Det här protokollet beskriver hur man studera cellulära processer under cell öde konvertering i Caenorhabditis elegans invivo. Med hjälp av transgena djur, så att värme-chock arrangören-driven överuttryck av neuron öde-inducerande Transkriptionfaktorn CHE-1 och RNAi-medierad utarmning av kromatin-reglerande faktor LIN-53 bakteriecellen till neuron omprogrammering kan observeras in-vivo.
Studera biologiska processer i cellen under konvertera identiteterna för specifika celltyper ger viktiga insikter i mekanism som upprätthåller och skydda cellulära identiteter. Omvandling av könsceller till specifika nervceller i de nematoder Caenorhabditis elegans (C. elegans) är ett kraftfullt verktyg för att utföra genetiska skärmar för att dissekera rättsliga vägar att skydda etablerade cell identiteter. Omprogrammering av könsceller till en viss typ av nervceller som kallas ASE kräver transgena djur som tillåter bred över uttryck av Zn-finger transkription faktorn (TF) CHE-1. Endogena CHE-1 uttrycks enbart i två huvud nervceller och är skyldig att ange glutamatergic ASE nervceller ödet, som kan enkelt visualiseras av gcy-5prom::gfp reporter. En trans gen som innehåller den värme-chock arrangör-driven che-1 genen uttryck konstruktionen tillåter bred mis uttryck av CHE-1 i hela djuret vid värme-chock behandling. Kombinationen av RNAi mot kromatin-reglerande faktor LIN-53 och värme-chock-inducerad che-1 över uttryck leder till omprogrammering av mutagenitet i ASE neuron-liknande celler. Vi beskriver här särskilt RNAi förfarande och lämpliga villkor för heat-shock behandling av transgena djur för att framgångsrikt förmå bakteriecellen till neuron konvertering.
Cell öde omprogrammering av ektopisk TF uttrycket den myogenic TF MyoD, som, när, i ökad utsträckning omvandlar fibroblaster direkt i muskel-liknande celler1, har varit en forskningsinriktning i decennier. Differentierade celler finns dock ofta refraktära mot denna process, på grund av mekanismer som säkerställer deras cellulära identitet. Könsceller visar en liknande skyddsnivå och det finns bakomliggande mekanismer som ofta fungerar som en barriär för att förhindra bakteriecellen omvandling till andra celltyper vid över uttryck för en öde-inducerande TF. Typiskt, epigenetisk reglering såsom Histon ändringar och kromatinstruktur medför ett hinder för omvandling av cell öden2,3. Vi har tidigare tillämpas omvänd genetik med hjälp av RNAi knock-downs i C. elegans och identifierat faktorer som skydda cellulära identiteter och därmed motverka omprogrammering av könsceller i nervceller4. Specifikt, polycomb repressiva complex 2 (PRC2) och mycket Histon förkläde LIN-53 (CAF-1/RBBP/4/7 i människor) förhindra direkt omvandling av könsceller till specifika somatiska celltyper såsom glutamatergic smak nervceller i C. elegans 4 , 5. för att identifiera dessa bakteriecellen omprogrammering barriär faktorer, vi använde transgena djur som bär den värme-chock inducerbara Zn-finger TF CHE-1. CHE-1 uttrycks normalt i två huvud nervceller i C. elegans, där den anger öde glutamatergic smak nervceller kallas ASE6. ASE neuron öde kan visualiseras av uttryck av den ASE-specifika fluorescerande reporter gcy-5prom::gfp. GCY-5 är en chemoreceptor endast uttryckt i ASE rätt neuron7. Vid lin-53 utarmning av RNAi och induktion av breda ektopisk uttryck av CHE-1 heat-shock, kan könsceller omvandlas till nervceller i vivo4,5. Ännu viktigare, är tidpunkten för RNAi behandling avgörande eftersom endast vuxna maskar (P0 generationen) utsätts för lin-53 RNAi ge upphov till F1 avkommor djur med en könsceller som är tillåtande för omprogrammering i nervceller4.
Ovan beskrivna bakteriecellen neuron konvertering förfarandet i C. elegans kan användas för att studera en mängd biologiska frågor såsom implikationen av signalering utbildningsavsnitt i cell öde omprogrammering. Till exempel använde vi bakteriecellen CHE-1-inducerad omprogrammering till ASE nervceller vid RNAi mot lin-53 för att studera konsekvenserna av skåran signalering utbildningsavsnitt i processen bakteriecellen omprogrammering8. Genom att utföra dubbel RNAi för att tillsammans bryter lin-53 och Histon demethylase-encoding gene utx-1 vi visade att skåran signalering utbildningsavsnitt motverkar PRC2-medierad nedtystning genom att aktivera uttryck för UTX-1 i könsceller8 . Detta fynd visar att bakteriecellen omvandlingen till nervceller som beskrivs i detta protokoll kan användas för att studera en komplex biologisk process såsom cellulär omprogrammering i en intakt organism och i samband med olika utvecklings- och miljömässiga villkor. Det ger dessutom perspektiv att utmana könsceller över uttrycka olika öde-inducerande TFs att studera deras roll i begränsning av cellulär plasticitet9eller att bedöma deras potential för att inducera omprogrammering av könsceller att andra cell typer i vivo.
Däggdjur vävnadskulturer tillåter också att studera olika aspekter av cell öde omprogrammering, har celler odlade i kultur begränsad kapacitet att efterlikna signalering utbildningsavsnitt villkor jämfört med en intakt organism. C. elegans är därför en mångsidig modell för undersökning av olika biologiska processer såsom Notch signalering under omprogrammering i vivoroller. Dessutom är det en kraftfull modell för genetiska skärmar som är relativt lätt att underhålla och genetiskt modifiera för låga kostnader.
Samtidigt protokollet beskrivs med hjälp av transgena C. elegans stam BAT28 och RNAi mot lin-53 är enkel, ett antal steg är avgörande för att säkerställa det förväntade resultatet av bakteriecellen till neuron omprogrammering. Det är viktigt att stammen BAT28 hålls vid 15 ° C hela tiden innan experimenten. Under hantering och underhåll av stammen måste tiden vid temperaturer över 15 ° C minimeras så mycket som möjligt. Ordentlig värme-chock villkor är viktiga eftersom otillräcklig induktion av che-1 överuttryck inte resulterar i bakteriecellen till ASE neuron konvertering. Detta kan upptäckas genom att mäta den fenotyp penetrans som beskrivs i protokollet. Omfattande värme-chock kan leda till dödlighet av djuren. Exempelvis upplever plattor som har placerats nära innerväggar eller på botten marken av en statisk luft inkubator ofta omfattande värmebehandling. Därför är det rekommenderat att använda en ventilerad värme inkubator. Dessutom är tidpunkten för heat-shock induktion kritiska sedan över uttrycket av che-1 vid larval arrangerar tidigare då L3 kan leda till ektopisk gcy-5prom::gfp induktion i olika organ regioner såsom vulva (figur 3) 9. dessutom omfattande värme-chock kan upptäckas genom den fenotyp penetrans tom vektor RNAi djur som inte bör omfatta 5% och ökad auto-fluorescens av andra vävnader, nämligen tarmen.
Sporadiskt, kan RNAi bakterier förlora sin verksamhet för att effektivt producera dsRNA av målgenen. Tyvärr kan detta inte vara upptäckta före RNAi experimentet. I sådana fall bör en färsk strimma från glycerol odlas som beskrivs i avsnitt 2 i protokollet. Om det finns fortfarande ingen RNAi-orsakade pleiotropiska fenotyp synliga som den pvul fenotypen orsakas av framgångsrika RNAi mot lin-53, sedan en plasmid DNA isolering från respektive bakterier bör utföras och färska HT115 bakterier behöver vara förvandlade med L4400 plasmiden som innehåller sekvensen lin-53 .
Viktigt, den BAT28 stammen har en rulle fenotypen orsakas av den injektion markör pRF4, som användes under genmodifiering av djur med de hsp-16.2prom::che-1 DNA konstruktion. Ibland djur förlorar den rullande fenotypen, vilket kan tyda på Tystande av den hsp-16.2prom::che-1 transgenens. För att underhålla den BAT28 stammen, pick 10 roller djur till en färsk platta och propagera att välja för rullande djur.
Tillämpningen av protokollen som är begränsat till F1 RNAi förfarandet, vilket innebär att djur vars föräldrar (P0 generationen) inte har utsatts för lin-53 RNAi inte visas bakteriecellen till neuron omvandling på grund av moderns rescue4. Ett alternativt förfarande för att konvertera könsceller till nervceller har beskrivits av Ciosk och kollegor15 med hjälp av RNAi knock-down av gld-1 och mex-3 utan över uttryck för en transkriptionsfaktor. Men de erhållna nervcellerna tillhör inte en särskild typ av nervceller och könsceller också konvertera till muskel-liknande celler vid RNAi-medierad utarmning av gld-1 och mex-315. Tidigare har det visats att RNAi mot lin-53 tillåtna bakteriecellen omvandling till GABAerga neuron-liknande celler på över uttryck av Pitx-typ homoedomain Transkriptionfaktorn UNC-3016 istället för CHE-14 . För framtida inriktningar, kan olika öde-inducerande transkription faktorer kan testas om lin-53 utarmat könsceller konverteras till andra celltyper än specifika nervceller. I detta sammanhang inducerar överuttryck av myogenic bHLH Transkriptionfaktorn HLH-1, homolog av däggdjur MyoD17, konvertering av bakteriecellen till muskler vid lin-53 RNAi5. Etablerade omprogrammering av könsceller att en viss somatisk celltyp vid lin-53 RNAi och över uttryck för en lämplig öde-inducerande transkriptionsfaktor kan användas för ett antal olika genetiska skärmar. Sådan suppressor eller enhancer skärmar kan hjälpa till att dissekera reglerande vägar som spelar en roll under cell öde konvertering.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Alina El-Khalili och Martina Hajduskova för tekniskt bistånd. Vi tackar medlemmar i gruppen Tursun för synpunkter på manuskriptet. Detta arbete sponsrades av ERC-StG-2014-637530 och ERC CIG PCIG12-GA-2012-333922 och stöds av Max Delbrueck Center för molekylärmedicin i föreningen Helmholtz.
Chemicals | |||
Agar-Agar, Kobe I | Roth | 5210.1 | |
Bactopeptone | A. Hartenstein GmbH | 211 677 | Peptone Media |
Yeast extract | AppliChem | A1552,0100 | |
Amphotericin B | USBiological | A2220 | |
CaCl2 | Merck Biosciences | 208290 | |
Cholesterol | Roth | 8866.2 | |
Gelatine | Roth | 4275.3 | |
IPTG | Sigma | 15502-10G | |
K2PO4 | Roth | T875.2 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
MgSO4 | VWR | 25,163,364 | |
Na2HPO4 | Roth | P030.1 | |
NaCl | Roth | 9265.1 | |
NaClO | Roth | 9062.3 | |
NaOH (5 N) | Roth | KK71.1 | |
Tris | Roth | AE15.2 | |
Carbenicillin | Roth | 634412 | |
Tetracycline | Roth | 2371.2 | |
Incubators | |||
Incubator | New Brunswick Scientific C24 | M1247-0052 | for heat-shock |
Incubator | Sanyo MIR-5 | 5534210 | for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C |
Microscopes | |||
Fluorescence microscope | M205 FA | Leica | |
Microscope (Imaging) + camera | Axio Imager 2 | Zeiss | |
Microscope (Imaging) + camera | Sensicam | PCO | |
Stereomicroscope | SMZ745 | Nikon | |
Bacterial strains | |||
Escherichia coli HT115 | F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse III minus). |
||
Escherichia coli OP50 | Uracil auxotroph E. coli strain | ||
Worm strains | |||
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V. |
derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2 | ||
RNAi Clones | |||
lin-53 | SourceBioscience | ID I-4D14 | Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12 |
empty vetor: L4440 | Addgene | #1654 | |
Misc. | |||
Worm pick | self-made using a pasteur pipette and a platinum wire |