzufügen. Gut mischen und bei 4 ° c Lagern
    2. Verdünnen Sie Benzocain in einem flexiblen Eimer mit 5 L System Wasser um eine Endkonzentration von 60 mg/L und richtig mischen.
    3. Übertragen Sie den Fisch in den Eimer mit Wasser und Benzocain. Warten Sie einige Minuten, bis die Fische beruhigen.
  2. Deaktivieren Sie den Genitalbereich mit Wasser und trocknen Sie mit saugfähigem Papier zur Vermeidung von Kontaminationen von Spermaproben von Kot, Urin oder Meerwasser.
  3. Üben Sie sanften Druck im Bauchbereich und sammeln Sie die Spermaproben in 15 mL Kunststoffrohre mit der Vakuumpumpe. Spermavolumen bis zu 6-7 mL, abhängig von der männlichen.
  4. Halten Sie Spermaproben bei 4 ° C für mindestens 1 h bis Motilität Analyse durchgeführt wird.

(2) im Kühlschrank lagern Sie und verdünnen Sie die Spermaproben

  1. Verdünnungsmittel Lösung im Voraus zubereiten.
    Hinweis: Die Spermaproben sollten in der Extender-Lösung speziell für jede Art verdünnt werden.
    1. Aal Spermaproben (P1 Medium)-Aktivator Medium vorbereiten. 0,42 g Natriumbicarbonat, 1,828 g Natriumchlorid, 0,127 g Magnesiumchlorid, 0,56 g Kaliumchlorid und 0,037 g Calciumchlorid, 250 mL destilliertem Wasser zugeben. Mischung gut aufzulösen. Shop bei 4 ° C.
  2. Setzen Sie den Kühler bei 4 ° C Proben bei einer konstanten Temperatur zu halten. Warten Sie, bis die Temperatur stabilisiert.
  3. Verdünnen Sie die Spermaproben mit Verdünnungsmittel Lösung für jede Art bestimmten.
    Hinweis: Das Verdünnungsverhältnis ist bestimmte Arten und muss definiert werden, um das Protokoll zu standardisieren. Erstens schätzen Sie samenzellenkonzentration basierend auf die Konzentration, die in der Pre-Analyse der Motilität mit Software, wie in den Schritten 3 und 4 beschrieben. Mit dieser Analyse ist es auch möglich, die besten Spermaproben ausgehend vom prozentualen Anteil der Motilität zu wählen. Danach kann der Forscher starten, Daten für das Experiment mit der besten Proben mit der richtigen Konzentration zu sammeln.
    1. Verdünnen Sie Aal Spermaproben P1 mittelfristig mit einem Verhältnis von 01:50. Fügen Sie um 500 µL verdünnt Aal Sperma vorzubereiten, 50 µL der Probe frisches Sperma und 450 µL P1. Mischen Sie gut.

(3) die Spermien-Motilität-Parameter auswerten

  1. Aufbau der Motilität-Modul der Software
    1. Bühne frei bei 4 ° C kühler und warten, bis es stabilisiert.
    2. Öffnen Sie die Software und wählen Sie Motilität Modul. Erstellen Sie Benutzernamen und Passwort, falls erforderlich.
    3. Wählen Sie Eigenschaften und wählen Sie die gewünschten Parameter vor dem Start das Spermiogramm.
      1. Klicken Sie auf Arten | Fisch.
      2. Wählen Sie die Frames pro Sekunde und Anzahl der Bilder, die besten technischen Voraussetzungen für jede Art. Legen Sie beide Optionen mit 120 Bildern pro Sekunde.
      3. Negativer Kontrast zu wählen. Es ist zwingend erforderlich für die genaue Rekonstruktion der Spermien Trajektorien16.
      4. Wählen Sie die entsprechende Kammer zählen und Maßstab der Videokamera. Kalibrieren Sie die Video-Kamera für die Vergrößerung Objektiv in das Experiment verwendet. Festlegen Sie SpermTrack10 als Zählkammer und 10 X-Skalierung.
        Hinweis: In der Regel eine Tiefe von 10 µm in der Zählkammer und eine vergrößerungslinse von 10 X sind die empfohlenen Bedingungen da sie bieten eine bessere Fokussierung von alle Spermien und die höchste Anzahl an Zellen zu erfassen. Es wird jedoch empfohlen, eine frühere Studie über die optimalen Bedingungen für die Motilität Analyse der einzelnen Arten zu machen.
      5. Passen Sie die Partikel Bereich und Konnektivität für jede Spezies. Stellen Sie minimale Partikel Bereich bei 2 µm2 und Konnektivität bei 7 µm.
        Hinweis: Für Fisch hängt der Minimalwert der Partikel Gebiet erstreckt sich zwischen 2 bis 5 µm und Konnektivität die Geschwindigkeit der Spermien und die Frame-Rate.
      6. Speichern Sie das Setup.
    4. Wählen Sie erfassen.
  2. Europäischer Aal Spermien mit Software zu analysieren
    1. Bereiten Sie die Aktivator-Lösung (künstliches Meerwasser) indem Sie 25 mL destilliertem Wasser mit 2 % BSA 0,946 g kommerziellen Salz hinzufügen.
    2. 500 mL Aktivator-Lösung (künstliches Meerwasser) und in den Kühler.
      Hinweis: im Allgemeinen ist Fisch Sperma von einem osmotischen Schock-Ereignis aktiviert obwohl für einige Arten der Ionenkonzentration auch wichtig sein könnte. Für Süßwasserarten sollte das Aktivator Medium hypotone Osmolalität haben, während das Medium für Meerestiere hypertonen sein sollte.
    3. Setzen Sie Zählkammer unter der kühlenden Bühne und warten Sie, bis die Temperatur um 4 ° c stabilisiert
    4. Mischen Sie die Aktivator und verdünnten Sperma Spermien aktivieren und starten Sie die Motilität Videoaufnahme zwischen 5-10 s nach der Aktivierung.
      1. Nehmen Sie 4 µL Aktivator-Lösung und Platz in der Zählkammer.
      2. Homogenisieren Sie schonend verdünnten Sperma durch Schütteln der Microcentrifuge 3 Mal um Schäden in den Samenzellen Zellen zu vermeiden.
      3. Nehmen Sie 0,5 µL verdünnter Sperma, mischen mit dem Aktivator und setzen Sie die Abdeckung in der Zählkammer schnell.
        Hinweis: Dieser Schritt dauert nicht mehr als 5 s, um die Analyse so schnell wie möglich zu starten.
      4. Konzentrieren Sie sich auf die Samenzellen Zellen und finden Sie den besten visuellen Bereich, die durch eine geringe Anzahl von Spermien (150 bis 200 Zellen) zu abhören zwischen Zellen (ergänzende Abbildung 1A) definiert wird. Wählen Sie Video aufnehmen , um die Spermien-Spuren zu erhalten, die je nach Geschwindigkeit voneinander getrennt sind.
      5. Wählen Sie erfassen , 3 bis 7 Felder der optimale Abstand sind zu erhalten eine geringere Variabilität in den Ergebnissen, und wie zuvor Verfahren zu erwirken. Videos aufnehmen bis 120 s nach Aktivierung zur Vermeidung von Kondensation auf dem Cover von der Zählkammer.
      6. Wählen Sie Exit , einen Überblick über alle Felder zu haben.

4. Motilität Daten zu erhalten

  1. Wählen Sie Felder aus | Partielle | Speichern Sie und wählen Sie einen Dateinamen ein. Klicken Sie auf Speichern.
    Hinweis: Die Tabelle bietet Mittelwerte der partiellen Daten, Diagramme und Bilder der Spermien Tracks.
  2. Wählen Sie allgemeine Daten | Dateiname | Speichern.
    Hinweis: Die Daten geben kinetische Werte für einzelne Spermien aus allen Bereichen.

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Ergebnisse

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Analyse der Zeit-Effekt auf die Beweglichkeit der Spermien

Im Falle der europäische Aal, der Prozentsatz der statischen Spermien erhöht von 15 s bis 120 s nach Aktivierung (von 24,4 % auf 40,7 %) und der Anteil der mobilen progressive Spermien verringert (von 36,9 % auf 20,9 %) (Abbildung 1A und 1 b). Basierend auf Geschwindigkeit, Samenzellen Zellen zeigten eine Ab...

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Diskussion

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Für verschiedene Arten, darunter Fisch ist die Sperma-Analyse-Software in diesem Protokoll verwendeten von Forschern weltweit eingesetzt. Fische haben jedoch einige Besonderheiten, die die Spermien Bewertung beeinflussen können. Fisch-Spermien zeigte high-Speed im Moment der Aktivierung, die schnell sinkt und führt zu einer kurzen Zeit der Motilität nach der Aktivierung. Außerdem die Temperatur der Reproduktion ist Spezies-abhängig, und in einigen Fällen könnte um 4 ° C2,

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Dieses Projekt wird finanziell unterstützt von der COST-Vereinigung (Lebensmittel und Landwirtschaft COST Action FA1205: AQUAGAMETE und der Europäischen Union Programm Horizont 2020 Forschung und Innovation unter Marie Sklodowska-Curie Projekt IMPRESS (GA Nr. 642893). Wir möchten das Wissenschaftlerteam des PROiSER, speziell für den Schüler Alberto Vendrell Bernabéu, für seine aktive Mitarbeit in der Videoaufzeichnung dieses Projektes danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Humanes ChoriongonadotropinArgent Chemical LaboratorieshCGHormon
BenzocainMerckE1501 SigmaAnästhesie
NatriumbicarbonatMerckS5761 Sigma P1 mittel
NatriumchloridMerck1.06406 EMD MilliporeP1 Medium
MagnesiumchloridMerck1374248 USPP1 Medium
KaliumchloridMerckP3911-500GP1 Medium
CalciumchloridMerckC7902-500GP1 Medium
HandelssalzAqua Medic MeersalzAktivator-Lösung 
BSAMerck05470 SigmaAktivator-Lösung 
Falcon Röhrchen 15 mlMerckT1943-1000EA
Falcon Röhrchen HalterungMerckR5651-5EA
EppendorfsMerckT9661-1000EA
Mikropipette 20 & Mikro; lGilsonPIPETMAN® Classic
Mikropipette 10 & Mikro; lMerckZ683787-1EA
Spitzen für Mikropipetten 20 & Mikropipetten lMerckZ740030-1000EA
Spitzen für Mikropipetten 10 & Mikropipetten; lMerckZ740028-2000EA
SpermtrackPROiSERZählkammer
TruMorphPROiSERTruMorph
Mikroskop UB 200i SeriePROiSERMikroskop
KühlplattePROiSERPrototyp
KühlblockPROiSERPrototyp
ISAS v1PROiSERISAS Software

Referenzen

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