Method Article

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

DOI:

10.3791/56837

⸱

March 8th, 2018

 ,  , 
1Donald Danforth Plant Science Center, 2Department of Biological Sciences, The University of Alabama

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau aus Herbarium Material einschließlich Rettung von sehr schlechter Qualität DNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herbarien sind eine unschätzbare Quelle von pflanzlichem Material, das in einer Vielzahl von biologischen Studien verwendet werden kann. Die Verwendung von Herbar ist verbunden mit einer Reihe von Herausforderungen einschließlich Probenqualität Erhaltung geschädigter DNA und destruktive Probenahme seltene Exemplare. Um effektiver Herbarium Material in großen Sequenzierung Projekten verwenden, ist eine zuverlässige und skalierbare Methode der DNA-Isolierung und Bibliothek Vorbereitung erforderlich. Dieses Papier zeigt eine robuste, Anfang-Ende Protokoll für DNA-Isolierung und hohem Durchsatz Bibliotheksbau von Herbar, die keine Änderung für Einzelproben erfordert. Dieses Protokoll ist für niedrige Qualität getrocknet Pflanze Material und nutzt vorhandene Methoden durch die Optimierung der Gewebe Schleifen, ändern Bibliothek Größenauswahl und die Einführung eines optionalen Reamplification Schritt für geringe Ausbeute Bibliotheken zugeschnitten. Reamplification von geringer Ausbeute DNA-Bibliotheken kann Proben abgeleitet von unersetzlichen und potenziell wertvollen Herbar, negiert die Notwendigkeit für zusätzliche destruktive Probenahme und ohne erkennbare Sequenzierung Voreingenommenheit für gemeinsame retten. phylogenetische Anwendungen. Das Protokoll ist auf Hunderten von Grasart geprüft worden, aber wird voraussichtlich nach Prüfung für den Einsatz in anderen pflanzlichen Linien angepasst werden. Dieses Protokoll kann durch extrem geschädigter DNA, wo Fragmente nicht in der gewünschten Größenordnung vorhanden sind, und sekundäre Pflanzenstoffe in einigen Pflanzenmaterial vorhanden, die saubere DNA-Isolierung hemmen begrenzt. Dieses Protokoll stellt insgesamt eine schnelle und umfassende Methode, die DNA-Isolierung und Bibliothek Vorbereitung von 24 Proben in weniger als 13 Stunden mit nur 8 h aktive Handhabungszeit mit minimalen Anpassungen ermöglicht.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herbarium Sammlungen sind potentiell wertvolle Arten und genomische Diversität für Studien einschließlich Phylogenetik1,2,3, Populationsgenetik4,5, Erhaltung Biologie6, invasive Arten Biologie7und Merkmal Evolution8. Die Fähigkeit, eine große Vielfalt von Arten, Populationen, geografische Orte und Zeitpunkte zu erhalten unterstreicht die "Schatztruhe"9 , die das Herbarium. Historisch, hat degradierten Artder Herbarium abgeleitet DNA PCR-basierten Projekten, oft verwies Forscher mittels nur Marker gefunden in hohe Kopie, wie Regionen von Chloroplast Genom oder die interne transkribierten Distanzstück (ITS) aus der ribosomalen behindert. RNA. Qualität der Proben und DNA variieren ausgiebig basierend auf Methoden der Konservierung9,10, mit Doppelstrang-Brüche und Fragmentierung von Wärme in der Trocknung werden die häufigsten Formen von Schäden, die Schaffung der so genannte 90 % DNA Überbrückungskupplung, die PCR-basierten Studien11belastet hat. Abgesehen von Fragmentierung ist das zweithäufigste Problem im Herbarium Genomics Verunreinigungen, wie z. B. die endophytische Pilze13 abgeleitet oder Pilze Obduktion erworben nach Sammlung aber vor dem Einbau in das Herbarium12, obwohl dieses Problem kann gelöst Bioinformatically rechts Pilze Datenbank (s.u.) gegeben werden. Eine dritte, und weniger üblich, Problem ist Sequenz Modifikation durch Cytosin Deamination (C/G→T/A)14, obwohl es wird geschätzt (~ 0,03 %) niedrig sein Herbarium Exemplare11. Mit dem Aufkommen von Hochdurchsatz-Sequenzierung (HTS) kann das Problem der Fragmentierung mit kurzen Lese- und Sequenzierung Tiefe12,15, so dass Genomebene Datenerfassung aus zahlreichen Proben mit niedriger Qualität überwunden werden DNA, und manchmal sogar ganze Genom-Sequenzierung15erlaubt.

Herbarium Proben werden immer häufiger verwendet und sind ein größerer Bestandteil der phylogenetische Projekte16. Eine aktuelle Herausforderung für HTS Herbar zu verwenden ist konsequent ausreichend Doppel stranded DNA, eine notwendige Voraussetzung für die Sequenzierung Protokolle, von zahlreichen Tierarten in einer fristgerechten Weise erhalten ohne Methoden zur individuellen Optimierung Proben. In diesem Papier wird ein Protokoll für die DNA-Extraktion und Bibliothek Vorbereitung der Herbarbelege demonstriert, nutzt die vorhandenen Methoden und ändert sie, um schnelle und reproduzierbare Ergebnisse zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht für die Komplettbearbeitung von Probe zu einer Bibliothek von 24 Proben in 13 h, mit Hands-on-Zeit 8 h oder 16 h, mit 9 h Arbeitsaufwand beträgt, wenn der optionale Reamplification-Schritt benötigt wird. Gleichzeitige Verarbeitung von mehr Proben ist erreichbar, wenn der limitierende Faktor Zentrifuge Kapazität und technisches Geschick. Das Protokoll soll nur typische Laborgeräte (Thermocycler, Zentrifuge und magnetische steht) anstelle von Spezialausrüstung, wie z. B. einen Vernebler oder Sonikator, für Scheren DNA benötigen.

DNA-Qualität, Fragmentgröße und Menge sind Faktoren für den Einsatz von Herbar im Hochdurchsatz-Sequenzierung Experimente begrenzt. Weitere Methoden zum Herbarium DNA zu isolieren und Erstellen von Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheken haben gezeigt, das Dienstprogramm zu verwenden so wenig wie 10 ng DNA-16; jedoch bedürfen experimentell ermitteln die optimale Anzahl von PCR-Zyklen für Bibliothek Vorbereitung erforderlich. Dies wird unpraktisch, beim Umgang mit äußerst geringen Mengen an lebensfähigen Doppel DNA (DsDNA), gestrandet, da einige Herbar nur genügend DNA für eine einzelne Bibliothek Zubereitung produzieren. Die hier vorgestellte Methode verwendet eine einzelne Zahl der Zyklen unabhängig von Sample-Qualität, so dass keine DNA Bibliothek Optimierungsschritte verloren geht. Stattdessen wird ein Reamplification Schritt aufgerufen, wenn Bibliotheken nicht die Mindestbeträge für die Sequenzierung erforderlich erfüllen. Viele Herbarium Proben sind selten und besitzen wenig Material macht es schwierig, destruktive Probenahme in vielen Fällen zu rechtfertigen. Um dem entgegenzuwirken, die vorgestellte Protokoll ermöglicht DsDNA Eingang Größen von weniger als 1,25 ng in der Bibliothek Vorbereitungsprozess, Erweiterung des lebensfähigen Proben für Hochdurchsatz-Sequenzierung und die Notwendigkeit einer destruktiven Entnahme von Proben zu minimieren.

Das folgende Protokoll wurde optimiert für Gräser und getestet auf Hunderte verschiedener Arten von Herbarium Proben, obwohl wir erwarten, dass das Protokoll auf viele andere Pflanzengruppen angewendet werden kann. Freuen Sie sich auf eine optionale Wiederherstellungsschritt, die verwendet werden, um niedrige Qualität und/oder seltene Exemplare zu speichern. Basierend auf mehr als zweihundert Herbar getestet, funktioniert dieses Protokoll auf Proben mit niedrigen Gewebe ein- und Qualität, so dass für die Erhaltung der seltene Exemplare durch minimale destruktive Probenahme. Hier wird gezeigt, dass dieses Protokoll hochwertige Bibliotheken bieten kann, die für Datenqualität-basierte Projekte sequenziert werden können.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. vor dem Start

  1. Machen frische Cetyl Trimethylammonium-Bromid (CTAB) Puffer17 durch Zugabe von 20 g CTAB, 10 g von Polyvinylpyrrolidon (PVP) 40, 100,0 mL 1 M Tris pH 8.0, 40 mL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) pH 8.0, 280,0 mL 5 M NaCl und 400,0 mL Reagenz Wasser zusammen, und das Gesamtvolumen zu 1 L per Reagenz-Grade Wasser bringen. Stellen Sie den pH-Wert auf 8.0.
    Hinweis: Zusätzliche Reagenzien können CTAB je nach sekundären Verbindungen in einzelnen Taxa hinzugefügt werden. Finden Sie unter Allen Et al. 18 für eine vollständige Liste der additive Reagenzien.
  2. Fügen Sie 10 µL des β-Mercaptoethanol pro 5 mL CTAB Puffer.
    Hinweis: Dies kann in Chargen von 50 mL vorbereitet und für 3 – 4 Wochen bei Raumtemperatur gelagert.
    1. Erhitzen Sie die CTAB Lösung im Wasserbad 65 ° C.
  3. Kühlen Sie Mörser und Stößel in-20 ° C für mindestens 20 Minuten.
  4. 4 Sätze von 2 x n 2-mL-Röhrchen beschriften (wobei n = Anzahl der Proben). 1 Satz der beschrifteten Rohre auf Eis gelegt.
  5. Kühlen Sie Isopropanol auf Eis oder im Gefrierschrank-20 ° C.
  6. Festphase reversible Immobilisierung (SPRI) Perlen (siehe Tabelle der Materialien) aus dem Kühlschrank nehmen und auf Raumtemperatur (mindestens 30 min) equilibrate lassen.
  7. Bereiten Sie 80 % Ethanol.
  8. Wählen Sie Herbar für Extraktion und rufen Sie ab ~ 1 cm2oder 10 mg des Gewebes pro Probe, vorzugsweise Blattmaterial.

(2) DNA-Extraktion

  1. Zermahlen Sie ~ 1 cm2 vorgewählte Herbarium Gewebe mit prechilled Mörser und Stößel. Flüssigem Stickstoff und 30 – 50 mg sterilisiert Sand hinzufügen. Schleifen Sie bis Gewebe in feines Pulver verwandelt.
    Hinweis: 10 mg oder mehr Gewebe ist wünschenswert, aber weniger arbeitete auch in einigen Fällen. Nachdem der flüssige Stickstoff verdampft, fügen Sie mehr Bedarf, bis das Gewebe vollständig gemahlen ist hinzu. Eine weitere gängige Methode zur Störung der Zellen und Gewebe ist die Verwendung von einem Wulst-Schläger. Diese Methode wurde jedoch nicht gut für die Proben, die in diesen Experimenten verwendeten arbeiten gefunden.
  2. Übertragen Sie das gefrorene Pulver in zwei 2 mL-Röhrchen (nicht mehr als die Hälfte der Röhre Volumen hinzufügen). Jedes Rohr 600 µL des warmen CTAB Lösung hinzu und mischen Sie die Rohre gründlich durch Inversion und aufschütteln.
    Hinweis: Da die Quantität und Qualität des Herbarium Material ist oft niedrig, hilft DNA-Isolierung in zwei Wiederholungen durchführen, um höhere Erträge zu erzielen.
  3. Inkubieren Sie die Proben im Wasserbad 65 ° C für 1-1,5 h, vortexen alle 15 min.
  4. Zentrifuge Proben bei 10.000 x g für 5 min. übertragen Überstands auf eine neue Reihe von beschrifteten Röhrchen (~ 500 µL). Entsorgen Sie die Tablette mit einem standard-chlorierten Entsorgung Verfahren.
  5. Jedes Rohr 4 µL RNase-A (10 mg/mL) hinzu und mischen Sie durch invertieren oder pipettieren. Inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C in einem Hitze-Block oder Wasserbad für 15 min.
  6. Fügen Sie ein gleiches Volumen (~ 500 µL) von einem 25:24:1-Phenol: Chloroform: Isoamyl-Alkohol-Gemisch, wenn die Rohre Raumtemperatur erreicht haben. Mischen Sie gründlich, von oben und unten pipettieren und/oder mit Inversion. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 12.000 x g für 15 min. Transfer die wässrige Schicht (obere Schicht), eine neue Reihe von beschrifteten Röhrchen (~ 400 µL). Entsorgen Sie die organische Schicht in einem chlorierten Abfallbehälter.
    Hinweis: Schritt 2.6 kann wiederholt werden wenn große Mengen an sekundären Verbindungen dürften in Pflanzenmaterial.
  7. Fügen Sie ein gleiches Volumen (~ 400 µL) von 24:1 Chloroform: Isoamyl-Alkohol-Gemisch. Mischen Sie gründlich, von oben und unten pipettieren und/oder mit Inversion. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 12.000 x g für 15 min. Transfer die wässrige Schicht (obere Schicht), eine neue Reihe von prechilled, beschriftete Röhrchen (~ 300 µL). Entsorgen Sie die organische Schicht in einem chlorierten Abfallbehälter.
  8. Jede Röhre ein gleiches Volumen (~ 300 µL) prechilled Isopropanol und 12 µL 2,5 M Natriumacetat hinzufügen. Inkubieren Sie Proben bei-20 ° C für 30 – 60 min.
    Hinweis: Die Inkubationszeiten erweiterbar (bis zu Inkubation über Nacht), aber DNA Qualität sinkt je länger brüten die Proben.
  9. Nehmen Sie die Proben aus dem Gefrierschrank und Zentrifuge die Rohre bei 12.000 x g für 15 min. entfernen und entsorgen den Überstand vorsichtig ohne zu stören das Pellet. Waschen Sie das Pellet durch Aufhängung mit frischen 70 % Ethanol (ca. 300 – 500 µL). Konsolidieren Sie für jede doppelte Probe die zwei einzelnen Pellets in einem mit begleitenden Ethanol.
    Hinweis: Proben in einem Rohr mit Ethanol zunächst gefestigt werden sollte und dann fortfahren. Es ist nicht notwendig, jede Probe mit Ethanol separat waschen.
  10. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 12.000 x g für 10 min. entfernen und entsorgen Sie des Überstands sanft ohne zu stören das Pellet. Die Pellets der Luft trocknen lassen.
    Hinweis: Proben können getrocknet werden schneller mit trockener Hitze Block (65 ° C nicht überschreiten). Stellen Sie sicher, dass die Proben nicht übermäßig trocken, da dies die letzte Ausbeute an DNA zu verringern.
  11. Die isolierte DNA in 50 µL 1 X TE auszusetzen. Speichern Sie in den-20 ° C-Gefrierschrank für langfristige Lagerung oder 4 ° C für den Einsatz in der Folgewoche.

3. Qualitätskontrolle (QC)

  1. Führen Sie eine Agarosegel für die Qualitätsprüfung.
    1. Bereiten Sie 1 X Tris/Borat/EDTA (TBE) Puffer indem 54 g Tris-Base, 27,5 g Borsäure und 3,75 g EDTA Binatrium Salz, das Gesamtvolumen bis 5 L mit Reagenz Grade Wasser zu bringen.
    2. Bereiten Sie eine 1 % Agarose-Gel durch Zugabe von 1 g Agarose in 100 mL 1 X TBE. Mikrowellen Sie-die Lösung bis keine Agarose sichtbar ist. Hinzufügen von 0,01 % Nukleinsäure-Gel Fleck (siehe Tabelle der Materialien). Lassen Sie die Küvette abkühlen, bis es handwarm ist. Mischen Sie gut durch Rühren. Ein Gel-Tiefziehschiene Gießen Sie Agarose hinzu und lassen Sie es sich bis es erstarrt.
    3. Mix 3 µL der Probe, 2 µL Reagenz Grad Wasser und 1 µL 6 x laden Farbstoff. Laden Sie die Proben in der Gelmatrix in Anbetracht ihrer Bestellung.
    4. Laufen Sie die Proben für 60-70 min bei 60 – 70 V. Bild das Gel unter UV-Licht mit korrekte Belichtung und Fokus.
      Hinweis: Präsenz einer klaren hochmolekularen Band ist ein Zeichen von hoher Qualität DNA, während Schlieren normalerweise DNA-Abbau zeigen. Die meisten Herbar werden abgebaut.
  2. Führen Sie eine DsDNA Quantifizierung Analyse (siehe Tabelle der Materialien) zu bestimmen, die Menge der doppelten stranded DNA.
    1. Verwenden Sie 2 µL der Probe für die Analyse.
      Hinweis: Verdünnungen sind nicht für die Quantifizierung Analyse des Herbarium Material benötigt, da sie neigen dazu, in minimalen Mengen. Erfolgreiche Bibliotheken wurden aus so wenig wie 1.26 ng total DsDNA von diesem Schritt gemacht.

4. DNA Scheren

Hinweis: Dies ist eine optimierte Version von einem kommerziellen Doppelstrang-Fragmentase Protokoll (siehe Tabelle der Materialien).

  1. Ort DsDNA Fragmentierung Enzym auf dem Eis nach dem aufschütteln für 3 s.
  2. In einem sterilen 0,2 mL Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Rohr isoliert Mischung 1 – 16 µL DNA mit 2 µL Fragmentierung Reaktion Puffer zu begleiten. Bringen Sie das Gesamtvolumen in 18 µL indem Nuklease kostenlos Wasser. Fügen Sie 2 µL DsDNA Fragmentierung Enzyms und Wirbel der Mischung für 3 s.
    Hinweis: Der benötigte DNA variiert je nach DNA-Konzentration (Ziel für 200 ng insgesamt in der Röhre).
  3. Inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für 8,5 min. Dann fügen Sie 5 µL 0,5 M EDTA an den Rohren.
    Hinweis: Dieser Schritt muss ausgeführt werden, sobald die Inkubationszeit vorbei ist, die Reaktion zu beenden und verhindern, dass DNA-Proben zu scheren.

(5) Bead Clean-up

  1. Homogenisieren der SPRI-Perlen durch aufschütteln.
  2. Bringen Sie das Gesamtvolumen der geschert DNA durch Zugabe von 25 µL des freien Wassers Nuklease 50 µL. Fügen Sie 45 µL Raumtemperatur SPRI Perlen (90 % Volumen hinzu) 50 µL geschert DNA und Mischung gründlich von oben und unten pipettieren.
    Hinweis: Hinzufügen von Perlen mit 90 % der Gesamtstichprobe Volumen geschieht, um die kleinste von DNA-Fragmenten, oft unter 200 Basenpaaren zu entfernen.
  3. Lassen Sie die Proben zu inkubieren, für 5 min. die Rohre auf einer magnetischen Platte und lassen für 5 min. sorgfältig sitzen entfernen und entsorgen den überstand.
    Hinweis: Achten Sie nicht zu stören die Perlen, wie sie die gewünschten DNA-Ziele enthalten.
  4. Die Rohre auf die Magnetstativ fügen Sie 200 µL frisch 80 % Ethanol hinzu. Inkubation bei Raumtemperatur für 30 s und dann sorgfältig entfernen und entsorgen den überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal. Luft trocknen die Perlen für 5 min, während das Rohr auf die Magnetstativ mit seinem Deckel geöffnet ist.
    Hinweis: Vermeiden Sie übermäßig trocknen die Perlen. Dies führt zu niedrigeren Wiederherstellung der DNA.
  5. Entfernen Sie die Rohre vom Magneten. Die DNA aus den Perlen in 55 µL 0.1 X TE eluieren und von oben und unten Pipettieren gründlich mischen. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Ort Rohre auf die Magnetstativ und warten auf die Lösung zu löschen (~ 2 min).
  6. 52 µL des Überstands abziehen. Führen Sie eine DNA-Quantifizierung Analyse auf die Proben zu überprüfen, die Erholung und die anfängliche Konzentration, die in der Bibliothek Prep geht.
    Hinweis: Bibliotheken wurden mit insgesamt DsDNA voraussichtlich weniger als 1,25 ng, aber in jedem Fall Reamplification erforderlich war.

6. Bibliothek Vorbereitung

Hinweis: Dies ist eine modifizierte Version eines handelsüblichen Bibliothek-Kit (siehe Tabelle der Materialien -Protokoll).

  1. Ende Prep
    1. Fügen Sie 3 µL Endonuklease und Phosphat tailing Enzyme und 7 µL der begleitenden Reaktion Puffer zu 50 µL der gereinigten, abscherend DNA. Mischen Sie von oben und unten Pipettieren gründlich. Drehen Sie die Rohre, um Luftblasen zu entfernen.
      Hinweis: Das Gesamtvolumen sollte 60 µL.
    2. Legen Sie die Proben in einem Thermocycler mit dem folgenden Programm: 30 min bei 20 ° C, 30 min bei 65 ° C, dann halten Sie bei 4 ° C.
      Hinweis: Beheizte Deckel wurde eingerichtet, um ≥75 ° C
  2. Adapter-Ligation
    1. Verdünnen Sie dem Adapter 25 – 50 Falte (arbeiten Adapter Konzentration von 0,6 – 0,3 µM). Die Rohre 30 µL Ligatur-master-Mix, 1 µL der Ligatur Enhancer und 2,5 µL des Adapters für Hochdurchsatz-kurze lesen Sie Sequenzierung hinzufügen.
      Hinweis: Das Gesamtvolumen sollte 93.5 µL.
    2. Mischen Sie von oben und unten Pipettieren gründlich. Drehen Sie die Rohre, um Luftblasen zu entfernen. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 20 ° C für 15 min.
    3. Fügen Sie 3 µL kommerzielle Mischung von Uracil DNA Glycosylase (UDG) und der DNA-Glycosylase-Lyase Endonuklease VIII (siehe Tabelle der Materialien) an den Rohren. Sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen 96,5 µL. gründlich mischen und Inkubation bei 37 ° C für 15 min mit einem Thermocycler.
      Hinweis: Der Deckel sollte festgelegt werden, auf ≥47 ° C. Die ursprüngliche Version des kommerziellen Protokolls hat Größenauswahl nach dem Adapter Ligatur Schritt, gefolgt von eine Perle Bereinigung als letzten Schritt. Dieses Protokoll, das höhere Erträge erreicht, schaltet die Reihenfolge dieser Schritte und Größenauswahl als letzten Schritt implementiert.
  3. Reinigung, Enzyme und kleine Fragmente zu entfernen
    1. Magnetische Beads durch Vortexen zu homogenisieren.
    2. 78 µL SPRI magnetische Beads (80 % Volumen) und gründlich mischen durch Pipettieren rauf und runter.
      Hinweis: Hinzufügen von Perlen bei 80 % der Gesamtstichprobe Volumen geschieht, um die kleinsten DNA-Fragmente, die oft kürzer als 250 Basenpaare sind zu entfernen. Die strengere Entfernung von kleinen DNA-Fragmente ist, (i) entfernen überschüssige Adapter und (Ii) Verstärkung der größeren Fragmente in den folgenden Schritten zu betonen.
    3. Lassen Sie die Proben für 5 min. Put inkubieren Sie die Rohre auf einer magnetischen Platte für 5 min. vorsichtig entfernen und entsorgen den Überstand, der die DNA außerhalb des Größenbereichs der gewünschten enthält.
      Hinweis: Achten Sie darauf, die Perlen zu stören, die die gewünschten DNA-Ziele enthalten.
    4. Die Rohre auf die Magnetstativ fügen Sie 200 µL frisch 80 % Ethanol hinzu. Inkubation bei Raumtemperatur für 30 s und dann sorgfältig entfernen und entsorgen den überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal. Luft trocknen die Perlen für 5 min, während das Rohr auf die Magnetstativ mit geöffnetem Deckel.
      Hinweis: Vermeiden Sie über die Perlen trocknen. Dies führt zu niedrigeren Wiederherstellung der DNA.
    5. Entfernen Sie die Rohre vom Magneten. Eluieren DNA Ziel von die Perlen durch Zugabe von 17 µL 0.1 X TE und Mischen von Pipettieren rauf und runter.
    6. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Ort Rohre auf die Magnetstativ und warten auf die Lösung zu löschen (~ 2 min).
    7. 15 µL des Überstands abziehen.
  4. PCR-Amplifikation
    1. 15 µL der gereinigten Adapter ligiert DNA fügen Sie 25 µL der High-Fidelity-PCR-master-Mix, 5 µL Hochdurchsatz-kurze lesen Sequenzierung Bibliothek Prep 5' Grundierung und 5 µL Hochdurchsatz-kurze lesen Sie Sequenzierung Bibliothek Prep 3' Grundierung hinzu.
      Hinweis: Gesamtvolumen sollte 50 µL.
    2. Mischen Sie gut durch aufschütteln. Legen Sie die Proben in einem Thermocycler mit den Einstellungen finden in Tabelle 1: Thermocycler Verstärkung Einstellung.
      Hinweis: Eine große Anzahl von Zyklen ist aufgrund der geringen Anzahl der Eingabe DNA erforderlich.
Zyklus-SchrittTemp.ZeitZyklen
Anfängliche Denaturierung98 ° C30 s1
Denaturierung98 ° C10 s12
Glühen/Verlängerung65 ° C75 s12
Letzte Erweiterung65 ° C5 min1
Halten4 ° C

Tabelle 1: PCR-Protokoll Denaturierung, Glühen und Erweiterung Zeiten und Temperaturen. Temperatur und Zeit wurden für die Reagenzien präsentiert in diesem Protokoll optimiert. Wenn Reagenzien geändert werden, sollten Temperaturen und Zeiten nochmals optimiert werden.

  1. Größenauswahl für die gewünschte Bibliotheksgröße
    Hinweis: Diese Perle Schritt werden Fragmente oberhalb und unterhalb des Zielbereichs entfernt.
    1. Homogenisieren Sie SPRI Perlen durch aufschütteln.
    2. 25 µL (50 % Volumen) Raumtemperatur magnetische Beads und gründlich mischen durch Pipettieren rauf und runter. Lassen Sie die Proben zu inkubieren, für 5 min. die Rohre auf einer magnetischen Platte und lassen für 5 min. sorgfältig sitzen entfernen und den Überstand auf eine neue Reihe von beschrifteten Rohre übertragen.
      Hinweis: Dieser Band ist je nach gewünschten Bibliotheksgröße einstellbar. Der Überstand enthält DNA-Fragmente der gewünschten Größe. In die erste Perle Inkubation sind die Perlen größeren Bibliothek Fragmente verbindlich. Diese sind zu konzentrieren auf die im Bereich von 400 – 600 Basenpaaren entfernt. Der Überstand enthält kleinere Fragmente.
    3. Hinzu kommen 6 µL Raumtemperatur SPRI Perlen der Überstand und Mischung gründlich durch Pipettieren rauf und runter. Lassen Sie die Proben zu inkubieren, für 5 min. die Rohre auf einer magnetischen Platte und lassen für 5 Minuten sitzen.
      Hinweis: Dieser Band kann je nach Größe der gewünschten Bibliothek gemäß Schritt 6.5.2 angepasst werden.
    4. Sorgfältig entfernen und entsorgen des Überstands.
      Hinweis: Achten Sie darauf, die Perlen zu stören, die die gewünschte DNA enthalten. In der zweiten Wulst Inkubation verbindlich sind die Perlen den Fragmenten verließ, nachdem die anfängliche Beseitigung der größten DNA-Fragmenten. Dieser Satz von Fragmenten ist in der Regel in der gewünschten Größenordnung.
    5. Die Rohre auf die Magnetstativ fügen Sie 200 µL frisch 80 % Ethanol hinzu. Inkubation bei Raumtemperatur für 30 s, dann vorsichtig entfernen und entsorgen den überstand. Den Vorgang wiederholen. Luft trocknen die Perlen für 5 min, während das Rohr auf die Magnetstativ mit geöffnetem Deckel.
      Hinweis: Vermeiden Sie übermäßig trocknen die Perlen. Dies führt zu niedrigeren Wiederherstellung der DNA.
    6. Entfernen Sie die Rohre vom Magneten. Das Ziel der DNA aus der Perlen in 33 µL 0.1 X TE eluieren und gründlich mischen durch Pipettieren rauf und runter.
    7. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Ort Rohre auf die Magnetstativ und warten auf die Lösung zu löschen (~ 2 min). Ziehen Sie 30 µL des Überstandes und Transfer zu 2 mL Röhrchen (siehe Tabelle der Materialien) für die Lagerung.
      Hinweis: Die Bibliotheken können bei-20 ˚C für die Langzeitspeicherung aufbewahrt werden.
  2. Qualitätskontrolle
    1. Führen Sie einen Qualitätskontrolle-Test auf DNA-Bibliotheken. Beziehen sich auf Schritte 3.1 und 3.2.
      Hinweis: Für DNA-Bibliotheken, 96 V Gel für ~ 45 min Laufzeit.
  3. Bibliothek Reamplification: Optional wenn Bibliothek Menge nicht ausreicht.
    Hinweis: Proben mit Bibliothek-Konzentrationen unter 10 nM kann mit den folgenden Schritten Professor werden. Reamplification der niedrigen Konzentration Bibliotheken kann praktikable Ergebnisse für die Sequenzierung erreichen, aber Reamplification kann eine geringe Verschiebung in der Basenzusammensetzung Vielfalt führen, obwohl gesammelten Daten (Tabelle 3) deuten darauf hin, dass dies für bestimmte Metriken vernachlässigbar ist .
    1. Verdünnen Sie die universelle Reamplification Primer 10-fach mit 0,1 X TE.
    2. Niedrige Konzentration Bibliotheken 15 µL 25 µL der High-Fidelity-PCR-master-Mix, 5 µL verdünnter universal Reamplification Primer 1 (AATGATACGGCGACCACCGA) und 5 µL verdünnter universal Reamplification Primer 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA) hinzufügen. Hinweis: Gesamtvolumen sollte 50 µL.
    3. Mischen Sie gut durch aufschütteln. Legen Sie die Proben in einem Thermocycler mit den Einstellungen finden in Tabelle 1: Thermocycler Verstärkung Einstellung
      Hinweis: Die große Anzahl von Zyklen ist aufgrund der geringen Menge der Eingabe DNA erforderlich.
    4. Perle-Bereinigung
    5. Homogenisieren Sie SPRI Perlen durch aufschütteln. 45 µL Raumtemperatur SPRI Perlen (90 % Volumen) und gründlich mischen durch Pipettieren rauf und runter.
    6. Lassen Sie die Proben für 5 min. legen die Rohre auf einer magnetischen Platte für 5 min inkubieren.
    7. Sorgfältig entfernen und entsorgen des Überstands, der die unerwünschte DNA enthält.
      Hinweis: Achten Sie darauf, die Perlen zu stören, die die gewünschten DNA-Ziele enthalten.
    8. Die Rohre auf die Magnetstativ fügen Sie 200 µL frisch 80 % Ethanol hinzu. Inkubation bei Raumtemperatur für 30 s, und dann sorgfältig entfernen und entsorgen den überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
    9. Luft trocknen die Perlen für 5 min, während das Rohr auf die Magnetstativ mit seinem Deckel geöffnet ist.
      Hinweis: Vermeiden Sie übermäßig trocknen die Perlen. Dadurch können geringere Wiederherstellung des DNA-Ziels.
    10. Entfernen Sie die Rohre vom Magneten. Das Ziel der DNA aus der Perlen in 33 µL 0.1 X TE eluieren und gründlich mischen durch Pipettieren rauf und runter.
    11. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Ort Rohre auf die Magnetstativ und warten auf die Lösung zu löschen (~ 2 min).
    12. 30 µL des Überstands abziehen. Die Bibliotheken können bei-20 ° C für die Langzeitspeicherung gespeichert werden.
  4. Qualitätskontrolle
    1. Führen Sie einen Qualitätskontrolle-Test auf DNA-Bibliotheken. Beziehen sich auf Schritte 3.1 und 3.2. Das Gel für ~ 45 min Laufzeit für DNA-Bibliotheken 96 V.
      Hinweis: Wenn eine doppelte-Band im Gel gesehen wird, ist dies wahrscheinlich eine Folge der Grundierung Erschöpfung aus dem Reamplification-Schritt. Die Bänder können entfernt werden, von 6,9 zu wiederholen, aber mit nur ein Zyklus in der PCR-Programm in Tabelle 1dargestellt.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-Isolierung und endgültige Bibliothek Ertrag
In dieser Studie wurde die Wirksamkeit des Protokolls für die Isolierung von Herbarium DNA und die Verwertung von hochwertigen Sequenzierung Bibliotheken nachgewiesen mit fünfzig verschiedenen Proben mit das älteste aus dem Jahre 1920 und der jüngste ab 2012 (Tabelle 2). Für jede Probe wurde etwa 10 mg Blattgewebe für DNA-Isolierung verwendet. Grüner Blattgewebe wurde bevorzugt, falls verfügbar, und kein ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hier vorgestellten Protokoll ist eine umfassende und solide Methode zur DNA-Isolierung und Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von getrockneten Pflanzen. Die Konsistenz des Verfahrens und des minimalen Notwendigkeit, es zu ändern basierend auf Probe Qualität machen es skalierbar für große Herbarium-basierte Sequenzierung Projekte. Die Einbeziehung eines optionalen Reamplification Schritts für geringe Ausbeute Bibliotheken ermöglicht die Aufnahme von geringer Qualität, geringe Menge, selten, oder historisch wichtige...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Taylor AuBuchon-Holunder, Jordan Teisher und Kristina Zudock um Hilfe bei der Probenahme Herbar und Missouri Botanical Garden Zugang zum Herbar für destruktive Probenahme. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der National Science Foundation (DEB-1457748).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems445230096 Well 
Gel-Imaging-SystemAzure Biosystemsc300
Microfuge 20 SerieBeckman CoulterB30137
Digitales TrockenbadBenchmark ScientificBSH1001
ElektrophoresesystemEasyCastB2
PURELAB flex 2 (Reinstwasser)ELGA 89204-092
DNA-LoBind-Röhrchen Eppendorf301080782 ml
Mini-ZentrifugeFisher Scientific12-006-901
Vortex-Genie 2Fisher Scientific12-812
MörserFisher ScientificS02591Porzellan
StößelFisher ScientificS02595Porzellan
ZentrifugenröhrchenFisher Scientific21-403-161
MikrowelleKenmore405.7309231
Qubit Assay TubesInvitrogenQ32856
0,2 ml Streifenröhrchen und Kappe für PCRVWR20170-004
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogenQ32866
BalanceMettler ToledoPM2000
Flüssigstickstoff KurzzeitlagerungNalgeneF9401
Magnet-Ring-Ständer ThermoFisher Wissenschaftlich AM1005096 Bohrung 
WasserbadVWR89032-210
HeizplattenrührerVWR97042-754
FlüssigstickstoffAirgasUN1977
1 x TE PufferAmbionAM9849pH 8,0
CTABAMRESCO0833-500G
2-MERCAPTOETHANOLAMRESCO0482-200ML
Ribonuklease AAMRESCOE866-5ML10 mg/ml Lösung
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63882
Natriumchloridbio WORLD705744
IsopropylalkoholbioWORLD 40970004-1
Nukleasefreies WasserbioWORLD 42300012-2
IsoamylalkoholFisher ScientificA393-500
Natriumacetat-TrihydratFisher Scientifics608-500
LE AgaroseGeneMateE-3120-500
100bp PLUS DNA LadderGold BiotechnologyD003-500
EDTA, DinatriumsalzIBI ScientificIB70182
Qubit dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32854
TRISMP Biomedicals103133ultrareiner
Gel-Ladefarbstoff Purple (6 X)New England BioLabsB7024S
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BioLabsM0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit für Illumina New England BioLabsE7645L
NEBNext Multiplex Oligos für IlluminaNew England BioLabsE7600SDual Index Primer Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master MixNew England BioLabsM0543L
Mag-Bind RXNPure PlusOmega bio-tekM1386-02
GelRed 10000 xPheonix Research41003-1
PhenollösungSIGMA Life ScienceP4557-400ml
PVP40SIGMA-AldrichPVP40-50G
ChloroformVWREM8.22265.2500
EthanolKoptecV1016200 Proof
QuarzsandVWR14808-60-7
ReamplifikationsprimerIntegrated DNA Technologiessiehe Text
Sequencher v.5.0.1GeneCodes

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
  2. Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).
  3. Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. , (2017).
  4. Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).
  5. Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22 (12), 634-642 (2007).
  6. Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species? Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).
  7. Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).
  8. Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).
  9. Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7 (8), e43808(2012).
  10. Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).
  11. Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6 (12), e28448(2011).
  12. Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).
  13. Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).
  14. Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).
  15. Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8 (7), e69189(2013).
  16. Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).
  17. Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
  18. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
  19. Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. , (2016).
  20. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12 (2), R18(2011).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
  22. Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).
  23. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).
  24. McKain, M. R. Herbarium Genomics. , Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  25. McKain, M. R., Wilson, M. A. Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes. , Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  26. McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).
  27. McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. , (2016).
  28. Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).
  29. Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6 (1), 11(2015).
  30. McKain, M. R. Transposons. , Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  31. Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239(2016).
  32. Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7 (3), e34131(2012).
  33. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
  34. Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).

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