Nutzung eines umfassenden Immunopräzipitation Bereicherung System um eine endogene Post-translationale Modifikation Profil für Zielproteine zu identifizieren

Zusammenfassung

Untersuchung mehrere, können endogene post-translationalen Modifikationen für ein Zielprotein extrem schwierig sein. Hier beschriebene Techniken nutzen eine optimierte Lyse Puffer und Filter System entwickelt mit spezifischen PTM-targeting, Affinität Matrizen, die Acetylierung, Ubiquitination, Sumoylierung 2/3 und Tyrosin Phosphorylierung Änderungen für ein Ziel zu erkennen Protein mit einem einzigen, gestrafften System.

Zusammenfassung

Es ist jetzt gut geschätzt, dass post-translationalen Modifikationen (PTMs) spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulierung des Proteins Struktur und Funktion, die für ein gegebenes Protein Rolle physiologisch und pathologisch sein kann. Anreicherung von PTMs ist oft notwendig, bei der Untersuchung des PTM-Status an ein Zielprotein, weil PTMs oft vorübergehend sind und die relativ in Hülle und Fülle geringen. Viele Fallstricke sind anzutreffen, wenn für eine PTM ein Zielprotein bereichernd wie Puffer Inkompatibilität der Ziel-Protein-Antikörper ist nicht IP-kompatibles und PTM Signalverlust. Der Schwierigkeitsgrad wird vergrößert, wenn mehrere PTMs wie Acetylierung, Ubiquitination, Sumoylierung 2/3 und Tyrosin Phosphorylierung für ein vorgegebenes Zielprotein untersucht. Eine Kombination aus diesen PTMs studieren kann erforderlich sein, wie Übersprechen zwischen PTMs weit verbreitet und für Protein-Verordnung von entscheidender Bedeutung ist. Oft sind diese PTMs in verschiedenen Lyse Puffern und mit einzigartigen Inhibitor Kompositionen studiert. Um den Prozess zu vereinfachen, ein einzigartiges denaturierenden Lyse-System wurde entwickelt, die effektiv isoliert und bewahrt diese vier PTMs; Untersuchung der potenziellen Übersprechen damit in einem einzigen Lyse-System. Ein einzigartiges Filtersystem wurde entwickelt, um die Kontamination von genomischen DNS aus der lysate, welches ein problematischer Nebenprodukt der Denaturierung Puffer ist zu entfernen. Robuste Affinität Matrizen auf jeder der vier PTMs wurden im Konzert mit dem Puffersystem zur Maximierung der Bereicherung und Erkennung der endogenen Staaten von diesen vier PTMs entwickelt. Dieses umfassende PTM-Erkennung-Toolset optimiert den Prozess der Erlangung von kritischen Informationen, ob ein Protein durch eine oder mehrere der diese PTMs geändert wird.

Einleitung

Post-translationalen Modifikationen (PTMs) sind stark regulierten Änderungen an ein Protein, wobei die Änderung hinzugefügt oder entfernt in einer bestimmten Weise. PTMs sind oft dynamische, vorübergehende Änderungen, die wesentlich die Proteinstruktur verändern Interaktionen mit Partner Proteine und räumliche Lokalisation und letztlich ermöglicht das Protein führen Sie unterschiedliche Funktionen^{1,2 , 3 , 4}. PTMs sind so zahlreich, dass sie die Anzahl der einzigartigen Protein Formen (oder Proteoforms) von etwa 30.000 Genprodukte auf über 1 Million Proteoforms^5,6erhöhen. PTMs identifizieren und definieren ihre Wirkung auf ein Zielprotein ist entscheidend zum Verständnis des Proteins physiologischen und pathologischen Funktionen^{7,8,9,10, 11,12,13,14}. Arbeiten Sie an ausgewählte Proteine wie Tubulin, p53 und epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) die regulatorischen Rollen PTMs^15,16,17aufgeklärt haben. Diese Studien entdeckt, dass Regulierung dieser Proteine erfolgt durch mehrere PTMs, und in vielen Fällen diese Änderungen arbeiten gemeinsam, um eine bestimmte Funktion zu fördern. Neue Studien haben gezeigt, dass sowohl negative als auch kooperative PTM Übersprechen kann auftreten, auf mehrere verschiedene Proteine^{18,19,20,21,22, 23,24,25}. Allerdings basieren die PTM-Profile für den Großteil der Proteine aus mehreren Studien, die verschiedene Modelle und einzigartige Bedingungen verwendet haben. Mit einem optimierten System, mehrere PTMs in einem System zu untersuchen wäre sehr vorteilhaft, einen Einblick in mögliche PTM Übersprechen für ein Zielprotein.

Eine Herausforderung mit der Untersuchung der PTMs in einem einzigen System ist, dass bestimmte PTMs untersucht werden unterschiedliche Lyse Puffer verwenden. Beispielsweise kann die Verwendung von Puffern wie RIPA oder NP-40, die üblicherweise für Phosphorylierung oder Ubiquitination Untersuchungen verwendet werden für das Studium eine labile PTM wie kleine Ubiquitin-ähnliche Modifikator (SUMO) lierung²⁶ausreichen. Darüber hinaus nicht Denaturierung Puffer sind unzureichend für Protein-Interaktionen entkoppelt und können zu falsch positiven PTM Identifizierung²⁷führen. Untersuchung PTMs in einem denaturierenden Lyse-Puffer kann bevorzugt, sein, wie es deutlich besser ist zu isolieren Proteine aus allen zellulären Kompartimenten²⁸, die meisten Protein-Interaktionen zu distanzieren und Proteasen, die PTM Staaten, wie z. B. verändern zu hemmen DeSUMOylases ²⁶; Denaturierung Puffer kann jedoch die Integrität der spezifische Affinität Reagenzien wie Ubiquitin bindende Domäne-basierten Tools²⁷beeinträchtigen. Entwicklung eines Denaturierung wie Lyse-Systems um mehrere PTMs eines Proteins in einer Affinität Reagenz-kompatibles System zu untersuchen wäre sehr vorteilhaft für die PTM Übersprechen Untersuchungen.

Obwohl denaturierenden Puffer wichtige Vorteile gegenüber nicht-Denaturierung Puffer für die Untersuchung von PTMs verfügen, sind sie weniger häufig verwendet durch ihre erhebliche Nachteile, wie z. B. Inkompatibilität mit konventionellen Protein-Assays, bedeutende genomischen Desoxyribonukleinsäure (DNA) Kontamination und Unterbrechungen für Immunopräzipitation (IP) Reagenzien²⁹. Diese Nachteile können in längeren Vorbereitungszeit und mögliche Schäden an Zielproteine beim Scheren genomischen DNS führen. Zwei häufig verwendete Methoden zur DNA Scheren gehören Spritze lyse und Beschallung²⁹. Beide Methoden erfordern umfassende Optimierung und haben oft keine genaue Reproduzierbarkeit. Alternative Methoden zum Entfernen von genomischen DNS enthalten den Zusatz von DNasen; Dies kann jedoch zusätzliche Optimierung und Veränderungen in der Zusammensetzung der Puffer erfordern. Schließlich wäre eine einfache und reproduzierbare Methode, genomische DNA-Verunreinigung zu entfernen vorteilhaft, bei der Arbeit mit Denaturierung Lyse Puffer für PTM Untersuchungen.

Das Ziel dieser Technik ist, entwickeln ein System zur Isolierung und zur Untersuchung Ubiquitination (Ub), Tyrosin-Phosphorylierung (pY), Sumoylierung 2/3 (SUMO 2/3) und Acetylierung (Ac) PTMs in einem einzigen System, PTM Übersprechen für ein Zielprotein besser zu untersuchen. Das PTM-Detection-System wurde eingesetzt, um schnell die endogene PTM-Profil von mehreren Zielproteine in einem einzigen System zu untersuchen. Neue Erkenntnisse über mögliche Übersprechen war identifizierten^30,31. Insgesamt, die hier beschriebene Technik verbessert bestehende Methoden zu untersuchen, PTMs und PTM Übersprechen auf drei verschiedene Arten: 1) ein einzigartige denaturierenden Puffer wurde entwickelt, die Proteine aus alle zellulären Kompartimenten, isoliert, während immer noch kompatibel mit PTM Affinität Reagenzien, 2) ein einzigartiges Filtersystem wurde entwickelt, schnell entfernt genomische DNA-Verunreinigung aus denaturierten Lysates mit hoher Reproduzierbarkeit und erfordert keine spezielle Ausrüstung und 3) die robuste Affinität Perlen, Lyse System und hemmenden Reagenzien sind kompatibel; so vereinfacht die Isolation von diesen vier PTMs für ein Zielprotein zu maximieren PTM Bereicherung und effizient prüfen potenzielle Übersprechen.

Protokoll

(1) Probenvorbereitung: Zellkultur

1. Wachsen Sie 4 150 mm Teller A431 Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit fötalen Rinderserum 10 %.
   1. Wachsen Sie die A431 Zellen um 50 % Konfluenz.
   2. Serum beschränken die vier Platten A431 Zellen mit serumfreien DMEM für 24 h.
   3. Zwei Platten von A431 Zellen mit 33,3 mg/mL des epidermal Growth Factor 1 h. lassen Sie die anderen beiden Platten, die unbehandelt zu behandeln.
      Hinweis: Zelle Wachstum und Behandlung Bedingungen gezeigt, hier geben Sie ein Beispiel; Diese Methode ist jedoch für viele verschiedene Zelltypen und Behandlungsbedingungen.
2. Bereiten Sie BlastR lyse und Verdünnung Puffer mit Inhibitoren (Tabelle 1). Kombinieren Sie 2,895 mL BlastR Lyse Puffer mit 15 µL Tyrosin-Phosphatase-Inhibitor, 30 µL des Deubiquitinase und DeSUMOylase-Hemmer, 30 µL Histon-Deacetylase (HDAC)-Inhibitor und 30 µL Protease-Inhibitor cocktail.
   1. Kombinieren Sie 9,65 mL BlastR Verdünnungspuffer mit 50 µL der Tyrosin-Phosphatase-Inhibitor, 100 µL der Deubiquitinase und DeSUMOylase-Hemmer, 100 µL der Histon-Deacetylase (HDAC)-Inhibitor und 100 µL Protease-Inhibitor cocktail.
      Hinweis: Informationen finden Sie unter Tabelle für Werkstoffe Puffer Zusammensetzung und Inhibitor.
3. Gießen Sie die Kultur, Medien und die Zellen auf Eis. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
   1. Entfernen Sie so viel PBS wie möglich vor dem Hinzufügen BlastR Lyse Puffer zur Maximierung der Lyse der Zelle.
      Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für Puffer Zusammensetzung.
4. Fügen Sie 600 µL BlastR Lyse Puffer für jede 150 mm Platte. Die Menge an Puffer basiert auf erwartete Proteinausbeute (Tabelle 2).
   1. Lösen Sie die Zellen mit einem Schaber Zelle. Die lysate werden zähflüssig durch nukleare Lyse.
5. Verwenden Sie eine teilweiser 1 mL Pipettenspitze lysate Rohöl in einer BlastR Filter übertragen, die in einem 15 mL Sammelrohr (Abbildung 1) platziert wurde. Hier wird eine 15 mL Falcon-Röhrchen verwendet.
6. Verwenden Sie einen mitgelieferten Filter-Kolben komplett Komprimieren des BlastR Filters und sammeln der lysate durchströmten, einschließlich eventuell Luftblasen in der 15 mL Tube (Abbildung 1).
7. Optional: Transfer geklärt lysate zu einer 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge lysate bei ca. 10.000 x g für 1 min bei 4 ° C.
   1. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue 15 mL Falcon-Röhrchen.
8. Verdünnen Sie die geklärte lysate mit BlastR Verdünnungspuffer zu einem Endvolumen von 3 mL für jede 150 mm Platte. Das Endvolumen basiert auf erwartete Proteinausbeute (Tabelle 2).
   Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, da die endgültige Puffer Zusammensetzung die IP-Reaktion strenge auswirkt.
9. Quantitate Proteinkonzentration (Abschnitt 2).

2. Protein Quantifizierung Assay

Hinweis: Verwenden Sie einen standard farbmetrischen Protein Quantifizierung Assay ermitteln Protein Quantifizierung. Hier wird Protein Quantifizierung mit Präzision rote erweiterte Protein Assay ermittelt.

1. 1 mL Präzision rote erweiterte Protein Assay Reagenz zu jedem der beiden 1 mL Küvetten hinzugeben.
2. Mischung 10 µL BlastR Lyse Puffer und 40 µL BlastR Verdünnungspuffer in einem sauberen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch auf Eis.
   Hinweis: Hiermit werden für das Lesen der leere Protein-Probe.
3. 20 µL der Lyse/Verdünnung-Puffer-Mix (aus Schritt 2.2) am ersten Küvette und fügen Sie Mischung durch zwei-bis dreimal umdrehen hinzu.
4. 20 µL der verdünnten Zelle lysate (aus Experiment) hinzufügen, die zweite Küvette mischen wie oben beschrieben.
5. Inkubieren Sie Proben 1 min bei Raumtemperatur.
6. Leere Spektralphotometer mit der Lyse/Verdünnung Puffer Mischung Probe (ab Schritt 2.3).
7. Messung der Extinktion der lysate Probe (ab Schritt 2.4) bei 600 nm.
8. Bestimmen Sie die lysate Proteinkonzentration wie folgt;
   Probe lesen OD₆₀₀ X 5 = Proteinkonzentration in mg/mL
   Hinweis: OD-Werte unter 0,05 oder über 0,5 sind in der Nähe der linearen Bereich Kapazität von Protein Assay. Für Lesungen > 0,5, Proben können verdünnt werden. Für Lesungen < 0,05, mehr lysate kann die Präzision rote erweiterte Protein Assay Reagenz (bis zu 50 µL) hinzugefügt werden. Siehe Tabelle 3 für MultiplikatorInnen Spektralphotometer Lesungen in mg/mL lysate Proteinkonzentration zu konvertieren. Wenn nicht genügend Protein in einer Platte vorhanden ist, empfiehlt es sich, mindestens 2 Platten pro IP benutzen. In diesem Fall werden Platten in Serie, Übertragung der ursprünglichen 300 µL Lyse Puffer zwischen den Platten geerntet werden.
9. Anhand der Proteinkonzentration, Probe mit einem Puffer Mix verdünnen (1 Teil BlastR Lyse: 4 Teile BlastR Verdünnung) auf einen gewünschten Endkonzentration (in der Regel 1 mg/mL).
10. Snap freeze Aliquote der Proben, die nicht sofort verwendet werden.
    1. Shop-Proben bei-70 ° C.
    2. Fahren Sie mit Abschnitt 3.

(3) Immunopräzipitation (IP)-Assay

Hinweis: Affinität Wulst Konzentrationen, lysate Konzentrationen, Inkubationszeiten sind empfohlene Richtlinien und einzigartig für jedes Zielprotein und spezifische PTM untersucht werden können.

1. Invert Lager Reagenz Röhrchen mit Ub Affinität Perlen, pY Affinität Perlen, SUMO 2/3 Affinität Perlen und Ac Affinität Perlen mehrmals um sicherzustellen, dass sind die Perlen in das Rohr komplett Nukleinsäuretablette.
2. Für jede IP-Assay, aliquoten Wulst Aussetzung in separate 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis (IP-Rohr). Individuelle 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis hier 20 µL des Ubiquitin-Affinität-Perlen, 30 µL Phosphotyrosine Affinität Perlen, 40 µL Sumoylierung 2/3 Affinität Perlen oder 50 µL der Acetylierung Affinität Perlen hinzufügen.
   Hinweis: Siehe Tabelle 4 für das empfohlene Volumen der Wulst Federung für jede Affinität Perle verwenden.
3. Invert Lager Reagenz Röhrchen mit Ubiquitination IP-Kontrolle Perlen und IgG Kontrolle Perlen mehrmals um sicherzustellen, dass sind die Perlen in das Rohr komplett Nukleinsäuretablette.
4. Aliquoten Kontrolle Perlen pro Kontrollreaktion unspezifischen Bindung (IP Control-Rohr) zu bestimmen. Fügen Sie 20 µL der Ub Control Beads, 30 µL pY Kontrolle Perlen, 40 µL SUMO 2/3 Kontrolle Perlen oder 50 µL Ac Steuerung Perlen hier einzelne 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis hinzu.
   Hinweis: Siehe Tabelle 4 für das empfohlene Volumen der Wulst Federung, für jede Art von Affinität Wulst zu verwenden.
5. Speichern Sie eine kleine Menge von lysate (20 µL) laufen, wie ein western-Blot lysate Steuereingang. Fügen Sie 5 µL 5 X Probenpuffer und bei 95 ° C für 5 min kochen.
   Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für Puffer Zusammensetzung.
6. Fügen Sie lysate zu jeder IP und Steuerung IP-Rohr. Hier wurde 1 mg lysate pro IP und Kontrolle Reaktion, wodurch insgesamt 8 IP-Reaktionen verwendet.
   Hinweis: 1,0 mg pro Assay lysate empfiehlt sich als Ausgangspunkt. Der Betrag von lysate erforderlich wird schwanken abhängig von der Fülle der modifizierten Zielprotein.
7. Inkubieren Sie die Röhren auf eine durchgängige über rotierende Plattform bei 4 ° C 2 h. Hier wurde ein ATR-Rohr-Rotator mit Geschwindigkeit 22 verwendet.
8. Sammeln Sie Perlen durch Zentrifugation bei 3.000-5.000 x g für 1 min bei 4 ° C.
9. Aspirieren Sie aus so viel überstand wie möglich ohne zu stören die Perlen.
10. Waschen Sie Perlen in 1 mL BlastR Waschpuffer (Inhibitoren sind in diesem Stadium nicht notwendig) für 5 min auf einer 4 ° C rotierenden Plattform.
11. Sammeln Sie Perlen durch Zentrifugation bei 3.000-5.000 x g für 1 min bei 4 ° C.
12. Aspirieren Sie aus so viel überstand wie möglich ohne zu stören die Perlen.
13. Wiederholen Sie den Waschschritt zu (Schritte 3.10-3.12) zwei weitere Male.
14. Entfernen Sie nach dem letzten waschen vollständig Puffer überstand. Minimaler Unterbrechung des Pellet-Perle ist akzeptabel (bis zu 5 % Verlust). Entfernen Sie verbleibende Überstand mit einem Bohrung Protein laden Tipp.
15. Fügen Sie 30 µL Wulst Elution Buffer und Aufschwemmen der Perlen von sanft klopfen/flicking die Seite des Rohres. Verwenden Sie eine Pipette nicht in diesem Stadium.
    Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für Puffer Zusammensetzung.
16. In 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
17. Übertragen Sie sanft jede Perle Aussetzung zu einer 1,5 mL Microcentrifuge Spin-Spalte, die in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch gelegt wurde.
    Hinweis: Es wird empfohlen am Ende aus der Transfer-Pipettenspitze für sanftere Transfer schnippeln.
18. Zentrifugieren Sie bei 9.000-10.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur, die IP-Probe zu sammeln.
19. Jede Probe 2 µL 2-Mercaptoethanol hinzufügen und gut verrühren.
    Hinweis: Es ist bequem, den Deckel von der Spin-Spalte ausrichten und verwenden Sie diese Option, um das Sammelröhrchen für die Weiterverarbeitung zu begrenzen.
20. Platzieren Sie Proben im Wasserbad 95 ° C für 5 min. sammeln Probe durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 1 min bei RT
21. Gegebenenfalls speichern Sie Proben bei-70 ° C und halten Sie hier, oder gehen Sie zum Ausführen von SDS-PAGE, Transfer und western-Blot Analyse (Abschnitt 4).

(4) Western-Blot Analyse: Ermittlung des Proteins des Interesses

1. Separate Proben von Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und transfer zum Polyvinylidene Fluorid (PVDF) Membran, nach Standardlabor Protokolle³².
2. Verwenden Sie einen primären Antikörper, um die posttranslational modifizierten Versionen des Proteins des Interesses zu erkennen. Hier wurde PD-L1-Antikörper zur posttranslational modifizierte PD-L1 zu erkennen.
3. Verwenden Sie Gromer Chemilumineszenz-Detektion-Reagenz zum Nachweis.
   Hinweis: Das Chemolumineszenz Reagenz sollte in Verbindung mit einer HRP-markierten Sekundärantikörper Erkennung von den primären Antikörper verwendet werden.
4. Verwenden Sie ein Volumen von 2 mL Chemolumineszenz Reagenz pro mini-gel-sized Transfer-Membran (ca. 8 x 7 cm).
   1. Nach der Inkubation mit entsprechenden Sekundärantikörper (60 min bei RT wird empfohlen), waschen Sie den Fleck 6 x 10 min in 30 mL Tris gepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBST).
      Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für Puffer Zusammensetzung.
   2. Unmittelbar vor der Anwendung mischen Sie 1 mL der Chemilumineszenz Reagenz A mit 1 mL der Chemilumineszenz Reagenz B (ausreichend für ein 8 cm x 7 cm Membran).
   3. Membran Chemolumineszenz Reagenz hinzu und inkubieren Sie mit sanften Schaukeln bei RT für 1 bis 5 min vor der Visualisierung von Protein-Signal mit Röntgenfilm oder – Coupled Ladegerät (CCD) Kamera Bildgebung.
      Hinweis: Kürzere Inkubationszeiten bei der Chemilumineszenz Reagenz können für sehr reichlich Proteine notwendig.

Ergebnisse

Die Fähigkeit dieser Werkzeuge, PTM Übersprechen zu untersuchen, indem er effektiv erkennt diese 4 PTMs ist teilweise abhängig von der einzigartigen Lyse-Puffersystem. Der BlastR denaturierenden Puffer isoliert wirksam Proteine aus allen zellulären Kompartimenten ähnlich wie bei anderen Geruchsstoffen Puffer sorgt für ein komplettes Protein Profil (Abbildung 2A). Darüber hinaus bewahrt es höchst labil PTM Signale wie SUMO 2/3, die schnell in den Puffern nicht Denaturierung, wie Tests Assay (RIPA) (Abb. 2 b) abgenommen wird. Wichtig ist, wenn entsprechend verdünnt, wirkt nicht die Integrität der Affinität Reagenzien wie andere denaturierenden Puffer (z. B. Laemmli-Puffer) es.

Eine erhebliche Hürde bei der Arbeit mit Geruchsstoffen Puffer ist die Fähigkeit, effektiv genomische DNA-Verunreinigung zu entfernen. Die konventionelle Methodik zur Verringerung der Viskosität ist die DNA Scherung durch Verwendung einer Spritzennadel oder beschallen die Probe. Abbildung 3A zeigt genomische DNA-Verunreinigung in A431 Zelle lysate nach Behandlung mit dem BlastR Filter, der Spritzennadel oder Beschallung. Es gibt fast vollständige Entfernung der genomischen DNA mit Hilfe des BlastR Filters, was nicht der Fall ist mit einem herkömmlichen Spritzennadel oder Beschallung. Genomische DNA-Verunreinigung beeinflusst maßgeblich Protein Migration durch ein SDS-Acrylamid-Gel; Behandlung mit dem BlastR Filter entfernt jedoch genomischen DNA, was richtige Protein Migration (Abb. 3 b). Veränderte Migration verursacht durch genomische DNA-Verunreinigung kann Interpretation des western Blots erheblich beeinträchtigen; Beispielsweise kann die verschmierten EGFR-Muster gesehen in die ungefilterte lysate ungenau als erhöhte Ausdruck im Verhältnis zu der gefilterten Probe (Abbildung 3) interpretiert werden.

Durch die Nutzung dieses optimierte PTM Bereicherung und Detection Systems, kann man schnell feststellen, ob ein Zielprotein, von einem geändert wird oder mehr PTMs. Untersuchung des PD-L1 PTM Profils vor kurzem mit dieser Technik durchgeführt und die Ergebnisse zeigten wurde, dass PD-L1 wurde Ubiquitinated, acetyliert, und Tyrosin phosphoryliert als Reaktion auf EGF (Abbildung 4). Wichtig ist, Angaben diese endogener PD-L1 PTM-Veränderungen, die einen kleinen Prozentsatz der gesamten PD-L1 identifiziert vertreten.

Abbildung 1: Filtern von genomischer DNA aus Zelle lysate mit BlastR Filter. (A) Bild der BlastR Filter. (B) Lysate wird in den Filter geladen, die in einer 15 mL Sammelröhrchen gelegt wurde. (C) Kolben befindet sich in der Spritze und lysate ist durch den Filter durch Kompression geleitet. Sammeln Sie (D) lysate, einschließlich eventuell Luftblasen durch vollständige Kompression. (E) gefiltert lysate.

Abbildung 2: Vergleich der BlastR Lyse Puffer auf alternative Lyse Puffer. Abbildung 2A adaptiert von Horita Et al. 2017. Biosci. Rep. ³¹ (A) A431 Zellen wurden mit BlastR, RIPA, mPER, IP-Lyse lysiert (1 % SDS), Denaturierung und Laemmli Lyse Puffer. Alle denaturierenden Lysates hatte genomischen DNA mit BlastR Filter entfernt. Isolierung von Proteinen aus der Membran, zytoplasmatischen, Mitochondrien, und nukleare Markierungen wurden durch Antikörper gegen den jeweiligen Fach-Marker-Proteine bestimmt. (B) mit BlastR, RIPA und 1 % SDS denaturierenden Puffer wurden A431 Zellen lysiert. Lysates waren Immunoprecipitated mit SUMO-2/3 oder Kontrolle IgG-Affinität-Perlen. Proben wurden durch SDS-PAGE getrennt und analysiert von western-Blot mit einem SUMO-2/3-Meerrettich-Peroxidase (HRP) Antikörper. Vertreter blots aus N≥3 unabhängige Experimenten gezeigt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: BlastR Lyse Filter ist effektiv bei der Beseitigung von genomischen DNS. (A) mit einem denaturierenden Lyse-Puffer wurden A431 Zellen lysiert. Genomischer DNA wurde entfernt oder geschert mit BlastR Filter, Spritzennadel oder Beschallung für 5, 10, 20 oder 30 Sekunden. 2 % von der lysate wurde von Interkalation Bromid, Agarose-Gelelektrophorese analysiert. (B) Lysate aus A431 Zellen lysiert mit einem denaturierenden Puffer war entweder ungefiltert oder mit dem BlastR Filter filtern. Proben wurden mit SDS-PAGE getrennt und mit Coomassie Fleck visualisiert. (C) Duplikat Proben von B wurden getrennt von SDS-PAGE, PVDF, übertragen und EGFR-Protein wurde mit einem EGFR Antikörper untersucht. Repräsentative Flecken aus N ≥3 unabhängigen Experimenten werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Nachweis von EGF-induzierte post-translationalen Modifikationen für PD-L1. Abbildung von Horita Et Al. angepasst 2017. Neoplasie³⁰(A). Serum-restricted A431 Zellen waren entweder unstimulierte (UT) oder eine Stunde vor Lyse mit BlastR Lyse Puffer mit EGF stimuliert. WCL wurde für PD-L1-Ebenen (Bahnen 1, 2) analysiert. Ubiquitin Bindung Perlen (UBA01) dienten zur IP-Ubiquitinated Proteine (Bahnen 3,4). Phosphotyrosine Bindung Perlen (APY03) wurden an IP-Tyrosin phosphoryliert Proteine (Bahnen 5,6) verwendet. SUMO 2/3 Bindung Perlen (ASM24) dienten zur IP-sumoyliert 2/3 Proteine (Bahnen 7,8). Acetyl-Lysin Bindung Perlen (AAC01) wurden an IP-acetyliert Proteine (Bahnen 9,10) verwendet. IgG verbindliche Kontrolle Perlen wurden verwendet, um IP-unspezifische Bindeproteine (Bahnen 11,12). Proben wurden durch SDS-PAGE getrennt und analysiert von western-Blot mit einem PD-L1-Antikörper. Ein repräsentative Fleck aus N ≥3 unabhängigen Experimenten wird angezeigt. Weiße Sternchen wurden verwendet, um PD-L1 pY und Ac Protein Bands hervorzuheben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Berechnungen für BlastR Lyse Puffer
	1,0 mL	2,0 mL	5,0 mL	10,0 mL
BlastR Lysis Puffer	965 ΜL	1930 ΜL	4,825 mL	9,650 mL
Tyrosin Phosphatase Inhibitor	5 ΜL	10 ΜL	25 ΜL	50 ΜL
de-Ubiquitinase/de-Sumoylase-Hemmer	10 ΜL	20 ΜL	50 ΜL	100 ΜL
HDAC-inhibitor	10 ΜL	20 ΜL	50 ΜL	100 ΜL
Protease-Hemmer cocktail	10 ΜL	20 ΜL	50 ΜL	100 ΜL
Berechnungen für BlastR Verdünnungspuffer
	4,0 mL	8,0 mL	20,0 mL	40,0 mL
BlastR Lysis Puffer	3,86 mL	7,72 mL	19,3 mL	38,6 mL
Tyrosin Phosphatase Inhibitor	20 ΜL	40 ΜL	100 ΜL	200 ΜL
de-Ubiquitinase/de-Sumoylase-Hemmer	40 ΜL	80 ΜL	200 ΜL	400 ΜL
HDAC-inhibitor	40 ΜL	80 ΜL	200 ΜL	400 ΜL
Protease-Hemmer cocktail	40 ΜL	80 ΜL	200 ΜL	400 ΜL

Tabelle 1: Lyse und Verdünnung Puffer Vorbereitung Diagramm. Diagramm mit Konzentrationen von Inhibitoren, fügen Sie für einen bestimmten lyse und Verdünnung Puffervolumen bei der Vorbereitung für die Zelle Lysis Puffer.

Platte-Protein-Inhalt	Empfohlene BlastR Lyse Puffervolumen	Empfohlene BlastR Verdünnung Puffervolumen
< 1 mg	Protein aus mehreren Platten zu kombinieren	1,5 mL Endvolumen zu machen
1-2 mg	300 ΜL	1,5 mL Endvolumen zu machen
2-4 mg	600 ΜL	3 mL Endvolumen zu machen
4-6 mg	900 ΜL	4,5 mL Endvolumen zu machen

Tabelle 2: BlastR Lyse/Verdünnung Puffer Diagramm. Lyse und Verdünnung-Puffer-Volumen empfohlen Diagramm bietet beim lysate Beschaffung.

Volumen der Zelle lysate, 1 ml der Präzision rot Protein Assay Reagenz (µL) hinzugefügt	Multiplikator, mit Probe lesen OD600 verwenden
10	10
20	5
30	3.3
40	2.5
50	2

Tabelle 3: Multiplikatoren Spektralphotometer Lesungen in mg/mL konvertieren Lysate. Diagramm die Konvertierung Zahlen zum Adjutanten mit Berechnung der Proteinkonzentration.

Affinität Perlen	Volumen der Wulst Gülle/IP (mL)
Ubiquitination	20
Phosphotyrosine	30
Sumoylierung 2/3	40
Acetylierung	50
Kontrolle-Perlen	Volumen der Wulst Gülle/IP (mL)
Ubiquitination Kontrolle Perlen	20
Phosphotyrsoine Kontrolle Perlen	30
Sumoylierung 2/3 Kontrolle Perlen	40
Acetylierung Kontrolle Perlen	50

Tabelle 4: Volumen von Korne/IP-Diagramm empfohlen. Diagramm mit empfohlenen Mengen von Affinität Perlen, pro IP-Reaktion zu verwenden.

Diskussion

Erste Ansätze verwendet, um festzustellen, ob ein Zielprotein durch eine PTM geändert wird mit dem Ziel Protein spezifischer Antikörper für IP, gefolgt von western-Blot mit einem PTM-Antikörper durchgeführt werden können (zB., Anti-Acetyl Lysin), oder mit Hilfe eines Antikörpers PTM für IP, gefolgt von western-Blot mit Ziel Protein spezifischer Antikörper,^30,31,33. Während beide Ansätze theoretisch arbeiten, hat unter Verwendung eines Ziel-Protein-spezifischen Antikörpers mehr potenzielle Fallstricke, wie der Antikörper kann nicht IP kompatibel, oder große PTM Änderungen die Antikörper Anerkennung Website auf das Zielprotein^{34 blockiert ,35}. Der Vorteil der PTM Affinität Perlen ist, dass die Antikörper oder bindende Domänen speziell PTM Interesse erkennen; so sollten Änderungen an das Zielprotein Anerkennung durch die Affinität Perlen nicht verändern. Als Beispiel PD-L1 Ub wurde mit der hier beschriebenen Technik identifiziert, und beide endogenen Mono und Poly-Ub wurde beobachtet (Abbildung 4). Einer kürzlich erschienenen Publikation von Lim Et Al. verwendet in-vitro- Ub-Techniken um PD-L1 Ub zu untersuchen, und das Ergebnis war sehr ähnlich wie die Ergebnisse in Abbildung 4-³⁶. Interessanterweise traten sie auch IP mit einem PD-L1-Antikörper, PD-L1 aus Zelle lysate, zu bereichern, wo Ub war überexprimiert und MG-132 wurde hinzugefügt, um das Signal zu verbessern. Das Ub-Muster war nicht robust und sehr verschieden von der in-vitro- Ub-Muster. Untersuchung der endogenen PD-L1-Ub in Zellmodellen Kultur war nicht in der Lim Et al.durchgeführt. Bericht an den Unterschied zwischen Kultur und in-vitro- Daten ihrer Zelle zu klären.

Kann schwierig sein, aufgrund seiner geringen Fülle und Vergänglichkeit^37,38, und erfordert oft Bereicherung durch IP untersucht, ob ein Protein durch eine PTM geändert wird. Effiziente IP-PTMs erfordert Optimierung mehrerer Schlüsseletappen und Reagenzien, wie Lyse Puffer und Affinität Reagenzien. Bei der Untersuchung von mehreren PTMs ein Zielprotein erhöht die erforderliche Optimierung geeignet. Nutzung der BlastR Lyse-System ist ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll, da es robusten IP-Fähigkeit beibehält, gleichzeitig PTM Erkennung von pY, SUMO 2/3, Ub und Ac PTMs in einem einzigen System. Diese Technik optimiert die Zeit- und Ressourcenaufwand zu bestimmen, ob ein bestimmtes Ziel-Protein durch diese vier PTMs modifiziert wird und potenziell bietet ein besseres Bild von PTM Übersprechen relativ zum Vergleich der PTM Ergebnisse mit mehreren Lyse-Systemen durchgeführt. Untersuchung der BlastR Lyse System Kompatibilität mit alternativen PTMs wie Glykosylierung, wurde durchgeführt; jedoch wurde es nicht erschöpfend für alle Arten von PTMs untersucht.

Reichlicher genomischer DNA kann behinderen Protein-Messungen mit Hilfe einer kolorimetrischen oder Nanodrop Methoden, beeinträchtigen die Migration der Proteine in einem SDS-Acrylamid-Gel, und verhindern, dass Protein und Affinität Matrix Interaktionen während IP-Assays. Die hier beschriebene Methode nutzt einen speziellen Filter, um effektiv genomische DNA-Verunreinigung zu entfernen, die ein weiterer wichtiger Schritt dieses Protokolls ist. Um diesen Punkt zu markieren, Viskosität Tests wurden vor und nach der BlastR Filter Behandlung durchgeführt und die Ergebnisse zeigten eine Reduktion von einer hohen Viskosität auf die Viskosität des Wassers (Daten nicht gezeigt). Diese Änderung der Viskosität wurde unterstützt durch die Ergebnisse in Abbildung 3zeigt, dass fast alle die genomische DNA entfernt worden war. Wichtig ist, ist DNA mit dieser Methode nicht geschoren, da keine geschert DNA wird nicht durch den Filter (Daten nicht gezeigt) erfasst werden. Dieses Tool ist besser als herkömmliche Methoden wie Ultraschall oder Spritze-DNA-Scheren, weil es keine spezielle Ausrüstung erfordert, sehr reproduzierbar ist und die DNA statt Scheren es entfernt. Darüber hinaus wird es nicht Protein in der lysate, degradieren, die auftreten können mit konventionellen Methoden²⁹. Unter Verwendung des Filters nimmt 5-30 Sekunden pro Probe im Vergleich zu alternativen Methoden wo effektiven Abbau von DNA dauert einige Minuten (d.h.Spritze Scheren) und kann Probe Heterogenität als DNA-Kontaminationen in der lysate bleiben. Umfangreiche Analyse der lysate Pre- und Post-BlastR Filterung durchgeführt wurde, und keine beobachtbaren Unterschied in der Protein-Profil wurde beobachtet, von Coomassie, gezielt westliche, oder total und gezielt PTM-Analysen; somit die Integrität des Protein-Profils möglicherweise nicht betroffen sind durch das Herausfiltern der genomischen DNS. Letztlich ist dieses Filtersystem vorteilhaft für alle westlichen oder IP-Anwendungen wo genomischer DNA vorliegt und die Interpretation der Protein-Analyse beeinträchtigen.

Es ist wichtig zu beachten, dass es gibt Potenzial für negative Fehldetektionen nutzt diese Technik, die zum Teil auf Affinität Perlen Sättigung, verbindliche Website Störungen oder PTM Maskierung werden kann. Zum Beispiel kann ein bestimmtes Zielprotein von Ac auf sehr niedrigem Niveau geändert werden; so kann es nicht durch Pan-Acetyl Lysin Affinität Perlen isoliert werden, die durch reichlicher Ac-modifizierten Zielproteine gesättigt wurde. Laufende Studien werden durchgeführt um die Nachweisgrenzen der Affinität Reagenzien verwendet in diesem Protokoll zu beurteilen, aber eine kürzlich erschienenen Publikation weist eine sehr robuste Nachweisgrenze. Die Daten zeigten, dass diese Technik identifizieren konnte so wenig wie 17 Schimmelpilzschäden Ziel-Protein-Moleküle pro Zelle³¹. Noch, bestimmte Umstände wie Zelle geben Spezifität, transiente PTMs in Reaktion auf bestimmte Reize oder Maskierung von PTMs durch Protein-Interaktion kann falsch-negative Ergebnisse zur Folge. Diese sind potenzielle Fallstricke dieser Technik, als auch die meisten PTM IP-Methoden. Daher empfiehlt es sich, die Ergebnisse mit mehreren Ansätzen zu bestätigen.

Modifikationen wie Glykosylierung und Phosphorylierung haben gezeigt, dass konkurrieren um ähnliche Aminosäuren^39,40und andere PTMs wie Ubiquitination und Phosphorylierung nachweislich sequentiell arbeiten, um ein Protein zu regulieren ^17,41funktionieren. Neuere Arbeiten auf dem neuropathologische Protein Tau unterstrich die Bedeutung der PTM Crosstalk, wo Tau hyper-Phosphorylierung und Tau Sumoylierung einander⁴²erweitert. Darüber hinaus zeigte diese Gruppe, dass Sumoylierung Tau Poly-Ub und späteren Tau Abbau verhindert Aggregation führen. Dies ist nur eines von vielen Beispielen der regulatorischen PTM Übersprechen und der Nutzen von dieser Technik wird dazu beitragen, um die Bedeutung der PTMs und ihre Übersprechen bei der Regulierung der wichtigsten Proteine in Gesundheit und Krankheit zu beleuchten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zelllyse/genomische DNA-Entfernung und -Analyse
1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)gemeinsamer	Puffer		Rezept: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4
BlastR-Lysepuffer	Cytoskeleton Inc.	BLST01	Proprietäre Mischung aus Detergenzien, Salzen und anderen Pufferzusätzen
Radioimmunpräzipitationsassay-Puffer (RIPA)	gemeinsamer Puffer		Rezept: Tris-HCl, NaCl, SDS, Natriumdesoxycholat, Igepal
Reagenz zur Extraktion von Säugetierproteinen (mPER)	Thermofisher	78503	Proprietäre Mischung aus Detergenzien, Salzen und anderen Pufferzusätzen
Immunpräzipitation (IP) Lysis	Pierce	87787	Proprietäre Mischung aus Detergenzien, Salzen und anderen Pufferzusätzen
1% Natriumdodecylsulfat (SDS) Denaturierungspuffer	gemeinsamer Puffer		Rezept: PBS, SDS, EDTA, EGTA
Laemmli	gemeinsamer Puffer		Rezept: Tris-HCl, SDS, Glycerin, Bromphenolblau
BlastR-Verdünnungspuffer	Cytoskeleton Inc.	BDB01	Proprietäre Mischung aus Detergenzien, Salzen und anderen Pufferadditiven
Proteaseinhibitor Cocktail	Cytoskeleton Inc.	PIC02
N-Ethylmaleimid (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylendiamin (TPEN)	Cytoskeleton Inc.
Trichostatin A (TSA) & Nicotinamid-Zytoskelett	Inc.	TSA01
Aktiviertes Natriumorthovanadat (Na3VO4)	Cytoskeleton Inc.	PYI01
Zellschaber	Costar	3008
BlastR Filter	Zytoskelett Inc.	BLR02
BD Insulinspritzennadel	BD	08290-3284-11
Ultraschallgerät (Branson Sonifier)	Branson	Sonifier 450
Precision Red Advanced Protein Reagenz	Cytoskeleton Inc.	ADV02
1-ml-Küvetten	Fisher
(Genesys20)	Thermofisher	4001	Andere Spektralphotomere können zur Messung der Proteinkonzentration verwendet werden
Agarose	Fisher	BP1356-500
1kb Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Leiter	NEB	N3232L
DNA-Gelbox	Thermofisher	7312 B1A
Tris/Borat/EDTA (TBE) Puffer	gemeinsamer Puffer		Rezept: Tris-HCl, Borsäure, EDTA
strong>PTM Immunpräzipitation
Phosphotyrosin-Kügelchen	Zytoskelett Inc.	APY03-Kügelchen
Ubiquitinierungskügelchen	Cytoskeleton Inc.	UBA01-Kügelchen
SUMOylierung 2/3 Kügelchen	Cytoskeleton Inc.	ASM24-Kügelchen
Acetylierungskügelchen	Cytoskeleton Inc.	AAC04-Kügelchen
Phosphotyrosin-Kontrollkügelchen	Cytoskeleton Inc.	CIG01-Kügelchen
Ubiquitinierungskontrollkügelchen	Cytoskeleton Inc.	CUB02-Kügelchen
SUMOylierung 2/3 Kontrollkügelchen	Cytoskeleton Inc.	CIG01-beads
Acetylierungskontrollbeads	Cytoskeleton Inc.	CIG02-beads
BlastR Waschpuffer	Cytoskeleton Inc.	BWB02	Proprietäre Mischung aus Detergenzien, Salzen und anderen Pufferadditiven
Bead-Elutionspuffer	Cytoskeleton Inc.	BEB01	Proprietäre Mischung aus Reinigungsmitteln, Salzen und anderen Pufferzusätzen
Mikrozentrifuge	Eppendorf	5417	Andere Mikrozentrifugen können verwendet werden
Rohrrotator	ATR	RKVSD	Es können auch andere End-over-End-Rohrrotatoren verwendet werden
Tipps zur Proteinbeladung	VWR	37001-150
Spin-Säulen	Cytoskeleton Inc.	SPN22
Heizblock 95 > C	Benchmark	BSH1002
SDS-PAGE/Transfer/Western analysis
5x Probenpuffer	Common Buffer		Rezept: Bromophenolblau, Dithiothreitol (DTT), Glycerin, SDS, Tris-HCl
Novex Wedge Well 4-20% Tris-Gly Gele	Invitrogen	XP04200BOX	Die großen Wedgewells eignen sich hervorragend zum Laden großer Volumina
1x Laufpuffer	gemeinsames		Pufferrezept: Tris-HCl, Glycin, SDS
seeblue Proteinleiter	Life Technologies	LC5625
Elektrophoresezelle	Invitrogen	Xcell Surelock Elektrophoresezelle	Andere Elektrophoresezellen können verwendet werden, diese sind jedoch kompatibel mit den Novex Wedgewell-Gelen
Netzteil	Biorad	PowerPac HC	Es können auch andere Netzteile verwendet werden
1x Transferpuffer	gemeinsames		Pufferrezept: Tris-HCl, Glycin, Methanol
Transferzelle	Biorad	Mini-Transblot-Zelle	Andere Transferzellen können verwendet werden
Immobilon-P-Membranen (PVDF)	Millipore	IPVH 304F0
fettfreie Milch	gedeiht	813503015095
Tris gepufferte Kochsalzlösung mit Tween (TBST)	gängiges Pufferrezept		: Tris-HCl, NaCl, Tween 20
Chemilumineszenz-Detektionsreagenz	Zytoskelett Inc.	CLRA/CLRB
Zellwachstum und BehandlungDulbecco's
Modified Eagle's Medium	ATCC	30-2002
Fötales Rinderserum	ATLAS	F-0500-A
Epidermaler Wachstumsfaktor	Cytoskeleton Inc.	CN02-A
150 mm Zellkulturplatten	Corning	430599