Eine neuartige In-vitro- Wunde heilende Assay Zellwanderung bewerten

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Bewertung der Wirkung der Peptide auf die Migration von bronchialen Epithelzellen. Diese Methode ermöglicht die schnelle und hoch reproduzierbare Einholung der quantitativen Daten über die Geschwindigkeit der Zelle Migration und Wunde Schließung.

Zusammenfassung

Das Ziel dieser Arbeit soll eine neuartige Methode, um die Fähigkeit von einigen immunmodulatorischen Molekülen wie antimikrobielle Peptide (AMPs), Förderung der Zellwanderung bewerten zu zeigen. Wichtiger ist die Zellwanderung eine Bandbreitenbegrenzung Veranstaltung bei der Heilung von Wunden, die Integrität und die normale Funktion der Gewebeschichten nach Verletzung wieder herzustellen. Der Vorteil dieser Methode gegenüber der klassischen Test, basiert auf einen manuell gemacht Kratzer in einer Zelle monomolekularen Film, ist, dass die Verwendung von speziellen Silikon Kultur fügt mit zwei Fächern um eine zellfreie Pseudo-Wunde Feld mit einer klar definierten Breite (500 μm zu erstellen ). Durch eine automatisierte Analyseplattform ist es darüber hinaus möglich, quantitative Daten über die Geschwindigkeit der Wunde Schließung und Zelle Migration schnell zu erhalten. Genauer gesagt, wird die Wirkung von zwei Frosch-Haut-AMPs auf die Migration der bronchialen Epithelzellen angezeigt. Darüber hinaus wird Vorbehandlung dieser Zellen mit spezifischen Inhibitoren auf die molekularen Mechanismen, die solche Ereignisse informieren.

Einleitung

Es ist weitgehend bekannt, dass die Wundheilung bei Tieren ist ein fundamentaler Prozess die Integrität und die normale Funktion der Gewebeschichten nach Verletzung¹wieder herzustellen. Trotz epithelialen Oberflächen der äußeren Umgebung (z. B. der Atemwege, Haut und Magen-Darm-Trakte) bilden eine schützende Barriere von physikalischen und chemischen Beleidigungen, die Bildung von Wunden kann leicht auftreten, vor allem nach Chirurgie oder mikrobielle Infektionen². Wie beispielsweise Besiedlung des Lungengewebes durch opportunistische bakterielle Erreger Pseudomonas Aeruginosa, vor allem bei zystischer ....

Protokoll

1. Zelle-Vorbereitung

1. Samen 2.5x10⁶ Zellen in 10 mL von Minimum wesentliches Medium (MEM) ergänzt mit 2 mM Glutamin (MEMg), plus 10 % fetalen bovine Serum (FBS), Antibiotika (0,1 mg/mL Penicillin und Streptomycin) und Puromycin (0,5 µg/mL für die Auswahl und Pflege der Zelllinie) in einem Kolben T75. Inkubieren Sie die Flasche bei 37 ° C und 5 % CO₂ , für 2 Tage. Überprüfen Sie vor Beginn des Experiments, Zusammenfluss von Zellen unter einem inversen Mikroskop.
   Hinweis: Für das Experiment verwendeten Zellen sind unsterblich menschlichen bronchialen Epithelzellen mit einem Lentivirale Vektor verleiht Resistenz gegen Puromycin ausgestr....

Ergebnisse

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die heilende Wirkung von Esc(1-21) und Esc(1-21) - 1 c in Bezug auf die Zellaktivität Migration induzierten auf bronchialen Epithelzellen, die mit dem Ausdruck der funktionellen CFTR Wunde zu bestimmen. In diesem Test wurden Kultur Einsätze in Vertiefungen der 12-Well-Platte gegeben und jedes Fach war ausgesät mit 35.000 Zellen in MEMg ergänzt mit 10 % FBS. Die Zellen erreicht komplette Zusammenfluss innerhalb 24 Std. danach, eine 500 μm Lücke wurde ge.......

Diskussion

Zellmigration ist ein wesentlicher Prozess in vielen physiologischen und pathologischen Veranstaltungen einschließlich der Wundheilung, Embryonalentwicklung und Krebsmetastasen. Das grundlegende Verfahren zur Zelle Migration in-vitro- Studie beinhaltet: (i) die Schaffung einer Zelle Monolage, (Ii) die Produktion einer Pseudo-Wunde in der konfluierende Schicht von Zellen, (Iii) die Erfassung der Bilder in unterschiedlichen Zeitabständen bis Wunde Schließung erreicht ist , und (iv) die Analyse der Bildfolge um die.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Minimum essential medium (MEM)	Euroclone	ECB2071L	Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
Glutamin	Euroclone	ECB3000D
Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS)	Euroclone	ECS0180DH
Penicillin und Streptomycin	Euroclone	ECB3001D
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833
Trypsin/EDTA 1X in PBS	Euroclone	ECB3052D	Vor Gebrauch bei Raumtemperatur
erwärmen DPBS ohne Calcium und Magnesium (CMF-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
DPBS mit Calcium und Magnesium (PBS)	Sigma-Aldrich	D8662
Ibidi Kultur-Einsatz 2 Vertiefung	Ibidi	80209
Wimasis Bildanalyse	Ibidi	30002
PRISM Software	GraphPad	Version 6.0