Dieses Protokoll beschreibt, wie eine in-vitro- isoliert Schildkröte Kopf Vorbereitung zu verwenden, um die Kinematik des ihre Augenbewegungen zu messen. Nach der Entnahme des Gehirns aus dem Schädel können Hirnnerven mit Strömungen, Drehungen des Auges und Veränderungen der Pupille Größen quantifizieren angeregt werden.
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Methodenartikel
Okuläre Kinematik gemessen durch In-vitro- Stimulation der Hirnnerven in die Schildkröte
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Nachdem Tiere eingeschläfert werden, beginnen ihre Gewebe zu sterben. Schildkröten bieten einen Vorteil wegen eine längere Überlebenszeit von ihrem Gewebe, vor allem im Vergleich zu warmblütige Wirbeltiere. Aus diesem Grund können in-vitro- Experimente in der Schildkröten für längere Zeit zu untersuchen, die neuronale Signale und Kontrolle ihrer Ziel-Aktionen durchgeführt werden. Mit einem isolierten Leiter Vorbereitung, wir Maßen die Kinematik der Augenbewegungen in Schildkröten und deren Modulation durch elektrische Signale, die von Hirnnerven durchgeführt. Nachdem das Gehirn aus dem Schädel entfernt wurde, war intakt die Hirnnerven, seziert Kopf in eine kardanische Augenbewegungen zu kalibrieren platziert. Glaselektroden wurden angebracht, um Hirnnerven (okulomotorischen, trochlear, und rectus) und stimulierte mit Strömungen, Augenbewegungen zu erwähnen. Wir überwachen Augenbewegungen mit einem Infrarot-Video-tracking-System und quantifizierte Rotationen der Augen. Strom-Impulse mit einer Reihe von Amplituden, Frequenzen, und Zug Dauer wurden verwendet, um die Auswirkungen auf die Reaktionen zu beobachten. Da die Vorbereitung vom Gehirn getrennt ist, kann der ableitenden Weg zu Muskel-Ziele isoliert untersuchen neuronale Signalisierung bei fehlender zentral verarbeitet sensorische Informationen untersucht werden.
Einleitung
Begründung für die Verwendung von rot-eared Slider Schildkröten in elektrophysiologischen Experimenten:
Rot-eared Slider Schildkröten (ist Scripta Elegans), gelten als eine der weltweit schlimmsten invasiven Arten1 und können angeben, dass ein Ökosystem in Schwierigkeiten ist. Rot-eared Slider Schildkröten sind deshalb so erfolgreich ist wenig bekannt, aber es kann teilweise durch ihre tolerante Physiologie und des Besitzes von Nervengewebe, die unter hypoxischen Bedingungen2,3,4 überleben können . Verwenden sie für Ex....
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Protokoll
Hinweis: Rot-eared Slider Schildkröten, männlich und weiblich, wurden von einem Händler gekauft. Schildkröten lebten in einer warmen Tier Suite mit zwei 60-Gallone-Wannen mit Backstein-Inseln zum Sonnen unter 250-W Infrarot-Leuchten ausgestattet. Die Umwelt blieb auf einem 14/10-h-Hell/Dunkel-Zyklus mit der Wassertemperatur auf 22 ° C. Lichter waren eingeschaltet um 06:00 und um 20:00 ausgeschaltet. Die Tanks mit Filtersystemen ausgestattet wurden wöchentlich gereinigt, und Schildkröten wurden Ad Libitum jeden zweiten Tag gefüttert. Die Pflege der rot-eared Slider Schildkröten und alle der folgenden experimentellen Verfahren beschrieben hier....
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Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt Standbilder von Bilder aus einem Video beschreibt die Dissektion. Bilder bieten typische Standorte der Nerven vor dem Schneiden aus dem Gehirn.
Abbildung 1: Standbilder von Bildern aus dem Video von der Dissektion anzuzeigenden Standorte der Sehnerv (nII), Oculomotor Nerv (nIII), trochlearis.......
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Diskussion
Wichtige Schritte:
Die entscheidenden Schritte innerhalb dieses Protokolls sind die folgenden: 1) die Zerlegung und die Sorgfalt, die zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der durchtrennten Nerven; (2) die passenden Größen von saugelektroden, Hirnnerven, konsistente Antworten bereitzustellen; und 3) die Platzierung des Kopfes in den Gimbal, adäquate Kalibrierung der Umdrehungen des Auges zu bieten.
Fehlerbehebung:
Die Dissektion kann eine H.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren danken Frau Paulette McKenna und Lisa Pezzino in dieser Studie für Sekretariat und Herr Phil Auerbach für den technischen Support. Die Autoren danken auch DRS. Michael Ariel und Michael S. Jones (Saint Louis University School of Medicine) für die Einführung von uns, die in-vitro- isoliert Kopf Vorbereitung. Unterstützung dieser Zusammenarbeit wurde von der Fakultät für Biologie (Robert S. Chase Fund), Academic Research Committee und die Neurowissenschaften Programm am Lafayette College finanziert. Schließlich ist diese Arbeit Herr Phil Auerbach, gewidmet der 28. September 2016 verstorben; er ein Rasterelektronenmikroskop stillgelegt und erkannte d....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Rotwangen-Gleitschildkröten | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | Große Größe (Panzerlänge 15-20 cm) |
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich Co., LLC. | S5886 | |
| Kaliumchlorid | Sigma-Aldrich Co. LLC. | P5405 | |
| Magnesium-Chorid | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M7304 | |
| Natriumbicarbonat | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5761 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich Co., LLC. | C5767 | |
| Konzentrierte Salzsäure | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
| Calciumchlorid | Sigma-Aldrich Co., LLC. | C7902 | |
| pH-Messgerät | Oakton | pH 6+ | |
| Saugstimulationselektrode | A-M Systems | 573000 | Bipolare Saugelektrode. Beachten Sie, dass 573000 durch 573050 ersetzt wurde. |
| Kapillarglas | A-M systems | 626000 | Einläufiges Borosilikat-Kapillarglas ohne Mikrofilament, Länge 10 cm, Außendurchmesser 1,0 mm, Innendurchmesser 0,50 mm |
| Alternative Sauganregungselektrode | A-M Systems | 573050 | Bipolare Saugelektrode. Erfordert Kapillarglas mit größerem Durchmesser: 627000, Außendurchmesser 1,2 mm, Innendurchmesser 0,68 mm |
| Stereoskop | Lieca GZ7 | Vergrößerungsbereich, 10x – 70x | |
| Faseroptische Lichtquelle | Amscope | HL250-A | 150W Lichtkasten für faseroptische Mikroskopbeleuchtung |
| Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | Edelstahl, gerade Feder, 5,25" |
| Stumpfe Präpariersonde | Carolina Biological Supply Company | 627405 | Huber Mall-Sonde, doppelseitige Sonde und Sucher, 6" |
| Mikroschere | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Iris Mikrodisparierschere, Edelstahl, 0,5" Klingen, 4,75" lange |
| Feinzange | Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | Juwelierzange, Dumont Nr. 5, Inox-Legierung, 4,25" |
| Gebogene Pinzette | Sigma-Aldrich Co. LLC. | Z168696 | Mittlere Spitze, gebogene Pinzette, Edelstahl, 4" |
| Skalpellgriff | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2896 | Skalpellgriffe, Nr. 3, Edelstahl |
| Skalpellklinge | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | Skalpellklingen, Nr. 11, Stahl |
| Guillotine | Harvard Gerät | 73-1918 | Kleine Guillotine Typ 7575 |
| Spatel | Sigma | Z648299 | Mikrolöffel und Spatel Wiegeset. Verwenden Sie einen kleinen Spatel: 5,9" lang x 0,07" Durchmesser Griff mit quadratischem Ende: 0,17" x 1,3" lang, andere Endrunde: 0,17" x 1,27" |
| langer Haken | Autozone | 98069 | SureBilt Haken- und Plektrum-Set. Verwenden Sie den Schleifer, um scharfe Spitzen des Hakens zu stumpf zu machen, um Verletzungen des Mauls des Tieres zu vermeiden. |
| 95/5 % O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5 % Kohlendioxidbilanz sauerstoffzertifiziertes Standardgasgemisch, Größe 200 Zylinder, CGA-296 |
| Regler | Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | Einstufiger Analysezylinderregler aus Messing 0-100 psi CGA-296 mit Nadelauslass. Verwenden Sie ein verstellbares Luftleitungsventil aus Messing, um von einem Innendurchmesser von 3/8 Zoll zu wechseln, einen Vinylschlauch, der mit dem Regler verbunden ist, einen Innendurchmesser von 3/16 Zoll, einen Luftleitungsanschluss, der zu einer Airstone- oder Glaspasteurpipette führt. |
| Verstellbares Airline-Rohrventil | Doctors Foster and Smith | CD-12061 | Messingventil |
| Starrer Tisch | Unbekannt | Unbekannt | Autoklaventür auf einem stabilen Tisch gelegt. Neun Tennisbälle mit einem Durchmesser von 5 Zoll isolieren Vibrationen von der Oberseite des Tisches. |
| 5" Tennisball | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennisball: Die Bälle werden ungeschnitten und in einem integrierten Rahmen an der Unterseite der Autoklaventür gehalten. |
| Alternativer Schwingungsisolationstisch | Newport Corporation | INT1-36-6-N | Starres Schwingungskontrollsystem, Integrität 1: Oberflächenabmessungen, 3' x 6' |
| Gimbal | ISI, International Scientific Instruments, Inc. | Tisch aus SUPER III-A Scanning EM | 5-Achsen-Euzentertisch: X-, Y- und Z-Linearbewegungen ± 20 mm, 0,1 mm Präzision; Rotationen, vertikal und plusmn; 10° und horizontal, ± 12,5 Grad, mit 1,25 Grad; Präzision. Hinweis: aus dem Stilllegungsinstrument. |
| Spannfutter für Gimbal | Unbekannt | Unbekannt | Das Spannfutter aus einem alten Mikrotom unbekannter Herstellung wurde so bearbeitet, dass es auf den Schaft des Probenhalters des Scanning EM Tisches |
| passt Alternativer Gimbal | ThorLabs, Inc. | GN2/M mit MBT602/M | Zweiachsiges Goniometer (GN2/M), montiert auf einem 3-Achsen-Mikroblocktisch mit Rändelschraubeneinstellern (MBT602/M): Entwerfen Sie ein Spannfutter, um den Schildkrötenkopf mit dem Auge 12,7 mm über der Oberseite des Goniometers zu halten (Abstand zum Drehpunkt) |
| Videobasiertes Eye-Tracking-System | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, PC-60 Tracking-Methode | : Infrarot-Video mit dunkler Pupille; Schwarz-Weiß-Kamera (Artikel BC02): 30 Hz, 640 x 480; Systemanforderungen: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Sichtbereich: Horizontal +/- 44°; vertikal +/- 20°; Genauigkeit ~0,5°; Räumliche Auflösung ~0,15°; Auflösung der Pupillengröße ~0,03 mm; Augendaten: X, Y-Position des Blicks, Pupillenhöhe und -breite, Torsion, Delta-Zeit, Gesamtzeit und interessante Regionen (ROI); Echtzeitkommunikation (Artikel 0022): 4-Kanal-Analogausgang mit acht TTL-Eingangskanälen zum Markieren von Codes in die Datendatei |
| Magnetfuß mit mehreren Positionen | Harbor Freight Tools | Pittsburg, Artikel #5645 | Der Magnethalter erreicht bis zu 12" und erzeugt einen magnetischen Zug von 45 lbs. Verwenden Sie diese Option, um die Kamera zu positionieren. Gewindebohrungen an das Ende der Stange zur Montage von Kameras. |
| Mikromanipulator | Kopf | 900 | 5-Achsen-Manipulation für die Aufnahme der Saugelektrode: X, Y, Z linearer Weg, 2 Drehachsen |
| Präparierbereich am Ausleger | Lieca | GZ6 | Vergrößerungsbereich, 6,7x – 40x |
| Nerven-/Muskelstimulator | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | Dual-Puls-Spannungsstimulator: zwei Ausgangskanäle, die unabhängig voneinander betrieben oder synchronisiert werden können, um nicht isolierte Konstantspannungsimpulse (10 mV bis 150 V) zu erzeugen. Die Impulse können einzeln sein (10 μ sec bis 10 sec), repetitive (0,01 Hz bis 1 KHz) und Züge (1 ms bis 10 s) und synchronisiert mit TTL-Ein- und Ausgängen. Senden Sie TTL-Ausgänge über die Ausgangskanäle eines DB25-Anschlusses an die TTL-Eingangskanäle des ViewPoint EyeTrackers. Hinweis: Astro-Med Grass Telefactor ist nicht mehr im Geschäft. |
| Stromabschaltung | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | Strom-Stimulus-Isolationseinheit: ermöglicht die sichere Abgabe von Konstantströmen durch das S88 an die Präparation. Der PSIU6 wird über ein BNC-Kabel mit einem der Ausgangskanäle des S88 verbunden. Multiplikatorschalter an der PSIU6 ermöglichen es dem S88, eine breite Palette von Stromamplituden zu erzeugen, die von 0,1 und Mikro reichen. A bis 15 mA. |
| Alternativer Nerven-/Muskelstimulator mit Isolierung | A-M Systems | 2100 | Isolierter Impulsstimulator: Das Gerät verfügt über einen eingebauten Isolator zur Erzeugung konstanter Ströme. |
Referenzen
- Kikillus, K. H., Hare, K. M., Hartley, S. Minimizing false-negatives when predicting the potential distribution of an invasive species: A bioclimatic envelope for the red-eared slider at global and regional scales. Anim Conserv. 13, 5-15 (2010).
- Lutz, P. L., Rosenthal, M., Sick, T. J. Living without oxygen: turtle brain as a model of anaerobic metabolism. Mol Physiol. 8, 411-42....
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Nachdrucke und Genehmigungen
