Methodenartikel

Handy-Aggregation-Assays, die Bindung der Drosophila Kerbe mit Transzu bewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden

DOI:

10.3791/56919

⸱

2. Januar 2018

 , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Komplexität von in-Vivo -Systemen erschwert die Unterscheidung zwischen Aktivierung und Hemmung des Notch-Rezeptors durch Trans- und Cis-Liganden, beziehungsweise. Hier präsentieren wir ein Protokoll basiert auf in-vitro- Zelle-Aggregation-Assays für die semi-quantitative und qualitative Bewertung der Bindung von Drosophila -Kerbe zu Trans-Liganden Vs GUS-Liganden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kerbe-Signalisierung ist ein evolutionär konservierte Zell-Zell-Kommunikations-System im großen und ganzen in Tierentwicklung und Erwachsenen Wartung verwendet. Interaktion des Notch-Rezeptors mit Liganden von benachbarten Zellen induziert Aktivierung der Signalweg (Trans-Aktivierung), während der Interaktion mit Liganden aus der gleichen Zelle Signalisierung hemmt (Cis-Hemmung). Richtige Balance zwischen Trans-Aktivierung und Cis-Hemmung hilft optimale Notch signaling in einigen Kontexten während Tierentwicklung festzusetzen. Aufgrund der überlappenden Ausdruck Domänen der Kerbe und seine Liganden in vielen Zelltypen und die Existenz der Feedback-Mechanismen, studieren die Auswirkungen einer bestimmten Post-translationale Modifikation auf Trans- im Vergleich zu Cis-Interaktionen der Kerbe und die Liganden in Vivo ist schwierig. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verwendung von Drosophila S2 Zellen in Zelle Aggregation Tests zur Beurteilung der Auswirkungen der eine Kerbe Weg Modifikator auf die Bindung von Kerbe an jeder Ligand in Trans und in GUSumzuwerfen. S2-Zellen stabil oder vorübergehend mit einer Kerbe exprimierenden Vektor transfiziert werden mit Zellen, die mit dem Ausdruck jeder Notch-Liganden (S2-Delta oder S2 gesägt) gemischt. Trans-Bindung zwischen Rezeptor und Liganden führt zur Bildung der heterotypen Zelle Aggregate und ist gemessen an der Anzahl der Aggregate pro mL bestehend aus > 6 Zellen. Zu prüfen, die hemmende Wirkung von Cis-Liganden, S2-Zellen Co Ausdruck Kerbe und jede Liganden sind gemischt mit S2-Delta oder S2 gesägt Zellen und die Anzahl der Aggregate wird quantifiziert, wie oben beschrieben. Der relative Rückgang in der Anzahl der Aggregate durch die Anwesenheit von Cis-Liganden liefert ein Maß für GUS-Liganden-vermittelte Hemmung der Trans-Bindung. Diese einfache Assays können semi-quantitative Angaben über die Auswirkungen der genetischen oder pharmakologische Manipulationen auf die Bindung der Kerbe an seinen Liganden und können helfen, die molekularen Mechanismen der in Vivo -Effekte der Entschlüsselung solche Manipulationen auf Kerbe zu signalisieren.

Einleitung

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Kanonische Kerbe Signalisierung ist ein Nahbereichskommunikation von Zelle zu Zelle-Mechanismus, der Körperkontakt der benachbarten Zellen, um die Interaktion zwischen Notch Rezeptoren und ihre Liganden1erfordert. Interaktion des Notch-Rezeptors (vorhanden auf der Oberfläche der Signal-Empfang Zellen) mit Liganden (auf der Oberfläche des Signal senden Zellen) initiiert, Kerbe Signalisierung und ist bekannt als Trans-Aktivierung2. Auf der anderen Seite Interaktion zwischen Kerbe und seine Liganden in derselben Zelle führt zur Hemmung der Notch-Signalweg und ist bekannt als Cis-Hemmung3. Die Balance zwischen Trans- und Cis-Interaktionen ist erforderlich, um optimale Liganden-abhängige Kerbe4Signalisierung zu gewährleisten. Drosophila ist ein Notch-Rezeptor und zwei Liganden (Delta und Serrate) im Gegensatz zu Säugetieren, die vier Notch Rezeptoren und fünf Liganden haben [gezackt 1 (JAG1), JAG2, Delta-Like 1 (DLL1), DLL3 und DLL4]5. Diese Einfachheit bietet, der Drosophila -Modell die Leichtigkeit zu sezieren/Studie die Auswirkungen der Weg-Modifikatoren auf Notch-Liganden Interaktionen und anschließend auf Kerbe Signalisierung. In bestimmten Kontexten während der tierischen Entwicklung (einschließlich Flügel Entwicklung in Drosophila), Cis- und Trans-Interaktionen zu erreichen, richtige Kerbe Signalisierung und Schicksal1,6 Zelle beteiligt sind . Es ist wichtig zu unterscheiden, die Beeinflussung der Kerbe Weg Modifikatoren in diesen Kontexten Cis- und Trans-Interaktionen der Kerbe mit seinen Liganden.

Unsere Fraktion berichtete zuvor, dass Zusatz von ein Kohlenhydrat-Rückstand genannt Xylose, Drosophila Kerbe negativ Notch signaling in bestimmten Kontexten reguliert, einschließlich Flügel Entwicklung7. Verlust der Shams (das Enzym, dass Xylosylates Kerbe) führt zu einem "Verlust der Flügel Vene" Phänotyp7. In jüngerer Zeit, dienten die gen Dosierung Experimente und klonale Analyse zeigen, dass Verlust der Shams Delta-vermittelten Kerbe Vereinzelung verbessert. Zu unterscheiden, ob die verbesserte Kerbe Signalisierung in Shams Mutanten eine Folge der verminderten Cis ist-Hemmung oder erhöhten Trans-Aktivierung, ektopische Überexpression Studien von Notch-Liganden in Larven Flügel imaginalen Scheiben mit dem Dpp-GAL4 -Treiber wurden durchgeführt. Diese Experimente zur Verfügung gestellt, Anhaltspunkte dafür, dass Shams regelt Trans-Aktivierung des Notch von Delta ohne Kerbe Cis-Hemmung durch Liganden8. Jedoch Feed-Back-Regeln und Auswirkungen der endogenen Liganden möglicherweise erschweren die Interpretation von ektopische Überexpression Studien1,6,9.

Beheben Sie dieses Problem, Drosophila S2 Zellen10 wurden verwendet, die einen einfachen in Vitro -System für Notch-Liganden Interaktion Studien11,12vorsehen. S2-Zellen nicht endogene Notch-Rezeptor und Delta Ligand11 ausdrücken und Ausdrücken ein niedriges Niveau der gesägt13, der Notch-Liganden Aggregation Experimente8nicht beeinflusst. Daher können S2 Zellen stabil oder vorübergehend transfiziert werden durch Kerbe und/oder einzelne Liganden (Delta oder Serrate), um Zellen zu generieren, die ausschließlich den Notch-Rezeptor oder eines ihrer Liganden ausdrücken oder eine Kombination davon. Mischen von S2 Kerbe exprimierenden Zellen mit Liganden exprimierenden S2 Zellen führt zur Bildung von heterotypen Aggregate vermittelt durch Rezeptor-Ligand verbindliche11,12,14. Quantifizierung der Aggregatbildung liefert ein Maß für Trans-Bindung zwischen Kerbe und seine Liganden15 (Abbildung 1). In ähnlicher Weise können S2 Zellen Co transfected mit Notch und Delta oder Serrate Liganden werden (d.h. Cis-Liganden). CIS-Liganden in diese Kerbe exprimierenden S2-Zellen aufheben die Bindung der Kerbe mit Trans-Liganden und führt zu verringerte Aggregatbildung8,12,14. Der relative Rückgang der Aggregatbildung verursacht durch GUS-Liganden liefert ein Maß für die hemmende Wirkung von Cis-Liganden auf die Bindung zwischen Kerbe und Trans-Liganden (Abbildung 2). Dementsprechend Zelle Aggregation Assays wurden genutzt, um untersuchen die Auswirkungen des Verlustes von Xylosylation auf Trans- und Cis-Wechselwirkungen zwischen Kerbe und seine Liganden.

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für Zelle Aggregation Assays zielte darauf ab, die Bindung der Kerbe mit Transbewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden mit Drosophila S2 Zellen. Als Beispiel, wir liefern die Daten, die uns erlaubt, die Wirkung der Kerbe Xylosylation auf Bindung zwischen Kerbe und Transbestimmen-Delta8. Diese einfachen Tests eine semi-quantitative Beurteilung der Notch-Liganden Interaktionen in-vitro- und helfen, die molekularen Mechanismen der in Vivo -Effekte der Notch-Signalweg-Modifikatoren zu bestimmen.

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Protokoll

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1. Vorbereitung von Double-Stranded RNA (DsRNA) für Shams Knockdown

  1. PCR-Amplifikation der Produkte
    1. Verwenden Sie genomischer DNA Wildtyp gelb weiß (w y) und pAc5.1-EGFP als Vorlage und die folgende Primer-Paaren, um die DNA-Fragmente in DsRNA Synthese verwendet zu verstärken. Verwenden Sie die folgenden PCR Temperaturprofil: Denaturierung (95 ° C, 30 s), Glühen (58 ° C, 30 s) und Verlängerung (72 ° C, 1 min).
      Grünes fluoreszierendes Protein verbessert (EGFP) DsRNA Primer (5' - 3')-
      Forward Primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      Reverse Primer-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTTGCTCAGGGCGG
      Shams DsRNA Primer (5' - 3')-
      Forward Primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATGCTGTATGTGGACACGGAT
      Reverse Primer-TTAATACGACTCACTATAGGGGAGATCCGTGGATAACCTTAACGA
      Hinweis: EGFP DsRNA dient als Negativkontrolle.
  2. Gel-Reinigen der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Produkte mit einem kommerziellen Gel Reinigung-Kit nach Herstellerangaben Protokoll.
  3. Durchführen Sie in Vitro Transkription mit einem kommerziellen Produkt in der Lage, der Transkription von T7 Promoter laut Protokoll des Herstellers.
  4. Reinigen der DsRNA eine RNA-Reinigung-Kit nach Herstellerangaben Protokoll verwenden und speichern bei-80 ° C.
  5. Beurteilen Sie die Effizienz der Shams Zuschlag mithilfe der folgenden Schritte (1.5.1-1.5.5).
    1. Die Anzahl der Zellen manuell mit Hilfe eines Hemocytometer und Platte 5 x 105 S2-Zellen in jede Vertiefung eines 6 gut Platte in 1 mL/auch von Schneiders Medium mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS) und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin ergänzt.
    2. Jedes gut 7,5 µg EGFP- oder Shams DsRNA hinzu und inkubieren Sie bei 25 ° C für 24 h.
    3. Ernte der Kontrolle (EGFP DsRNA behandelt) und Shams S2 DsRNA-behandelten Zellen durch sanfte Pipettieren gefolgt von Pelletierung durch Zentrifugation bei 1.000 x g für 5 min bei 25 ° C und Verfahren zur RNA-Isolierung mit einer RNA Extraktion Kit nach unten Protokoll des Herstellers.
    4. Quantifizieren die RNA mit einem Spektrophotometer und Prozess 100 ng RNA für die 1-Schritt qRT-PCR mit kommerziellen qPCR Reagenzien und Primer/Sonden und die folgenden PCR Temperaturprofil: Denaturierung (95 ° C, 15 s) und Ausglühen/Verlängerung (60 ° C, 1 min).
      Hinweis: Finden Sie die Tabelle der Materialien für Informationen auf den Primer/Sonden-Sets und das Instrument für Shams und Kontrolle qRT-PCR-Experimente in diesen Studien verwendet.
    5. Berechnen Sie die relative Shams -mRNA-Niveaus mit 2–ΔΔCT Methode16.

2. Bewertung der Bindung zwischen den Notch-Rezeptor und Trans-Liganden

  1. Bereiten Sie Signal-Empfang Zellen (S2 mit dem Ausdruck des Notch-Rezeptors vor).
    1. Zählen der Zellen manuell über eine Hemocytometer und Platte 5 x 105 S2 und stabile S2-Notch Zellen in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte in 1 mL/gut des Schneiders Medium mit 10 % FBS und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin ergänzt.
      Hinweis: Für S2-Notch-Zellen, die von Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) verfügbar sind, fügen Sie 200 nM Methotrexat in Medien. Zur Vorbereitung einer 0,5 mM Methotrexat Vorratslösung bereiten Sie zuerst eine 20 mM Methotrexat in 250 µL 1 M NaOH Lösung. Als nächstes verdünnen Sie diese Lösung, um 0,5 mM in 1 M Phosphat-Puffer Kochsalzlösung und Store bei-20 ° C. In S2-Notch Zellen ist Ausdruck des Notch Proteins unter der Kontrolle von Drosophila Metallothionein Promoter in der pMT -Vektor.
    2. Jedes gut 7,5 µg DsRNA hinzu und inkubieren Sie bei 25 ° C für 24 h.
    3. Fügen Sie 0,7 mM CuSO4 zu induzieren die Expression von Notch und 3 Tage bei 25 ° C inkubieren.
      Hinweis: CuSO4 wird verwendet, um die Expression von Proteinen gesteuert durch den Projektträger Metallothionein induzieren.
  2. Bereiten Sie signalisieren Zellen (S2-Zelle mit dem Ausdruck Delta oder Serrate Liganden).
    1. Zählen der Zellen manuell mit Hilfe eines Hemocytometer und Platte ~ 5 x 106 stabile S2-Delta oder S2 gesägtTom Zellen in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte in 1 mL/Brunnen des Schneiders Medium mit 10 % FBS und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin ergänzt.
      Hinweis: Fügen Sie 200 nM Methotrexat für S2-Delta-Zellen und 100 µg/mL Hygromycin für S2 gesägtTom Zellen in den Medien. Ausdruck von Delta und gesägtTom– eine Tomate-Tags, funktionale Version des gesägt12— unter Drosophila Metallothionein Projektträger in der pMT -Vektor ist.
    2. Fügen Sie 0,7 mM CuSO4 zu induzieren die Expression von Liganden und inkubieren Sie bei 25 ° C für 3 h.
  3. Führen Sie Aggregation zwischen Signal aussendet und Signal-Empfang Zellen.
    1. Ernte der DsRNA behandelt S2 (Kontrolle) und S2-Notch Zellen durch sanfte pipettieren und Platte 2,5 x 105 Zellen/Brunnen in einer 24-Well-Platte nach manuellen Auszählung durch Hemocytometer.
    2. 5 x 105 stabile S2-Delta oder S2 gesägtTom Zellen in einem Gesamtvolumen von 200 µL des Schneiders Medium hinzufügen (ergänzt mit 10 % FBS und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin).
      Hinweis: Alle S2-Zellen, die Handhabung (einschließlich Plattieren, Induktion und DsRNA Behandlung) erfolgte unter eine biologische Kabinett.
    3. Legen Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler bei 150 u/min (942,48 rad/min).
    4. Mischen Sie nach 1 min den Inhalt jedes gut und herausnehmen Sie 20 µL, zum zählen der Anzahl der Aggregate.
      1. Gleichzeitig nehmen Sie ein repräsentatives Bild unter umgekehrten Verbindung Mikroskop mit 10 X Vergrößerung (PLL 10/0,25 Ziel).
      2. Manuell zählen die Aggregate (> 6 Zellen) mit einer Hemocytometer.
    5. Legen Sie die Platte auf einem Boston-Shaker.
    6. Wiederholen Sie die Bildaufnahme und zählen nach 5 min und 15 min der Aggregation.
  4. Durchführen der Quantifizierung der Trans-Bindung.
    1. Berechnen Sie die Anzahl der Aggregate pro mL zwischen S2 und S2-Delta oder S2 gesägtTom Zellen als Hintergrund-Steuerelement.
    2. Berechnen Sie die Anzahl der Aggregate pro mL zwischen S2-Kerbe und S2-Delta oder S2 gesägtTom Zellen (Größe der Trans-Bindung).

3.Bewertung der Hemmung der Bindung zwischen Kerbe und Trans-Liganden von Cis-Liganden

  1. Signal-Empfang Zellen vorbereiten.
    1. Platte 5 x 105 S2 Zellen in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte in 1 mL/gut des Schneiders Medium ergänzt mit 10 % FBS und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin.
    2. Jedes gut 7,5 µg DsRNA hinzu und inkubieren Sie bei 25 ° C für 24 h.
    3. Co transfizieren DsRNA-behandelten Zellen mit pBluescript und PMT-Kerbe11 (DGRC) allein oder mit pMT-Notch und pMT-Delta11 (DGRC) oder PMT gesägt17 für insgesamt DNA-Konzentration von 2 µg/Brunnen mit kommerziellen Transfection Reagens laut Protokoll des Herstellers.
      Hinweis: pBluescript wird als Kontrolle verwendet. Co transfizierten Zellen genannt werden S2-Kerbe & Deltatransiente oder S2-Kerbe & nachstehendflüchtigen Zellen gesägt.
    4. Inkubieren Sie die vorübergehend transfiziert S2-Zellen bei 25 ° C für 24 h.
    5. Fügen Sie 0,7 mM CuSO4 zu induzieren den Ausdruck der Kerbe und die Liganden und 3 Tage bei 25 ° C inkubieren.
  2. Bereiten Sie signalisieren Zellen, wie in 2.2 beschrieben.
  3. Führen Sie Aggregation zwischen Zellen sendet Signal und Signal-Empfang, wie in Abschnitt 2.3 beschrieben.
  4. Quantifizieren, Hemmung der Trans-Bindung von Cis-Liganden.
    1. Berechnen Sie die Anzahl der Aggregate pro mL zwischen S2 und S2-Delta oder S2 gesägt Zellen als Hintergrund-Steuerelement.
    2. Quantifizierung des Ausmaßes der Hemmung von Cis-Liganden wie folgt.
      1. Definieren Sie A Anzahl der Aggregate zwischen S2-Notchtransiente und S2-Delta-Zellen.
      2. B zu definieren, wie Anzahl der Aggregate zwischen S2 Zellen vorübergehend mit Notch und Delta Co transfiziert (S2-Kerbe & Deltatransient) und S2-Delta-Zellen.
      3. Berechnung der relativen Aggregation C = (B X 100) /A
      4. Berechnen von Ausmaß der Hemmung von Cis- Liganden (Delta oder Serrate) als 100- C.
        Hinweis: als Beispiel, wenn relative Aggregation 45 %, dann Cis ist-Liganden werden als hemmen die Trans-Bindung um 55 %.

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Ergebnisse

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Unsere Beobachtungen in Vivo vorgeschlagen, dass Verlust der Xylosyltransferase gen Shams führt zu Gewinn von Notch Signalisierung durch Delta-vermittelten Transerhöht-Aktivierung des Notch ohne Beeinträchtigung der Cis-Hemmung der Kerbe von Liganden8. Um diese Idee zu testen, wurden in-vitro- Zelle Aggregation Assays durchgeführt. Erstens wurde Shams Ausdruck in S2-Zellen abgerissen mit Shams DsRNA.

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Diskussion

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Kanonische Notch signaling hängt die Wechselwirkungen zwischen den Notch-Rezeptor und seine Liganden-5. Obwohl die meisten Studien auf der Notch-Signalweg in erster Linie die Bindung von Notch und Liganden in benachbarten Zellen (Trans) betrachten, Kerbe und dieselbe Zelle Liganden wirken zusammen, und diese sogenannten GUS-Interaktionen können eine hemmende Rolle in Aussparung 3,4-Signalisierung. Entsprechend, um die Mec...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

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Die Autoren erkennen Unterstützung von NIH/NIGMS (R01GM084135, HJN) und Mizutani Stiftung für Glycoscience (#110071 Finanzhilfe für HJN) und sind dankbar, Tom V. Lee für Diskussionen und Anregungen auf die Assays und Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine und Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) für Plasmide und Zell-Linien.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BioWhittaker Schneider s Drosophila-Medium, modifiziertesLonza04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X LösungGE Healthcare lifescience 
CELLSTAR 6-Well-PlatteGreiner Bio-One657 160
CELLSTAR 24-Well-PlatteGreiner Bio-One662160
VWR Mini-ShakerMarshell Sceintific12520-956
HämozytometerFisher Sceintific 267110
FuGENE HD TransfektionsreagenzPromegaE2311
MEGAscrip T7 TranskriptionskitAmbionAM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA-Aufreinigungskit)Zymo ResearchR1054
VistaVision Inverses MikroskopVWR
9MP USB2.0 Mikroskop Digitalkamera + fortschrittliche SoftwareAmScopeMU-900Bildaufnahme mit der ToupView-Software
PureLink Quick Gel Extraction KitInvitrogenK210012
Fötales RinderserumGenDepotF0600-050
MethotrexatSigma-AldrichA6770-10
Hygromycin BInvitrogenHY068-L6
KupfersulfatMacron Feinchemikalien4448-02
S2-ZellenInvitrogenR69007
S2-SerrateTom ZellenGeschenk von R. Fleming (Fleming et al., Development, 2013)
S2-Delta-ZellenDGRC152
S2-Notch-ZellenDGRC154
pMT-Delta-VektorDGRC1021Geschenk von S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate VektorGeschenk von Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch VektorDGRC1022Geschenk von S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFPGeschenk von Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step KitApplied Biosystem1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams)Angewandtes BiosystemDm02144576_g1 mit FAM-MGB-Farbstoff
TaqMan Genexpressionsassay für CG7939 (RpL32)Applied BiosystemDm02151827_g1mit FAM-MGB-Farbstoff
Applied Biosystems 7900HT Schnelles Real-Time-PCR-SystemApplied Biosystem435140596-Well-Blockmodul
SV30010

Referenzen

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Schlagwörter

Notch SignalisierungZellaggregationsassayTransaktivierungCis InhibitionDrosophila S2 ZellenZ hlung mit H mozytometerOrbitalsch ttlerinvertiertes zusammengesetztes Mikroskopdoppelstr ngige RNAKupfersulfat Induktion

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