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Summary

Beweise sammeln, unterstützt die Idee, dass Pathogene Protein-Aggregate im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen verteilt zwischen den Zellen mit Prion-ähnliche Eigenschaften. Hier beschreiben wir eine Methode, die ermöglicht die Visualisierung von Zelle zu Zelle ausbreiten von Prion-ähnlichen Aggregaten im Modellorganismus Drosophila Melanogaster.

Abstract

Proteinaggregation ist ein zentrales Merkmal der meisten neurodegenerativen Krankheiten, einschließlich der Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Protein-Aggregate sind eng verbunden mit Neuropathologie bei diesen Erkrankungen, obwohl der genaue Mechanismus, mit dem aberranten Proteinaggregation normale zelluläre Homöostase stört, nicht bekannt ist. Daten liefern starke Unterstützung für die Hypothese, dass Pathogene Aggregate in AD, PD, HD und ALS haben viele Ähnlichkeiten mit Prionen, die nur-Protein Krankheitserreger für den transmissiblen spongiformen Enzephalopathien verantwortlich sind. Prionen replizieren selbst von Template die Konvertierung nativ gefaltet Versionen des gleichen Proteins, Ausbreitung des Phänotyps Aggregation verursacht. Wie Prionen und Prion-ähnliche Proteine in AD, PD, HD und ALS Übergang von einer Zelle zur anderen ist derzeit eine Fläche von intensiver Untersuchung. Hier wird ein Drosophila Melanogaster -Modell, das erlaubt, Überwachung der Prion-Like, Zell-Zell-Übertragung von mutiertem Huntingtin (Htt) Aggregaten verbunden mit HD beschrieben. Dieses Modell nutzt die leistungsstarke Werkzeuge zur Manipulation der Transgene Ausdruck in vielen verschiedenen Geweben in Drosophila und nutzt ein Eindringmittel getaggt zytoplasmatischen Protein direkt Bericht Prion-artigen Übertragung von mutierten Htt-Aggregate. Wichtig ist, kann der Ansatz, den wir hier beschreiben, verwendet werden, identifizieren neue Gene und Wege, die Verbreitung von Proteinaggregaten zwischen unterschiedlichen Zelle Arten in Vivozu vermitteln. Erkenntnisse aus diesen Studien werden die begrenzte Verständnis der pathogenen Mechanismen erweitern, die neurodegenerativen Erkrankungen zu Grunde liegen und zeigen neue Möglichkeiten für eine therapeutische Intervention.

Introduction

Die Prion-Hypothese besagt, dass der Erreger verantwortlich für die transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (z.B.Creutzfeldt – Jakob-Krankheit beim Menschen, Scrapie bei Schafen, verschwenden chronisch im Hirschen und Elchen und “Rinderwahnsinn” bei Rindern ) besteht ausschließlich aus Protein und frei von Nukleinsäuren¹. Prion-Krankheiten übernimmt die zellulären Prion-Protein (PrP^C) eine nicht-Native, stabile Falte (PrP-^Sc), die ist sehr Beta Blatt-reich und kann selbst durch die Umwandlung und Rekrutierung von Monomeren PrP^C Moleküle in stabilen Amyloid ausbreiten Aggregate. PrP-^Sc -Aggregate nutzen diesen selbstreplizierende Mechanismus zwischen verschiedenen Zellen in einem Organismus und sogar zwischen einzelnen Organismen²zu verbreiten.

Protein misfolding und Aggregation ist auch ein zentrales Merkmal der meisten neurodegenerativen Erkrankungen (Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Chorea Huntington (HD) und Amyotrophe Lateralsklerose (ALS))³. Bildung von Intra oder extra zellulare aggregierten Protein Baugruppen bei diesen Erkrankungen ist eng verknüpft mit Zytotoxizität⁴ und schreitet hoch reproduzierbare und krankheitsspezifische Pfaden durch das Gehirn über Zeit^{5, 6}. diese Muster der Ausbreitung legen nahe, dass Pathogene Aggregate mit diesen Erkrankungen assoziiert sind Prion-ähnliche Eigenschaften haben. Starke Unterstützung existiert nun für Prion-wie Übertragung der Aggregate zugeordnete AD, PD, HD und ALS – sie breitete sich von Zelle zu Zelle und Vorlage der Konformationsänderung der Monomere Formen des gleichen Proteins in zuvor nicht betroffen Zellen^{7, 8}.

Die Mehrheit der Studien, die untersuchen Prion-artigen Ausbreitung von Proteinaggregaten bisher wurden durchgeführt mit Säugerzelle Kultur Modelle, bei denen ein Übergang Aggregate in das Zytoplasma der naive Zellen aus dem extrazellulären Raum oder von einer anderen Zelle Zytoplasma^{9,10,11,12,13,14,15}, oder durch Einspritzen von Aggregat-haltigen Material in Mäusegehirnen und Überwachung aggregieren Auftritt außerhalb der Injektion Seite^{16,17,18,19,20,21,22, 23}. in jüngerer Zeit, transgene Tiere verwendet wurden, um nachzuweisen, dass die intrazelluläre Aggregate auf andere Zellen im intakten Gehirn^{24,25,26,27, verbreiten 28,29,30}. Hier beschreiben wir eine Methode für die direkte Visualisierung der aggregierten Transfer zwischen den einzelnen Zellen im intakten Gehirn von Drosophila Melanogaster. Drosophila -Modelle HD/Polyglutamin-(PolyQ) Krankheiten wurden vor fast zwei Jahrzehnten entwickelt^31,32 und haben viele wertvolle Einblicke in die pathogenen Mechanismen, die diese Störungen zugrunde liegen ³³. HD ist eine vererbte Neurodegenerative Erkrankung, verursacht durch eine autosomal dominante Mutation in dem gen, das für das Protein Huntingtin (Htt)³⁴kodiert. Diese Mutation führt zu Ausdehnung von einer PolyQ Strecke in der Nähe von Htts N-Terminus jenseits einer pathogenen Schwelle des ~ 37 Glutaminen, verursacht das Protein Misfold und insgesamt^35,36. Wildtyp Htt Proteine mit < 37 Glutaminen in diesem Küstenabschnitt erreichen ihre heimischen Herde, sondern induziert werden können, um aggregierte bei direktem Körperkontakt mit einer Htt Aggregat "seed"^12,27,37. Wir nutzen diese homotypische kernhaltigen Aggregation von Wildtyp Htt als einer Anzeige für Prion-wie Transfer und zytoplasmatischen Eintrag von mutierten Htt-Aggregate mit Ursprung in anderen Zellen.

Bestimmung der Mechanismen durch die Prion-ähnliche Aggregate kann Reisen zwischen Zellen zur Identifizierung der neue therapeutische Targets für unheilbare Neurodegenerative Erkrankungen führen. Wir nutzen Sie den schnellen Lebenszyklus, Benutzerfreundlichkeit und genetische Lenkbarkeit von Drosophila Melanogaster , molekulare Mechanismen für die Zell-Zell-Ausbreitung von mutierten Htt Aggregate zu definieren. Unsere experimentelle Strategie beschäftigt zwei binäre Expressionssysteme in Drosophila, etablierten Gal4-spezifische vorgelagerten aktivierende Sequenz (Gal4-UAS) System³⁸ und vor kurzem entwickelt QF-QUAS System³⁹zur Verfügung. Diese zwei unabhängige Kupplungssysteme ermöglicht Ausdruck von Mutanten und Wildtyp Htt transgenen auf unterschiedliche Zellpopulationen innerhalb der gleichen fliegen⁴⁰zu beschränken. Mit diesem Ansatz untersuchen wir Prion-ähnliche Verbreitung der mutierte Htt durch Überwachung der Umverteilung der zytoplasmatischen Wildtyp Htt von seinem normalerweise diffuse, löslichen Zustand zu einem aggregierten Zustand, eine direkte Folge der Körperkontakt mit einer vorgeformten mutierte Htt aggregierte “Samen”. Umwandlung von Wildtyp Htt durch mutierte Htt kann bestätigt werden, mit biochemischen und biophysikalische Techniken, die berichten von Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie Fluoreszenz Resonanz Energie transfer (FRET)^9,27,41 .

Wichtig ist, greifen wir auch eine große Anzahl von genetischen Werkzeuge in Drosophila , Gene und/oder Wege, die Prion-artigen Ausbreitung von Proteinaggregaten vermitteln zu identifizieren. Wir haben vor kurzem dieser Ansatz verwendet, um eine Schlüsselrolle für die Zelle Oberfläche Scavenger Rezeptor, Draper^42,43, bei der Übertragung von mutierten Htt Aggregate von neuronalen Axone zum nahe gelegenen phagocytic Glia in Drosophila zentrale enthüllen Nervensystem (ZNS)²⁷. So kann die genetischen und Imaging-basierte Ansatz, den wir hier beschreiben wichtige biologische Basisinformationen über ein krankheitsrelevante Phänomen in der einfach zu bedienenden aber mächtige Modellorganismus Drosophilaoffenbaren.

Protocol

(1) Kupplung Gal4 – und QF-vermittelten Htt Transgene Ausdruck in Drosophila

1. Sammeln und/oder transgenen Drosophila Melanogaster generieren Zeilen mit gewebespezifischen Gal4 oder QF “Treiber”, als auch Zeilen mit Wildtyp oder mutierte Htt-transgene stromabwärts des Gal4-UAS³⁸ oder QF-QUAS³⁹. Sicherzustellen Sie, dass die Proteine, die aus diesen transgene ausgedrückt sind verschmolzen, fluoreszierende Proteine oder Epitop-Tags ermöglichen eine Differenzierung des Mutanten und Wildtyp Htt-Transgen-Produkte in der gleichen fliegen. Siehe Abbildung 1.
   Hinweis: Wir verwenden in der Regel Exon 1 Fragmente der menschlichen Htt-gen²⁷. Jedoch können transgene fliegen stattdessen generiert werden, um längere Htt Fragmente oder andere Gene auszudrücken, wenn gewünscht.
2. Planen Sie die genetischen Strategie, so dass Mutanten und Wildtyp Htt transgene in unterschiedliche, nicht überlappende Zellpopulationen ausgedrückt werden.
   1. Tritt Überschneidungen Ausdruck werden, Mutanten und Wildtyp Htt-Proteine, die in den gleichen Zellen synthetisiert Co aggregieren und Erkennung der Prion-ähnliche Ereignisse verhindern. Um dies zu vermeiden, verwenden die Gal4 und QF spezifische Repressoren, Gal80 und QS⁴⁰, (Abbildung 1). Entwicklungsgeschichtlich gesteuert Gal4 und/oder QF Treiber auswählen kann Hilfe, Ausdruck der mutierte Htt auf Post-mitotischen Zellen, wodurch die Möglichkeit die Zellteilung zu beschränken, Verbreitung von Zelle zu Zelle Aggregat beitragen könnten.
3. Mit Kultivierung Standardbedingungen, Paaren Sie sich die fliegen um Nachkommen zu erzeugen, die mutierten Htt über QF (oder Gal4) in einem “Spender” Zell-Population und Wildtyp Htt per Gal4 (QF) in einen “Empfänger” Zellpopulation ausdrücken. Siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung zeigt eine mögliche genetische Kombination.
   Hinweis: Die QF und Gal4-Treiber, die verwendet wurden, um die Daten in den Figuren 1-4 und in unseren vorherigen Veröffentlichung²⁷ gezeigt generieren enthalten DA1 olfaktorischen Rezeptor Neuron (ORN) Treiber, Or67d-QF, und die Pan-Glia Fahrer, Repo-Gal4.
4. Generieren Sie Kontrolle fliegen parallel, die Wildtyp Htt in beiden Zellpopulationen QF und Gal4 beschriftet ausdrücken.
5. Nachkommen des gewünschten Genotyps zu sammeln, und Alter der Tiere je nach Bedarf.

Abbildung 1 . Genetischer Ansatz für gekoppelte Ausdruck von Mutanten und Wildtyp Htt transgenen mit der QF-Trainingsmaßnahme und Gal4-UAS binäre Expressionssysteme. In “Zelle A,” ist eine mCherry-Tags mutierte Htt Protein mit einer pathogenen Länge PolyQ Strecke (Q91) ausgedrückt, mit einem QF-Treiber befindet sich hinter der gewebespezifischen Promoter ein (“P^A“). Im “Zelle B,” wird ein YFP getaggt Wildtyp Htt mit einer normalen PolyQ Strecke (F25) über eine Gal4-Treiber gesteuert von gewebespezifischen Promoter B (“P^B“) ausgedrückt. In Abbildungen 2-4Or67d-QF diente, QUAS HttQ91 mCherry Ausdruck in DA1 ORNs zu fahren, und Repo-Gal4 wurde zur FH-HttQ25-YFP in allen Glia²⁷zum Ausdruck zu bringen. Wichtig ist, ist HttQ91-mCherry nur in QF exprimierenden Zellen aufgrund der QUAS Sequenz platziert oberhalb des Transgens ausgedrückt. Ebenso äußert sich HttQ25-YFP nur über Gal4, die speziell die UAS erkennt. Wenn Überschneidungen in der Gewebeverteilung von QF und Gal4-Treiber erkannt wird, können transgene Codierung QS in Gal4 exprimierenden Zellen und Gal80 in QF exprimierenden Zellen eingebracht werden. Anfügen von fluoreszierenden Proteins Tags auf Wildtyp und mutierte Htt ermöglicht eine Differenzierung der beiden Proteine während der Bildgebung und der Fähigkeit, Bund zwischen geeigneten Spender/Akzeptor-Paare (z. B.GFP/YFP oder YFP/mCherry) zu messen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

2. Micro-Dissektion und Fixierung der Erwachsenen Drosophila Gehirn

Hinweis: Dieses Verfahren Dissektion aus einer früheren Veröffentlichung⁴⁴geändert wurde, und kann verwendet werden, um die Gehirne für bildgebende direkte Fluoreszenzsignal vom Htt-fluoreszierende Protein Fusionen vorzubereiten. Änderungen an dem Verfahren, das für Immunostaining Gehirn vorgenommen werden können werden im nächsten Abschnitt besprochen.

1. Die folgenden Materialien zu sammeln und auf Eis: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,03 % Triton x-100 (PBS/T); Microcentrifuge Rohre mit 970 µL 4 % Paraformaldehyd (PFA) Fixativ Lösung vorbereitet, indem man 200 µL 20 % PFA, 770 µL PBS/T; eine Klarglas-Schale mit gut; ein Einweg-Transferpipette; zwei sezierenden Pinzetten (Nr. 3 und Nr. 5).
2. Betäuben Sie die Erwachsenen fliegen mit CO₂ zu und übertragen Sie sie auf einen Brunnen der Glasschale auf Eis.
3. Mit einem Transferpipette, fügen Sie eine kleine Menge (~ 500 µL) von kaltem PBS/T, die gut mit die fliegen auch über einen leeren Brunnen. Vermeiden Sie zu viele Luftblasen Einführung, wie sie die Dissektion stören können.
4. Legen Sie die Glasschale auf einer ebenen Fläche unter dem sezierenden Mikroskop und passen Sie die Vergrößerung bis fliegende Körper das Sichtfeld füllt und im Mittelpunkt steht.
5. Positionieren Sie ein paar Schwanenhals Lichtquellen so, dass Licht beidseitig der Glasschale beleuchtet ist. Verankern Sie eine gefaltete Labor Gewebe unter der Glasschale, Körper Teile/Nagelhaut während der Präparation zu verwerfen.
6. Mit der Nr. 3-Zange in der nichtdominanten Hand übertragen Sie eine Fliege in der gut mit PBS/T. immobilisieren die Fly-by-grabbing von seinen Bauch mit der Bauchseite nach oben halten.
7. Halten Sie die Fliege vollständig untergetaucht in PBS/T, entfernen Sie den fliegen Kopf mit der Nr. 5 Zangen in die dominante Hand. Legen Sie ein Tipp von dieser Zange unter die Nagelhaut in dem kleinen Raum neben dem Rüssel auf der einen Seite des Kopfes fliegen. Befestigen Sie den Griff am Kopf durch Kneifen die Zange um das Auge von beiden Seiten greifen.
8. Entfernen Sie die Fliege Kopf aus seinem Körper durch Auseinanderziehen der beiden Zangen. Entsorgen Sie die fliegen Körper auf ein Labor Gewebe in der Nähe positioniert. Behalten Sie Druck auf die dominante Hand Zange bei, damit die Fliege Kopf nicht verloren geht.
9. Position ein Tipp der Nr. 3 Zange in der nichtdominanten hand in der gleichen kleinen Raum unter die Nagelhaut auf der anderen Seite der Rüssel. Einmal positioniert, drücken Sie die Zange um die Augen an der gleichen Stelle auf beiden Seiten des Kopfes zu greifen.
10. Sobald der Griff auf die Nagelhaut nicht sicher ist, vorsichtig Auseinanderziehen der Zange um 180°. Diese Aktion wird die Kopf Kutikula Auseinanderbrechen ohne Beschädigung des Gehirns. Kutikula Rückstände auf einem Labor-Gewebe zu verwerfen.
    1. Obwohl ideal, kann die Kopf Kutikula nicht vollständig in einem Schritt entfernt werden. In diesem Fall entfernen Sie die Nagelhaut Stück für Stück, bis das Gehirn voll ausgesetzt ist. Achten Sie darauf, nicht das Gehirn schädigen durch die Vermeidung von direktem Kontakt mit der Zange.
11. Die PBS/T entfernen Sie sezierten Gehirns durch aufmerksamkeitsstarke Ahold eine angehängte Luftröhre oder durch Absaugen des Gehirns in den Raum zwischen den Spitzen der Zange durch Kapillarwirkung.
    Hinweis: Luftröhre Entfernung ist optional, da es dazu neigt, nicht darüber hinwegtäuschen, wo wir in der Regel Bild, die Riechzentrum Lappen auf der Vorderfläche des Gehirns. Jedoch wenn die Luftröhre Bildgebung stören, entfernen sie sorgfältig so dass das Gehirn durch diese Manipulation nicht beschädigt wird.
12. Übertragen Sie das Gehirn der Fliege in eines der Mikrozentrifugenröhrchen mit Fixativ Lösung auf Eis. Sicherstellen Sie, dass das Gehirn löst sich von der Zange und ist in das Fixativ Lösung getaucht.
13. Sobald alle Gehirne seziert wurden, haben sie unterwerfen “kurz-Fix” indem die geschlossene Rohre auf eine Nutator für ~ 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
    Hinweis: Dieser Schritt kurze Fixierung sorgt dafür, dass die Gehirne einfacher sind zu handhaben in den nachfolgenden Schritten und nicht an den Seiten des Microcentrifuge Schlauch haften.
14. Den Großteil der Fixativ Lösung mit einer Pipette P1000 entfernen und entsorgen.
    1. Vermeiden Sie Gehirne aus der Tube während dieser und jeder weiteren Waschschritt absaugen. Der P1000 auf ein geringeres Volumen (z.B. 650 µL) festgelegt und den Überstand in zwei Schritten zu entfernen. Darüber hinaus halten Sie die Mikrozentrifugenröhrchen im Einklang mit einer Lichtquelle (z.B. Deckenbeleuchtung) beim Absaugen um das Gehirn besser zu visualisieren.
15. Fügen Sie 1 mL frisch PBS/T auf die Gehirne. Schnell waschen (< 1 min) in der Dunkelheit, Aspirieren den Überstand aus dem Gehirn, und entsorgen.
16. Wiederholen Sie das Waschen mit PBS/T im Dunkeln bei Raumtemperatur nach dem folgenden Schema: 2 Quick (< 1 min) Waschungen, 1 X 5 min, 3 X 20 min und 1 X 1 h waschen. Sichern Sie Tops auf Mikrozentrifugenröhrchen zu und die Rohre auf eine Nutator zwischen den Wäschen.
    1. Nach Wunsch DAPI-Färbung ersetzen das letzte 1 h waschen mit 1 X 30 min Inkubation mit 250 ng/mL DAPI verdünnt in PBS/T, gefolgt von 2 X schnell und 1 X 20 min. wäscht.
17. Entfernen Sie nach dem letzten Waschen den Großteil der Wäsche Puffer überstand, kümmert sich nicht um die Gehirne zu stören und 30 µL Glycerin-basierte antifade Reagenz in den Gehirnen. Bei 4 ° C ohne Bewegung für mindestens 1 h und bis zu 24 Stunden im Dunkeln inkubieren.

3. Änderungen in Kapitel 2 für Immunostaining erwachsenen Gehirn

Hinweis: Verwenden Sie dieses Protokoll für imaging-fluoreszierende Proteine oder fluoreszierende Protein Fusionen mit schwache Fluoreszenz.

1. Erhöhen die Konzentration von Triton x-100 in PBS/T von 10-fach (PBS + 0,3 % Triton x-100) für jeden Schritt. Dies stellt sicher, dass genug Waschmittel vorliegt, permeabilize Zellmembranen und Antikörper intrazelluläre Räumen Zugang zu ermöglichen.
2. Fix die Köpfe in 4 % PFA in PBS/T für 20 min bei Raumtemperatur.
3. Brüten Sie nach Durchführung aller Waschungen die Köpfe in frisch zubereiteten blockierende Puffer (PBS/T + 5 % normalem Ziegenserum (NGS)) für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
4. Entfernen und entsorgen des blockierenden Puffers. Hinzufügen von 0,5 mL der Primärantikörper Lösung pro Röhre als master-Mix durch Verdünnung Primärantikörper in frischen blockierende Puffer entsprechend vorbereitet (siehe Tabelle der Materialien für häufig verwendete Antikörper und Verdünnungen). Inkubieren Sie die Köpfe in primären Antikörper auf eine Nutator für mindestens 24 Stunden bei 4 ° C im Dunkeln.
5. Entfernen Sie die primären Antikörper-Lösung aus dem Gehirn mit einem P1000 und reservieren Sie in einem frischen Rohr. Fügen Sie 1 mL PBS/T um die Gehirne zu waschen.
   Hinweis: Die reservierten Primärantikörper Lösung kann für bis zu vier Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden. Wir haben erfolgreich Primärantikörper bis zu zwei Mal in späteren Experimenten recycelt.
6. Die Gehirn schnell waschen (< 1 min) in PBS/T, Aspirieren des Überstands von Gehirnen und entsorgen. Wiederholen Sie diese schnellen waschen noch einmal.
7. Weiter waschen mit 1 mL PBS/T bei Raumtemperatur nach dem folgenden Schema: 1 X 5 min, 3 X 20 min und 1 X 1 h waschen. Sichern Sie Tops auf Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie die Rohre bei Waschungen auf eine Nutator.
8. Nach dem letzten Waschen, entfernen Sie den Großteil der PBS/T überstand und 0,5 mL Sekundärantikörper Lösung als ein master-Mix durch eine Verdünnung der Antikörper in frischen blockierende Puffer entsprechend vorbereitet (siehe Tabelle der Materialien für häufig verwendete Antikörper und Verdünnungen). Inkubieren Sie Gehirne in Sekundärantikörper für 24 Stunden bei 4 ° C im Dunkeln.
9. Wiederholen Sie die Schritte der Wäsche in Schritten 3.5, 3.6 und 3.7 nach Inkubation mit Sekundärantikörper.
10. Entfernen Sie nach dem letzten Waschen den Großteil der Waschpuffer und stellen Sie sicher, dass alle Köpfe an der Unterseite des Rohres befinden. Die Gehirne 30 µL antifade Reagenz hinzufügen. Bei 4 ° C ohne Bewegung für 16-24 h im Dunkeln inkubieren.

4. Gesamt-Hirn Montage

1. Legen Sie einen Glas-Objektträger unter einen sezierenden Mikroskop und eine Beschriftung mit Informationen zur Identifizierung.
   Hinweis: Alternativ können die Gehirn direkt auf einem Deckglas auf beiden Seiten des Gehirns während der Bildgebung montiert werden. Ein Protokoll beschreibt diese Montage-Verfahren wurde bisher veröffentlichten⁴⁵.
2. Entfernen Sie die Gehirne von jeder Microcentrifuge Schlauch mit einer abgestumpften Pipettieren Spitze (vorbereitet mit einer Rasierklinge unten entfernen ~ 1 cm über einen 1-200 µL Tipp) und in der Mitte der Folie übertragen. Als kleine antifade Reagenz mit dem Gehirn wie möglich übertragen.
3. Verwenden Sie Zange, um die Köpfe in die gewünschte Ausrichtung (z.B.dorsal zeigt in Richtung zur Oberseite der Folie und Vorderfläche nach oben für das Riechzentrum Lappen imaging) zu positionieren. Berücksichtigen Sie die Gehirne zu orientieren, den Strahlengang des Mikroskops für imaging-sie verwendet werden.
4. Entfernen Sie überschüssige antifade Reagenz aus der Folie mit der spitzen Ecke eines gefalteten Lab Gewebes ohne die Gehirn zu stören. Lassen Sie den Schlitten sitzen für ~ 5-10 min in der Dunkelheit um die Gehirne zur Einhaltung der Folie zu ermöglichen.
5. Umgeben die fliegen Köpfe mit vier kleine Stücke Cover Glasscherben gelegt auf jeder Seite des Gehirns um ein Quadrat zu bilden, ist ~ 19 mm x 19 mm. Legen Sie eine Kante von einem 22 x 22 mm Nr. 1.5 Deckglas nur außerhalb eines dieser kleinen Stücke aus Glas , und senken Sie das Deckglas vorsichtig über die Köpfe die Brücke-Mount abgeschlossen.
6. Frische antifade Reagenz um die Oberfläche unter das Deckglas, wobei Sie darauf achten, nicht zu stören das Deckglas oder das Gehirn zu füllen langsam zu verzichten. Wischen Sie alle überschüssige Antifade mit der spitzen Ecke eines gefalteten Lab Gewebes ohne direkten Kontakt mit dem Deckglas.
7. Einen Tropfen von klaren, schnell trocknender Nagellack auf jeder der vier Ecken das Deckglas. Trocknen lassen ~ 10 min. Dann die vier Kanten des Deckglases mit Nagellack komplett umschließen die Gehirn zu versiegeln.
8. Bild Gehirn sofort, oder erst unmittelbar bei 4 ° C lagern.
   1. Wenn intrinsische Fluoreszenz von Htt-fluoreszierende Protein Fusionen imaging, Bild die Gehirn innerhalb von 24 h für das beste Signal.

(5) imaging und Quantifizierung von Prion-wie Übertragung der Aggregate

1. Bild der montierten Gehirne mit einem konfokalen Mikroskop, ausgestattet mit einem 40 X oder 60/63 X Öl Ziel Z-Schnittbilder durch die Region des Gehirns zu sammeln, wo die ausgewählten Gal4 und QF-Treiber ausgedrückt werden (Abbildung 2A, B).
   1. Begeistern die fluoreszierenden Proteins Fusionen oder Immunolabeled Proteine mit Hilfe von geeigneten Lasern (z. B.488 nm für GLP/YFP/FITC oder 552 nm für mCherry/Cy3). Set Erkennung Fenster, die maximale Leuchtstofflampen zu erfassen signalisieren, während die Beseitigung Kanal Übersprechen mit entweder spektrale Detektionssystem oder Band/lange pass Emission Filter speziell für jedes Fluorophor.
      Hinweis: Seien Sie aufmerksam beim Protein-Aggregate abbilden. Es ist einfach für Pixel in der Mitte jedes Aggregat zu gesättigt werden, vor allem in größeren Aggregaten. Versuchen Sie, die Sättigung des Bildes zu minimieren, aber beachten Sie das Risiko des Verlustes Signal aus kleineren aggregierten Arten (Abbildung 2B, C, D). Zu viel Sättigung erhöht den Bildhintergrund, erschwert die isolierte Puncta identifizieren. Testen Sie verschiedene bildgebende Einstellungen zur Optimierung vor der Einnahme der endgültigen Bilder in jedem Datensatz.
2. Analysieren Sie die Daten durch Quantifizierung einzelner Puncta entweder manuell durch Verschieben durch individuelle Z-Scheiben (z. B. Abbildung 2C und Abbildung 4A) oder nach dem Rendern der konfokalen Scheiben in 3 Dimensionen (Abbildung 3 ” A, B).
   Hinweis: Dies kann in Bild J oder anderen Bildverarbeitungs-Software erfolgen.
   1. Wenn die Aggregate gut getrennt sind und es minimaler Hintergrundfluoreszenz gibt, verwenden Sie Bildanalyse-Software, um systematisch zu identifizieren, zu quantifizieren und analysieren die Aggregate als unterschiedliche “Objekte” oder “Oberflächen” in eine 3D-Rekonstruktion der konfokalen Stack ( Abbildung 3 ( B).
      Hinweis: Software-Aktionen beschrieben sind spezifisch für das Instrument und die hier verwendete Software (siehe die Tabelle der Materialien).
      1. Visualisieren einer konfokalen Z-Serie in 3D Anzeigemodus. Verwenden Sie den “Analyse”-Assistenten, um einzelne Flecken in einem ausgewählten Kanal (z.B. der rote-Kanal für HttQ91-mCherry in Abbildung 3Aggregate) zu identifizieren. Passen Sie die Schwellwerte und filtern um genau alle heterogen große Aggregate als einzelne Objekte im Bild darzustellen.
      2. Aktivieren Sie “Split Objekte” unter “Binäre Verarbeitung Vorfilter” eng verbundenen Aggregate zu trennen, die abweichend von der Softwarealgorithmus zusammengeführt werden. Beachten Sie, dass die Gesamtzahl der Objekte und ihre zugehörigen Messungen ausgewiesen ist “Messungen.”
         Hinweis: Diese Methode zur Quantifizierung der mutierten Htt Aggregate ist nicht das Immunostaining Protokoll zugänglich, da das Zentrum des Amyloid Aggregate ist undurchdringlich, Antikörper. Infolgedessen die Aggregate erscheinen auf dem Mikroskop als ringartige Strukturen und Bildanalyse-Software ist nicht in der Lage genau zu identifizieren und diese einzelnen “Flecken” zu unterscheiden.
   2. Wildtyp Htt Aggregate zu quantifizieren, indem manuell durch den Z-Stapel und scoring Wildtyp Htt Aggregate, sicherstellen, dass keine Aggregate sind Doppel-gezählt, wenn sie in mehr als einem erscheinen Slice (Abb. 4A).
      Hinweis: Diese manuelle Quantifizierung Ansatz kann verwendet werden, wenn die Anzahl der Aggregate in jedem konfokale Stack vernünftig (z.B.20-50 ist). Es ist auch hilfreich bei der Bildanalyse-Software individuelle Puncta aus umliegenden Signal in den gleichen Kanal (z.B.Signal vom diffusen Wildtyp Htt in benachbarten Zellen) unterscheiden kann (Abbildung 2B, C und Abbildung 4 ( A). Quantifizierung der Wildtyp Htt Aggregate kann auch schwierig sein, da viele normale Strukturen im Gehirn punctata (z.B.Zellprozesse und Synapsen) angezeigt werden. Co Lokalisierung der Wildtyp und Mutanten Htt-Signale kann als Auswahlkriterium verwendet werden; Es ist jedoch möglich, dass einige mutierte Htt “Samen” unterhalb der Nachweisgrenze von der konfokalen fallen. Ein Protein als Htt, die nicht in den Empfängerzellen (z. B.GFP) aggregiert wird kann verwendet werden, um unabhängige punktförmige Strukturen im Gehirn zu beschriften.
3. Verwenden Sie Bildanalyse-Software, um weitere Charakterisierung der einzelnen Aggregate durchzuführen. Zum Beispiel bestimmen die Größenverteilung der Aggregate (Abb. 3C) Prozent Co Lokalisierung zwischen Mutanten und Wildtyp Htt Proteine (Abb. 4A), oder direkt messen mit Bund (Protein-Protein-Wechselwirkungen Abbildung 4 ( B).
   1. Bestimmen Sie die Größenverteilung der einzelnen Puncta mit einem Ort oder Oberfläche Erkennungsalgorithmus, der alle sichtbaren Aggregate in einem bestimmten Kanal genau identifiziert. Die Bildanalyse-Software verwenden, um relevante Messungen von Flecken oder Flächen, zum Beispiel ‘aggregierten Durchmesser’ erhalten (Abb. 3 C), “Lautstärke” oder ‘Intensität’ Informationen aus “Messungen” in der Software “Analyse” Assistent in Schritt 5.2.1 beschrieben.
      Hinweis: In Abbildung 3Cberichten wir die Verteilung der Durchmesser für alle HttQ91-mCherry Puncta in einem einzigen DA1 Glomerulus identifiziert.
   2. Bestimmen Sie die Prozent Co Lokalisierung zwischen HttQ25-YFP und HttQ91-mCherry-Aggregate durch manuelles Verschieben Slice durch Schnitt durch einen konfokale Z-Stapel (genaueste Methode). Aber achten Sie darauf, nicht zweimal Aggregate zählen. Um dies zu verhindern, zählen Sie nur Aggregate in einer bestimmten Z-Scheibe, wenn die Fokusebene durch das Zentrum des Aggregats (Abb. 4A) ist.
   3. FRET-Effizienz für induzierte HttQ25-YFP Aggregate mit colocalized HttQ91-mCherry-Signal mit der Akzeptor-Immunofluoreszenz-Methode zu berechnen.
      1. Schließen Sie zuerst mögliche Übersprechen zwischen YFP und mCherry Kanäle durch die Schaffung Erkennung Windows für nur mCherry und YFP nur Signale, die in den anderen Kanal kein Signal zu erzeugen. Mit diesen Einstellungen nehmen Sie ein “vorher Bild” der einzelnen HttQ25-YFP Puncta und ihre damit verbundenen HttQ91-mCherry-Signal ( Abbildung 4B).
      2. Dann Photobleach die mCherry signalisieren durch Anpassen der roten Lasers (z.B.552 nm) zu 100 % Intensität und Scan bis das Signal verschwunden ist. Wiederherstellen der Einstellungen für die “vorher Bild”, und nehmen Sie ein “after-Image” des gleichen Puncta (Abbildung 4B).
      3. Fluoreszenz-Intensität-Messungen für jedes Punctum vor und nach Immunofluoreszenz mit Bildanalyse-Software zu berechnen.
      4. FRET-Effizienz durch Subtrahieren YFP Spender Fluoreszenz gemessen in berechnen die “vorher Bild” (YFP_erste) von YFP Spender Fluoreszenz im after-Image (YFP_final). Teilen Sie diesen Wert durch YFP_Finale, und mit 100 multipliziert.
         Hinweis: FRET-Effizienz kann Pixel für Pixel oder insgesamt für jedes HttQ25-YFP-Aggregat (Abbildung 4B) berechnet werden. Akzeptor Immunofluoreszenz ist eine besonders nützliche Technik für die Berechnung der FRET-Effizienz, wenn das mCherry Signal verbunden mit jeder HttQ25-YFP Punctum hoch genug, um nachweisbar YFP dequenching nach mCherry Immunofluoreszenz zu produzieren ist.

Representative Results

Discussion

Da die Zahl der Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen weiter zu erhöhen, gibt es eine dringende Notwendigkeit, das Verständnis der molekularen Pathogenese dieser Erkrankungen erhöhen, so dass bessere Therapien entwickelt werden können. Hier beschreiben wir Methoden, die für die Überwachung der Prion-artigen Übertragung von pathogenen Proteinaggregaten zwischen verschiedenen Zelltypen in der Modellorganismus Drosophila Melanogaster. Wir haben vor kurzem diese Methode verwendet, um Prion-wie Getriebe des mutierten Htt Aggregate in Vivo zu demonstrieren und phagocytic Rezeptor zu identifizieren, die, der Verbreitung dieser Aggregate von Neuronen, Glia²⁷vermittelt. Unser Ansatz nutzt mehrere Vorteile der Verwendung von Drosophila , um genetische Krankheiten zu studieren: seine kurzen Lebenszyklus und große genetische Toolset, die Entdeckung der grundlegenden biologischen Informationen beschleunigen kann, die therapeutisch relevant sind.

Die Methoden, die wir hier beschreiben bieten zwei große Vorteile gegenüber anderen vorhandenen Tier und Zell-Kultur-Modelle für die Prion-artigen Übertragung: (1) der Aggregation Erreger (z. B.mutierte Htt) entsteht in einer Zelle mit Wohnsitz in einem intaktem Gewebe und (2) Ausdruck der Regel gefaltet Version des gleichen Proteins (z.B.Wildtyp Htt) in einer separaten Zellpopulation bietet einen leicht zugänglichen “Reporter” für Prion-ähnliche Veranstaltungen. Mithilfe von genetischen Spezialtools, die etablierten in Drosophila⁴⁰sind, haben wir Ausdruck von Mutanten und Wildtyp Htt Proteinen in nicht überlappende Zell-Populationen innerhalb des gleichen Organismus erreicht. Da viele verschiedene gewebespezifischen Gal4 und QF-Treiber zur Verfügung stehen, ist die Prüfung Prion-wie Transfer zwischen im wesentlichen unterschiedliche Zelltypen im Körper fliegen möglich.

Eine wichtige Komponente des Ansatzes ist das getrennte Ausdruck von Mutanten und Wildtyp Htt Proteinen in verschiedenen Zell-Populationen innerhalb der selben Tier erreichen. Überlappungen Ausdruck muss beseitigt werden, so dass Wildtyp Htt Aggregation in Empfängerzellen genau zytoplasmatischen Eindringen von Prion-ähnliche Aggregate mit Ursprung in Spender Zellen^{9,12,27berichtet, 41}. Dies kann erreicht werden durch die Einführung von zusätzlichen genetischen Werkzeuge (z.B. Gal80 und QS Repressoren⁴⁰) um dieses Problem zu lindern. Sobald die ideale Genotyp entwickelt und ausgewählt ist, muss eine systematische Methode zur Quantifizierung der Puncta hergestellt werden. Dies hängt weitgehend von der Anzahl von Zellen, die beschriftet werden, die Anzahl der Aggregate, die angezeigt werden, und das Signal-Rausch-Verhältnis der Probe. Kriterien wie Co Lokalisierung und/oder positive Bund können für die Analyse der Daten verwendet werden, wie wir hier in Abbildung 4beschrieben haben. Allerdings können Einschränkung der Auswahl von Wildtyp Htt Aggregate anhand dieser Merkmale führen zu Unterschätzung des Prion-ähnliche Übertragungsereignisse, da einige mutierte Htt aggregierten Samen unterhalb der Nachweisgrenze des konfokalen Mikroskops fallen könnten.

Der hier beschriebene Ansatz in Vivo ist nicht exklusiv für Prion-ähnliches Verhalten der Aggregate HD oder auch anderen PolyQ Störungen zugeordnet. Transgene fliegen können entwickelt werden, um die Prion-ähnliche Verbreitung von Alpha-Synuclein in PD, Tau n. Chr., zu untersuchen und SOD1 oder TDP-43 in ALS mit dem gleichen experimentellen Paradigma. Für jede dieser Proteine sollte eine Aggregation neigende Mutant in Spenderzellen und eine lösliche Version des gleichen Proteins, dass nur Aggregate als kernhaltige in Empfängerzellen ausgedrückt werden sollte ausgedrückt werden. Dieses experimentelle Paradigma kann auch zur Untersuchung der aufstrebenden Idee, dass Pathogene Proteine verbunden mit verschiedenen Krankheiten durch ein Kreuz Aussaat Mechanismus⁴⁷interagieren könnte nützlich sein. Schließlich können die unzähligen genetischen Werkzeuge in Drosophila angewendet werden, um nachzuforschen und molekularen Mechanismen zugrunde liegen, Zytoplasma, Zytoplasma Verbreitung von pathogenen Proteinaggregaten verbunden mit diesen tödlichen Krankheiten zu identifizieren.

Materials

Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	AM9625	Dilute to 1X
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-1L
Kimwipes	Thomas Scientific	2904F24
20% paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15713-S
Normal Goat Serum (NGS), filtered	Lampire Biological Laboratories	7332500	Aliquot and freeze upon receipt
Chicken anti-GFP	Aves Labs	GFP-1020	Use at 1:500 dilution
Rabbit anti-DsRed	Clontech	632496	Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain
FITC anti-chicken	ThermoFisher Scientific	SA1-7200	Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 568 anti-rabbit	Life Technologies	A11011	Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody	Life Technologies	A21235	Use at 1:250 dilution
Slowfade Gold Antifade Reagent	Life Technologies	S36936
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisher Scientific	12-550-143
Cover Glass (22 x 22 mm)	Globe Scientific	1404-15
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3	Ted Pella	503	use in non-dominant hand
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5	Ted Pella	505	use in dominant hand
LAS X image analysis software	Leica
Imaris image analysis software	Bitplane