Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau aus Herbarium Material einschließlich Rettung von sehr schlechter Qualität DNA.
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Methodenartikel
Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Herbarien sind eine unschätzbare Quelle von pflanzlichem Material, das in einer Vielzahl von biologischen Studien verwendet werden kann. Die Verwendung von Herbar ist verbunden mit einer Reihe von Herausforderungen einschließlich Probenqualität Erhaltung geschädigter DNA und destruktive Probenahme seltene Exemplare. Um effektiver Herbarium Material in großen Sequenzierung Projekten verwenden, ist eine zuverlässige und skalierbare Methode der DNA-Isolierung und Bibliothek Vorbereitung erforderlich. Dieses Papier zeigt eine robuste, Anfang-Ende Protokoll für DNA-Isolierung und hohem Durchsatz Bibliotheksbau von Herbar, die keine Änderung für Einzelproben erfordert. Dieses Protokoll ist für niedrige Qualität getrocknet Pflanze Material und nutzt vorhandene Methoden durch die Optimierung der Gewebe Schleifen, ändern Bibliothek Größenauswahl und die Einführung eines optionalen Reamplification Schritt für geringe Ausbeute Bibliotheken zugeschnitten. Reamplification von geringer Ausbeute DNA-Bibliotheken kann Proben abgeleitet von unersetzlichen und potenziell wertvollen Herbar, negiert die Notwendigkeit für zusätzliche destruktive Probenahme und ohne erkennbare Sequenzierung Voreingenommenheit für gemeinsame retten. phylogenetische Anwendungen. Das Protokoll ist auf Hunderten von Grasart geprüft worden, aber wird voraussichtlich nach Prüfung für den Einsatz in anderen pflanzlichen Linien angepasst werden. Dieses Protokoll kann durch extrem geschädigter DNA, wo Fragmente nicht in der gewünschten Größenordnung vorhanden sind, und sekundäre Pflanzenstoffe in einigen Pflanzenmaterial vorhanden, die saubere DNA-Isolierung hemmen begrenzt. Dieses Protokoll stellt insgesamt eine schnelle und umfassende Methode, die DNA-Isolierung und Bibliothek Vorbereitung von 24 Proben in weniger als 13 Stunden mit nur 8 h aktive Handhabungszeit mit minimalen Anpassungen ermöglicht.
Einleitung
Herbarium Sammlungen sind potentiell wertvolle Arten und genomische Diversität für Studien einschließlich Phylogenetik1,2,3, Populationsgenetik4,5, Erhaltung Biologie6, invasive Arten Biologie7und Merkmal Evolution8. Die Fähigkeit, eine große Vielfalt von Arten, Populationen, geografische Orte und Zeitpunkte zu erhalten unterstreicht die "Schatztruhe"9 , die das Herbarium. Historisch, hat degradierten Artder Herbarium abgel....
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Protokoll
1. vor dem Start
- Machen frische Cetyl Trimethylammonium-Bromid (CTAB) Puffer17 durch Zugabe von 20 g CTAB, 10 g von Polyvinylpyrrolidon (PVP) 40, 100,0 mL 1 M Tris pH 8.0, 40 mL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) pH 8.0, 280,0 mL 5 M NaCl und 400,0 mL Reagenz Wasser zusammen, und das Gesamtvolumen zu 1 L per Reagenz-Grade Wasser bringen. Stellen Sie den pH-Wert auf 8.0.
Hinweis: Zusätzliche Reagenzien können CTAB je nach sekundären Verbindungen in einzelnen Taxa hinzugefügt werden. Finden Sie unter Allen Et al. 18 für eine vollständige Liste der additive Reagenzien. - Füg....
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Ergebnisse
DNA-Isolierung und endgültige Bibliothek Ertrag
In dieser Studie wurde die Wirksamkeit des Protokolls für die Isolierung von Herbarium DNA und die Verwertung von hochwertigen Sequenzierung Bibliotheken nachgewiesen mit fünfzig verschiedenen Proben mit das älteste aus dem Jahre 1920 und der jüngste ab 2012 (Tabelle 2). Für jede Probe wurde etwa 10 mg Blattgewebe für DNA-Isolierung verwendet. Grüner Blattgewebe wurde bevorzugt, falls verfügbar, und kein .......
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Diskussion
Die hier vorgestellten Protokoll ist eine umfassende und solide Methode zur DNA-Isolierung und Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von getrockneten Pflanzen. Die Konsistenz des Verfahrens und des minimalen Notwendigkeit, es zu ändern basierend auf Probe Qualität machen es skalierbar für große Herbarium-basierte Sequenzierung Projekte. Die Einbeziehung eines optionalen Reamplification Schritts für geringe Ausbeute Bibliotheken ermöglicht die Aufnahme von geringer Qualität, geringe Menge, selten, oder historisch wichtige.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Danksagungen
Wir danken Taylor AuBuchon-Holunder, Jordan Teisher und Kristina Zudock um Hilfe bei der Probenahme Herbar und Missouri Botanical Garden Zugang zum Herbar für destruktive Probenahme. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der National Science Foundation (DEB-1457748).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4452300 | 96 Well |
| Gel-Imaging-System | Azure Biosystems | c300 | |
| Microfuge 20 Serie | Beckman Coulter | B30137 | |
| Digitales Trockenbad | Benchmark Scientific | BSH1001 | |
| Elektrophoresesystem | EasyCast | B2 | |
| PURELAB flex 2 (Reinstwasser) | ELGA | 89204-092 | |
| DNA-LoBind-Röhrchen | Eppendorf | 30108078 | 2 ml |
| Mini-Zentrifuge | Fisher Scientific | 12-006-901 | |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Mörser | Fisher Scientific | S02591 | Porzellan |
| Stößel | Fisher Scientific | S02595 | Porzellan |
| Zentrifugenröhrchen | Fisher Scientific | 21-403-161 | |
| Mikrowelle | Kenmore | 405.7309231 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| 0,2 ml Streifenröhrchen und Kappe für PCR | VWR | 20170-004 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Balance | Mettler Toledo | PM2000 | |
| Flüssigstickstoff Kurzzeitlagerung | Nalgene | F9401 | |
| Magnet-Ring-Ständer | ThermoFisher Wissenschaftlich | AM10050 | 96 Bohrung |
| Wasserbad | VWR | 89032-210 | |
| Heizplattenrührer | VWR | 97042-754 | |
| Flüssigstickstoff | Airgas | UN1977 | |
| 1 x TE Puffer | Ambion | AM9849 | pH 8,0 |
| CTAB | AMRESCO | 0833-500G | |
| 2-MERCAPTOETHANOL | AMRESCO | 0482-200ML | |
| Ribonuklease A | AMRESCO | E866-5ML | 10 mg/ml Lösung |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63882 | |
| Natriumchlorid | bio WORLD | 705744 | |
| Isopropylalkohol | bio | WORLD 40970004-1 | |
| Nukleasefreies Wasser | bio | WORLD 42300012-2 | |
| Isoamylalkohol | Fisher Scientific | A393-500 | |
| Natriumacetat-Trihydrat | Fisher Scientific | s608-500 | |
| LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| 100bp PLUS DNA Ladder | Gold Biotechnology | D003-500 | |
| EDTA, Dinatriumsalz | IBI Scientific | IB70182 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| TRIS | MP Biomedicals | 103133 | ultrareiner |
| Gel-Ladefarbstoff Purple (6 X) | New England BioLabs | B7024S | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England BioLabs | M0348L | |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit für Illumina | New England BioLabs | E7645L | |
| NEBNext Multiplex Oligos für Illumina | New England BioLabs | E7600S | Dual Index Primer Set 1 |
| NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix | New England BioLabs | M0543L | |
| Mag-Bind RXNPure Plus | Omega bio-tek | M1386-02 | |
| GelRed 10000 x | Pheonix Research | 41003-1 | |
| Phenollösung | SIGMA Life Science | P4557-400ml | |
| PVP40 | SIGMA-Aldrich | PVP40-50G | |
| Chloroform | VWR | EM8.22265.2500 | |
| Ethanol | Koptec | V1016 | 200 Proof |
| Quarzsand | VWR | 14808-60-7 | |
| Reamplifikationsprimer | Integrated DNA Technologies | siehe Text | |
| Sequencher v.5.0.1 | GeneCodes |
Referenzen
- Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).
- Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
