Summary
Direkte indsprøjtning af kræft-afledte ekstracellulære vesikler (EVs) fører til omprogrammering af knoglemarv støtte tumor progression; dog er det uklart, hvilke celler der mægle denne effekt. Heri, beskriver vi en trinvis protokol for at undersøge EV-medieret tumor-mesenchymale stamceller (MSC) interaktioner i vivo, afslører en afgørende rolle for EV-uddannet MSCs i metastaser.
Abstract
Inden for tumor mikromiljø bidrage bopæl eller rekrutterede mesenchymale til stamceller (msc) til maligne progression i flere kræft typer. Under indflydelse af specifikke miljømæssige signaler, kan disse voksne stamceller frigive paracrine mæglere fører til accelereret tumorvækst og metastaser. Definere krydstale mellem tumor og MSCs er af primær betydning for at forstå de underliggende kræft progression mekanismer og identificere nye mål for terapeutisk intervention.
Kræftceller producerer store mængder af ekstracellulære vesikler (EVs), hvor dybt kan påvirke funktionsmåden af target-cellerne i svulsten mikromiljø eller på fjerne steder. Tumor evt vedlægge funktionelle biomolekyler, herunder inflammatorisk RNA'er og proteiner, (Kræftpsykologisk), som kan uddanne stromale celler at forbedre funktionen metastatisk kræft celler eller deltage i pre metastatisk niche dannelse. I denne artikel vil beskrive vi udviklingen af en prækliniske kræft musemodel, der giver specifik evaluering af de EV-medieret krydstale mellem tumor og mesenkymale stamceller. Vi beskriver først, oprensning og karakterisering af tumor-udskilles evt og vurderingen af EV internalisering af MSC'er. Vi derefter gøre brug af en multiplex perle-baseret immunassay til at evaluere ændringen af MSC cytokin udtryk profil induceret af kræft evt. Endelig, vi illustrere generation af en bioluminescerende orthotopic xenograft musen model af osteosarkom, der sammenfatter tumor-MSC interaktion, og Vis bidrag af EV-uddannet MSC'er til tumor vækst og metastase dannelse.
Vores model giver mulighed for at definere, hvordan kræft evt forme en tumor-støtte miljø, og at vurdere, om blokaden af de EV-medieret kommunikation mellem tumor og MSCs forhindrer kræft progression.
Introduction
Tumor mikromiljø deltager aktivt i de fleste, hvis ikke alle aspekter af tumordannelse og kræft progression, herunder metastase dannelsen og udviklingen af resistens over for therapeutics1. Dette understreger behovet for prækliniske orthotopic kræft musemodeller, der tillader dissektion af de komplekse tumor-stroma interaktioner forekommer i tumor niche.
Blandt de mange cellulære komponenter af tumor mikromiljø bidrage mesenchymale stamceller (msc) stærkt til kræft progression i flere typer af kræft som brystkræft, prostatakræft, hjernesvulster, myelomatose og osteosarkom2 ,3,4,5,6,7. MSC'er er Multipotente stamceller, der findes i forskellige voksne og føtale væv, herunder knoglemarv, fedtvæv, placenta, navlestrengsblod og andre8,9. Som reaktion på kræft-genereret inflammatoriske signaler, MSCs overflytte mod tumor websteder, indarbejde tumor mikromiljø og i sidste ende udvikle sig til kræft-støtte celler10. Disse kræft-associerede MSCs give væsentlige faktorer (dvs., vækstfaktorer, kemokiner, cytokiner og immunosuppressive mæglere) for tumor progression handler både på tumorcellerne og på de omkringliggende stroma2, 3 , 11 , 12 , 13. selv om fremme af tumor virkningerne af kræft-associerede MSCs er blevet undersøgt i talrige kræftmodeller, de mekanismer, hvorved tumorceller omprogrammere MSC'er til at forme en kræft-fremme niche er dårligt forstået. Her beskriver vi generation af en orthotopic xenograft model, der specifikt giver mulighed for undersøgelse af pro-tumorfremkaldende interaktionen mellem knogle kræftceller og MSCs via ekstracellulære vesikler (EVs).
Evt er afgørende mediatorer af intercellulær kommunikation mellem tumor og stromale celler14. Evt bære funktionelle biomolekyler i cellen i oprindelse, herunder proteiner, lipider og regulerende RNA'er. Når frigivet i det ekstracellulære rum, disse blærer kan tages op af omkringliggende celler eller transporteres til fjerntliggende steder via blod eller lymfe cirkulation, og dybt kan påvirke mål celle adfærd. 15 , 16 , 17 For eksempel udbredelsen af kræft evt af stromale fibroblaster kan resultere i myofibroblast differentiering støtte angiogenese og fremskynde tumor vækst i vivo18,19, internalisering af endotel celler kan stimulere tumor angiogenese og øge vaskulær permeabilitet16,20, og interaktion med immunsystemet celler kan føre til undertrykkelse af antitumor immunrespons21.
Vi viste for nylig, ved hjælp af en bioluminescerende orthotopic xenograft musen model af osteosarkom, at tumorceller frigive store mængder af evt at lynhurtig MSCs at erhverve en pro-tumorfremkaldende og pro-metastatisk fænotype. Denne effekt er på grund af en dramatisk ændring i MSC cytokin udtryk profil (benævnt "MSC uddannelse"), og kan forebygges ved administration af en terapeutisk interleukin-6 receptor (IL-6R) antistof7. Vores arbejde viste, at kræft evt er afgørende modulatorer af MSC adfærd, hvilket giver en begrundelse for mikromiljø-målrettede metoder til at standse osteosarkom progression. Heri, beskriver vi en trinvis protokol for at undersøge EV-medieret tumor-MSC interaktion i vivo. Denne model er beregnet til: 1) specifikt definere kræft EV-inducerede ændringer af MSC adfærd i tumor mikromiljø, 2) vurdere, hvordan denne interaktion bidrager til knogle tumorvækst og metastase dannelse og 3) undersøgelse om at blande sig med EV-medieret krydstale i vivo forhindrer kræft progression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskers fedtvæv for mesenkymale stamceller isoleret hidrører fra department of Plastic Surgery Tergooi Hospital (Hilversum, Holland) efter godkendelse af den institutionelle etiske komité og skriftligt informeret samtykke. Normal god landbrugspraksis-positive adipøst MSCs blev indhentet fra Institut for medicinsk og kirurgisk Sciences for børn og voksne (universitetet i Modena og Reggio Emilia).
Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med den nederlandske lov om dyreforsøg, og protokollen blev godkendt af Udvalget om dyreforsøg på VU University medical center, Amsterdam, Holland.
1. isolering af Tumor-udskilles ekstracellulære vesikler.
- Forberede EV-forarmet føtal bovin Serum (FBS) ved centrifugering FBS på 70.000 x g natten (16 timer), ingen bremse, ved 4 ° C ved hjælp af en ultra-svingende spand rotor (forvente 1 h til deceleration). Omhyggeligt indsamle supernatanten (EV-forarmet FBS) uden at forstyrre pelleten. Filtrere den EV-forarmet FBS med et 0,22 µm filter.
- Forberede EV-forarmet dyrkningsmediet ved at supplere Iscoves modificerede Dulbecco Medium (IMDM) med 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM glutamin (1 x P/S/G) og 5% EV-forarmet FBS.
- Seed 3 x 106 143B celler i 175 cm2 kolber og kultur dem i EV-forarmet næringssubstratet i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Når cellerne er 80-90% sammenflydende (typisk efter 36 h til 48 h), skal du indsamle supernatanten fra 8 x 175 cm2 flasker (28 mL/kolbe) for EV-isolation.
- Forhånd klare celle supernatanten for at fjerne celler og celle debris ved differentieret centrifugering (centrifugering supernatanten af den forrige runde hver gang) efter følgende protokol:
- Der centrifugeres supernatanten to gange på 500 x g i 10 min.
- Der centrifugeres supernatanten to gange på 2000 x g i 15 min.
- Der centrifugeres supernatanten to gange på 10.000 x g i 30 min.
- Udføre alle centrifugations ved 4 ° C med maksimal acceleration og deceleration hastighedsindstillinger. Efter hvert trin omhyggeligt indsamle EV-holdige supernatanten, efterlod ca. 1 mL. Gå straks til at træde 1,5 eller butik den pre-ryddet aircondition medium ved-80 ° C indtil EV isolation.
- Isolere evt ved centrifugering af pre-ryddet konditioneret medium engang på 70.000 x g for 1 h, langsom bremse, ved 4 ° C i ultra-centrifugeglas (endelige rumfang 38,5 mL/rør) ved hjælp af en ultra-svingende spand rotor.
- Omhyggeligt Fjern supernatanten, forlader omkring 1 mL bag resuspend de EV-holdige piller i den resterende mængde, samle dem alle i et ultracentrifuge rør, og tilføje fosfatbufferet saltopløsning (PBS) indtil komplet rør fyldet (endelige rumfang 38,5 mL).
- Der centrifugeres igen på 70.000 x g i 1 time ved 4 ° C, uden bremse (forvente 1 h til deceleration). Forsigtigt fjerne supernatanten uden at forstyrre pelleten og efterlade 100-200 µL.
- EV-resuspenderes og justere den endelige mængden til 200 µL med PBS (standardiseret for alle EV-isolering). Bruge EV forberedelse straks eller opbevares ved-80 ° C indtil Brug22.
Bemærk: Evt kan lagres til 6 måneder ved-80 ° C.
2. EV karakterisering.
Renset evt kan visualiseres ved transmissions Elektron Mikroskopi (TEM)23.
- Mix EV preps med et lige saa stort volumen af 4% PARAFORMALDEHYD i fosfat buffer.
- Frakke 200 mesh Formvar-carbon-belagt nikkel TEM gitre med 5 µL af EV suspension i 20 min. ved stuetemperatur.
- Fiksere EV prøver på TEM gitre med 1% glutaraldehyd i 0,1 M fosfat-buffer (pH 7,0), kontrast med uranyl oxalat (pH 7,0), og integrere i en blanding af 4% uranyl acetat og 2% methyl cellulose i en 1:9 forholdet på is.
- Fjerne gitre med rustfrit stål sløjfer og duppes den overskydende væske med filtrerpapir at sikre en passende tykkelse af celluloseregenerater methyl.
- Efter tørring, undersøge gitre med et transmissions-elektronmikroskop og tage billeder med et digitalkamera, der er koblet til den tilsvarende billede software.
3. uddannelse af MSCs af tumor-afledte evt.
- Forberede MSC dyrkningsmediet ved at supplere alpha-minimum afgørende medium (alpha-MEM) med 4% EV-forarmet menneskelige trombocyttal Lysate (hPL)24, heparin (10 U/mL) og 1 x P/S/G.
Bemærk: EV-forarmet hPL opnås efter proceduren beskrevet i afsnit 1.1. - Frø 1,4 x 106 fedt-afledt MSCs pr. 75 cm2 kolbe og kultur dem i EV-forarmet MSC-kultur medium i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Når celler nå 70% sammenløb, tilføjer 143B osteosarkom - eller styre humane fibroblaster (hf)-evt, 10 µL EV forberedelse/cm2 af kultur kolbe. Der inkuberes i 24 timer og tilføje den samme mængde evt for yderligere 6 timer. Bemærk: Humane fibroblaster er kulturperler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) 10% FBS og evt er isoleret som beskrevet i afsnit 1.
- Indsamle MSC supernatanten, centrifugeres 1 x 500 x g i 5 min. ved 4 ° C (med maksimal acceleration og deceleration hastighedsindstillinger), overføre til en ny tube og gemme fjernes supernatanten ved-80 ° C hen til muliggøre fremtidige cytokin analyse (afsnit 5).
- In vivo forsøg (afsnit 6), uddanne normal god landbrugspraksis-positive MSCs25 som beskrevet i afsnit 3.1 til 3.3, indsamle cellerne og resuspend dem i PBS i en endelig koncentration på 106 celler pr. 100 µL. holde celler på is indtil injektion.
4. EV internalisering Assay.
For at visualisere EV optagelse af MSC'er, mærke evt med et grønt-fluorescerende linker farvestof (GFLD) (kommercielt tilgængelige) efter producentens protokol:
- Kort, tilføje 180 µL fortynder til 200 µL EV prep. Fortyndes 1 µL af GFLD farvestof i 50 µL fortyndingsvæske, og tilføje 20 µL fortyndet farvestof til den fortyndede EV prep.
- Forsigtigt mix af pipettering og Inkuber i 3 min. ved stuetemperatur i mørke.
- Der tilsættes 5 mL af 0,1% BSA i PBS, overføre til ultra-centrifugeglas og fylde røret med PBS (endelige rumfang 38,5 mL/tube).
- 1 x på 70.000 x g i 1 time ved 4 ° C, uden bremse der centrifugeres (forvente 1 h til deceleration). Forsigtigt fjerne supernatanten og resuspenderes mærket EV-i en endelige mængden af 200 µL (justere lydstyrken med PBS).
- Føje mærket evt til MSC kultur eller gemme dem på-80 ° C. Efter natten inkubation, vurdere vesikel internalisering af Fluorescens mikroskopi og flow flowcytometri7.
5. vurdering af MSC cytokin udtryk profil.
- For multiplex kvantificering af interleukin-8 (IL-8), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10), tumornekrosefaktor (TNF) og interleukin - 12p 70 (IL - 12p 70) protein niveauer i MSC aircondition medium (Se trin 3.4), bruge en kommercielt tilgængelig cytometric perle array (CBA) for menneskelige inflammatoriske cytokiner efter fabrikantens anvisninger.
- Kort, bland antistof konjugeret capture perler og tilføje dem til alle assay rør. Tilføje cytokin standard fortyndinger eller konditioneret medium prøverne til rør.
- Tilføje påvisning reagens og inkuberes 3 timer på RT.
- Vask perler med den medfølgende vask løsning. Måle prøver ved hjælp af en flow forskellige og analysere data efter fabrikantens anvisninger.
6. generation af en Orthotopic Xenograft musemodel af osteosarkom.
- Tillad seks uger gamle, kvindelige, Athymic nøgen-Foxn1nu mus til at akklimatisere i mindst en uge før du starter de eksperimentelle procedurer.
- En dag før den kirurgiske procedure og som peri-operative analgesi tilføje paracetamol til drikkevandet. Fortyndes "paracetamol løsning for børn" (Se Tabel af materialer) med vand for at få en slutkoncentration på 2 mg/mL. Baseret på en gennemsnitlig vandindtag 150 mL/kg/dag, og en gennemsnitlig vægt 20 g, denne dosis er tilstrækkelig til at nå en dosis på 6 mg/mus/dag (300 mg/kg/dag).
- Fortsætte smertestillende behandling indtil 24 timer efter operationen, eller længere, hvis dyr, der udviser tegn på smerter.
- På dagen for den kirurgiske procedure, indsamle kulturperler luciferase-positive (udsvingene) 143B celler (tidligere genereret af lentiviral transduktion) ved centrifugering ved 300 x g i 10 min. og resuspend celler i en koncentration på 2 x 105 celler/mikroliter i PBS. Holde cellesuspension på isen til 6 timer.
- Autoklave kirurgisk udstyr. Forberede og rengøre arbejdsområdet og placere steriliseret saks og pincet på sterile ark. 20 min før den kirurgiske procedure (trin 6,8), injicere dyrene subkutant med buprenorphin (0,05 mg/kg, fortyndet i 0,9% saltvand) som smertestillende ved hjælp af 0,5 mL insulin sprøjter (29-gauge kanyle).
- Lige før bedøve hvert dyr, udfylde en 10 µL sprøjte med mindst 1 µL af den koncentrerede (udsvingene) 143B cellesuspension (Se trin 6.4).
- Bedøver dyr med isofluran inhalation anæstesi (2-3% ilt). Kontrollere niveauet af anæstesi af tå-klemme dyret. Når dyret ikke reagerer på den knibe, dvs., det er dybt bedøvede, anvende salve på øjnene at forhindre tørhed under anæstesi.
- Placer dyret på ryggen med hovedet i en anæstesi maske og med ben mod operatøren. Flex venstre knæ. Aftør huden med 70% ethanol og anvende lidocain (2%) med en bomuld tip 3 gange som lokal analgetikum.
- Brug en steril kirurgiske kniv til at gøre en lille snit (ca. 5 mm) på huden lige under knæet for at udsætte tibia. Bore et hul i tibia, cirka 2 mm under knæet ved hjælp af en 0,8 mm micro twist drill. Være forsigtige for ikke at bore igennem begge skinneben cortex.
- Injicér 1 µL cellesuspension (ca 2 x 105 celler) langsomt (i ca. 5 sekunder) i hullet ved hjælp af en 26-gauge kanyle. Luk hullet med en dråbe af væv lim til at forhindre tilbagestrømning af suspensionen.
- Lukke huden med monofilamenter suturer og en dråbe af væv lim. Lad den animalske genoprette i en godt opvarmet miljø (brug en varmelampe). Efterlad ikke dyr uden opsyn indtil de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystbenet recumbency. Først efter at dyrene er fuldt tilbagebetalt fra anæstesi, returnere dem til deres egne bure.
- To dage efter tumor podning, injicere EV uddannet eller naive normal god landbrugspraksis-positive MSCs (106 celler i 100 µL PBS, se trin 3.5) intravenøst med en 0,5 mL insulin sprøjte i halen vene af mus.
- Følg tumorvækst af bioluminescens imaging26 to gange om ugen. Med henblik herpå, injicere mus i.p. med 150 µL D-luciferin (30 mg/mL) med en insulin sprøjte. 10 min efter injektion, Placer dyrene i bioluminescens imaging system og måle photon-flux genereret af tumorceller.
- Derudover måle diameteren af den primære knogletumor med en skydelære. Tumor volumen (i mm3) anslås ved bredde x længde2 x 0,5.
- Bemærk: Human slutpunkter er defineret som tumor diameter > 15 mm eller vægttab > 15%.
7. vurdering af lunge knude antallet
- Når et dyr når Human slutpunktet defineret i trin 6.14 (i ca 3-4 uger), opsige eksperimentet og indsamle og analysere alle relevante væv.
- 10 min. før euthanization, injicere 150 µL D-luciferin (30 mg/mL) med en 0,5 mL insulin sprøjte.
- Bedøver dyr med isofluran inhalation anæstesi (Se trin 6.7). Bekræfte dybde af anæstesi ved fravær af reaktioner af musen til at tå-klemme. Aflive mus af cervikal dislokation27.
- Indsamle lunger, lever, milt og nyrer ved hjælp af steriliseret saks og pincet. Vask organerne i PBS til at fjerne blod spor og læg dem på en petriskål.
- Anbringes petriskålen med organer i bioluminescens imaging system. Måle bioluminescens signal på begge sider af organer. Umiddelbart efter måling, styrte organer i 4% formalin til at fiksere dem. (24-72 timer, på RT) for fremtidige histologiske analyse.
- Behandle de fremkomne billeder med passende billedbehandlingsprogrammer ved manuel tærskel. Tæl antallet af lunge knuder på hvert billede. Tælle det samlede antal lunge knuder på begge sider af lungerne.
8. histologiske analyse
- Histologiske analyse af lungevæv:
- Integrere formalin-fast organer i paraffin og forberede 6 µm væv dias.
- Deparaffinate lungevæv dias og udføre antigen hentning af kogende dem i 15 min i 0,01 M citratbuffer (pH 6).
- Glassene inkuberes vandret ved stuetemperatur med antihumant vimentin antistof (200 µg/mL) fortyndet 1:150 i antistof-fortyndingsmiddel (kommercielt tilgængelige) og efterfølgende med det sekundære, HRP-mærket antistof (0,5 mg/mL, fortynding 1: 500). Pletten væv med 3'-diaminobenzidine (DAB) og hæmatoxylin counter farvning.
- Observere farves væv dias ved hjælp af en optisk mikroskop og koblet til det tilsvarende kamera billede software.
- At vurdere tilstedeværelsen af normal god landbrugspraksis-positive MSCs i mus forbenede:
- Afkalke forbenede i ethylendiamintetra syre (EDTA) 0,24 M, pH 7.2-7.4. Opdater EDTA buffer hver anden dag indtil knoglerne blive fleksibel (ca. 1 uge).
- Dehydrere forbenede og infiltrere dem med paraffin. Integrere forbenede (herunder osteosarkom væv) i paraffinblokke.
- Bruge en mikrotom til at forberede 6 µm paraffinsnit. Placer paraffinsnit på glas dias. Efter tørring, gemme dias natten over ved stuetemperatur.
- Udføre varme-medieret antigen genfinding ved hjælp af citratbuffer (se punkt 8.1.2) og plette væv med anti-normal god landbrugspraksis antistof (hele antiserum) i en 1:900 fortynding i antistof-fortyndingsmiddel. Counterstain væv med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
- Observere væv dias med et fluorescens mikroskop koblet til den tilsvarende billedbehandlingsprogrammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse, vi har undersøgt osteosarkom-udskilles evt evne til at uddanne MSCs hen imod en pro-tumorfremkaldende og pro-metastatisk fænotype. Vi viser, at osteosarkom celler frigive exosome-lignende evt, der er internaliseret af MSC'er. Vi målt ændring af MSC cytokin udtryk profil induceret af kræft EVs, og vurderet effekten af de EV-uddannet MSCs på tumorvækst og metastase dannelse. Den generelle repræsentation af undersøgelsen design er illustreret i figur 1.
Evt udgivet af 143B osteosarkom celler eller kontrol humane fibroblaster var renset ved differentieret centrifugering. EV renhed blev bekræftet ved elektronmikroskopi, som afslørede, at forberedelserne hovedsagelig indeholdt vesikler med en diameter på mellem 40-100 nm (fig. 2A). For at vurdere, om kræft evt interagere med MSC'er, vi mærket vesikler med et grønt-fluorescerende lipofile linker farvestof (GFLD) og inkuberes dem natten over med target-cellerne. Af Fluorescens mikroskopi observeret vi effektive EV optagelse af MSCs (figur 2B). Flow flowcytometri Analysen viste desuden, at osteosarkom og kontrol evt er internaliseret med sammenlignelige effektivitet (figur 2C). For at undersøge, om osteosarkom evt ændre MSC'er immunmodulerende egenskaber, brugte vi en multiplex perle-baserede cytokin immunassay, der viste, at tumor evt bestemme en 2-fold stigning i produktionen af IL-8 og IL-6 i forhold til menneskets fibroblast kontrollere evt (figur 2D, E).
For at undersøge, om osteosarkom evt uddanne MSC'er til at vedtage en pro-tumorfremkaldende og pro-metastatisk fænotype, ansat vi en en bioluminescerende, orthotopic xenograft musemodel af osteosarkom. Alle dyreforsøg blev udført af en operatør. Metastatisk 143B-udsvingene celler blev transplanteret ind i tibia athymiske nøgen mus, og efter to dage, osteosarkom-xenografted mus blev udsat for en enkelt indgift af normal god landbrugspraksis-positive EV-uddannet MSCs. mus modtage naive (ikke-uddannede) MSCs eller ingen MSCs blev brugt som kontrolgrupper. Ingen dyr døde før beskrevet slutpunkterne. Vi udviste ved caliper måling og bioluminescens imaging (BLI), mus behandlet med EV-uddannet MSCs havde fremskyndet tumorvækst sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 3A). Repræsentative billeder af tumorstørrelse af hver behandling arm er vist i figur 3C. Vores data viser, at en enkelt i.v. indgift af uddannede MSCs påvirker tumor progression så tidligt som i dag 10 efter podning (fig. 3B). Derudover kan fire dage efter systemisk injektion af uddannet/naive udtryk for normal god landbrugspraksis MSCs (figur 4A), vi visualisere udtryk for normal god landbrugspraksis celler både i knoglemarv (fig. 4B) og i tumor væv (figur 4 C), påviser Civilingeniør homing til tumor site.
Ex vivo BLI analyse af lunger, lever, nyre og milt (data ikke vist) viste lunge knude dannelse udelukkende i lungerne på mus af alle behandling våben (figur 4D-F). Påfaldende, uddannet mus modtage EV-uddannet MSCs ikke havde højere antal lungemetastaser sammenlignet med mus modtage-uddannet MSCs eller ingen MSCs (figur 4G), tyder på, at inden for tumor mikromiljø MSCs stigning i metastatisk potentialet af osteosarkom celler in vivo7.
Figur 1 . Skematisk fremstilling af forsøgsdesign. Menneskelige primære MSCs er uddannet med evt isoleret fra kulturperler metastatisk osteosarkom (143B) celler. Kræft EV renhed er vurderet ved elektronmikroskopi, og internalisering af MSCs er visualiseret ved Fluorescens mikroskopi og analyseret ved flowcytometri. Ændringer i profilen MSC cytokin udtryk evalueres af cytometric perle array (CBA). For at definere rollen af EV uddannet MSC på tumorvækst og metastase dannelse, osteosarkom-bærende mus er indsprøjtet med EV-uddannet (eller naive) MSC. Tumorvækst er efterfulgt af bioluminescens imaging (BLI) og caliper måling, mens metastase dannelse er evalueret på eksperimentelle end-point af ex vivo BLI og histologiske analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Rensning af evt- og deres interaktion med MSCs. (A) transmissions Elektron Mikroskopi Mikrograf af evt-isoleret fra 143B celler (skalalinjen: 100 nm). (B) optagelse af GFLD-mærket 143B evt af MSCs vurderet af Fluorescens mikroskopi (skalalinjen: 10 µm). (C) internalisering af GFLD-mærket 143B evt (orange) eller kontrol (menneskelige fibroblast, hf) evt (grøn) med MSCs som analyseres ved flowcytometri. (D) Multiplex påvisning af inflammatoriske cytokiner i supernatanter af MSCs udsat for 143B (143B EV-MSC) eller hf-evt (hf EV-MSC) af cytometric perle array. 143B-MSC express højere niveauer af IL-6 og IL-8 i forhold til kontrol (ubehandlet og hF EV-behandlet) MSCs. Stiplede linjer angiver skift i cytokin produktion. (E) IL-8 og IL-6 proteinkoncentration i konditioneret medierne af EV-behandlede MSCs som analyseret af cytometric perle array, udtrykt som fold induktion i forhold til den ubehandlet kontrol. Dataene udtrykt som betyder ± SD, n = 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . En bioluminescerende, orthotopic xenograft musemodel af osteosarkom. (A) estimering af tumor volumen benytter skydelære målinger, og (B) tumorvækst målt ved bioluminescens imaging (BLI). Tumorstørrelse er udtrykt som photon flux (fotoner/sek). p < 0,01, ikke-uddannet cand.SCIENT (n = 6) vs uddannet cand.SCIENT (n = 6), parrede t-test. Dataene udtrykt som betyder ± SEM. (C) repræsentant BLI billeder af mus med etablerede osteosarkom tumorer (toppanelet). Farveskala bar spænder fra 7,7 x 107 (lilla) til 2,6 x 108 (rød) fotoner/sek. I det nederste panel, er området tumor visualiseret uden BLI overlay. Pilene angiver tumor bulk. Skalere barer: 0,6 cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Imaging MSCs og ex vivo lungevæv. (A) Fluorescens mikroskopi billede af kulturperler normal god landbrugspraksis-positive fedt-afledt MSCs (grøn). (B) immunofluorescens farvning af normal god landbrugspraksis-positive MSCs i knoglemarven og (C) i tumor væv af MSC-modtagende mus (grøn: MSC'er, blå: DAPI farves kerner; skala bar 10 µm). (D-F) Ex vivo bioluminescens imaging (BLI) viser højere antal metastatiske foci i mus modtage EV-uddannet MSCs (F) i forhold til mus modtage naive MSC (E) eller ingen MSC (D). Farve skalalinjen varierer fra 1 x 106 (lilla) til 1,5 x 106 (rød) fotoner/sek. (G) kvantificering af lunge metastase nummer som visualiseret ved BLI (linjer repræsenterer median; * p < 0,05, en-sidet t-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumor-udskilles ekstracellulære vesikler (EVs) kan ændre fysiologi af lokal og fjern mesenchymale celler til at generere en tumor-støttende miljø. Her beskriver vi generation af en prækliniske musemodel af osteosarkom, der giver dissektion af de EV-medieret interaktioner mellem tumorceller og mesenkymale stamceller-celler (msc) i vivo. Vi viser, at systemisk injektion af menneskelige tumor EV-uddannet MSCs i mus forsynet med osteosarkom xenografts kraftigt fremmer kræft vækst og metastase dannelse ved at aktivere IL-6/STAT3 signaling vej7.
Nylige undersøgelser har vist, at kræft evt kan hjælpe i dannelsen af den pre metastatisk niche ved at ændre funktionsmåden for lokale eller knoglemarv-afledte stromale celler16,28,29. Disse undersøgelser er gennemført for det meste ved direkte indsprøjtning kræft-afledte vesikler i modtagerens musen, hvilket komplicerer identifikation af de ansvarlige for fremme af tumor effekter celletyper. I vores protokol forekommer uddannelse af MSCs med kræft evt i vitro inden MSC injektionen. Denne tilgang gør det muligt for adressering af specifikke bidrag af tumor-MSC krydstale til kræft progression, og minimerer konfunderende indirekte virkninger af kræft evt på andre dele af lokale eller systemiske miljøet.
For at vurdere, om de uddannede MSCs hjem til tumor site, sprøjtet vi systemisk normal god landbrugspraksis-positive MSCs i halen vene af tumor-bærende mus. Hale vene injektioner er en afgørende, men teknisk udfordrende skridt i mange eksperimentelle protokoller. For at sikre minimal variation blandt injektioner bør proceduren udføres af erfarne efterforskere. Korrekte intravenøs administration kan bekræftes visuelt ved at observere bevægelse af væske gennem venen. Hvis en hvid område vises på halen eller modstand er stødt på under injektion, blev vaskulær adgang ikke opnået. I dette tilfælde bør proceduren gentages ved at indsætte nålen ovenfor første injektionsstedet. Fordi MSCs let hjem på tumor, kan succesfuld administration af (normal god landbrugspraksis-positive) MSCs bekræftes ved immunfluorescens farvning af tumor væv og knoglemarv fire dage efter injektion (fig. 4B, C).
Vi viser, at kræft-udskilles evt fremkalde en tumor-støttende fænotype i MSCs ved at ændre produktionen af inflammatoriske cytokiner. Denne konstatering er særlig relevant siden immun graduering og tumor immun unddragelse er vigtige mekanismer i maligne progression. Vores data tyder på, at kræft evt kan direkte, som rapporteret af uafhængige undersøgelser21,30,31,32,33, eller indirekte (via MSCs) påvirke medfødte eller adaptive immun komponenter. Dog begrænser bruger en xenograft (immunkompromitterede) model muligheden for at undersøge dette aspekt af evt. Således skal tilsvarende metoder i immunkompetente eller humaniseret musemodeller gennemføres for at definere rollen, EV-medieret tumor-MSC-immun celle interaktioner i kræft.
Endelig fordi MSCs kan ansættes fra knoglemarven eller andre væv kilder til tumorer, vores metode er ikke begrænset til undersøgelse af knogle kræft, men kan anvendes til at undersøge rollen af tumor EV-uddannet MSCs i flere kræft typer2, 3 , 4 , 5 , 6, som nylige undersøgelser i melanom og lymfom modeller bekræfte34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
S.R. Baglio blev støttet af et fællesskab af Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) medfinansieres af den Europæiske Union. Hertil kommer, har dette projekt modtaget støtte fra EUs Horisont 2020 forskning og innovation program under tilskudsaftalen Marie Sklodowska-Curie ingen 660200 (til S.R. Baglio).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor |
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM |
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera |
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope |
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |
| Incubator | Nuaire | 4750E | |
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer |
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill |
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill |
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer |
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |
| Autoclave | Astell | n.a. | |
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |
| Culture media | |||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |
| heparin | LEO | 012866-08 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |
| Cells | |||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced |
| Disposables | |||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes |
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |
| Petri dish | Sigma - Aldrich | P7612 | |
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |
| Reagents / kits | |||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD |
| BSA | Sigma | A8412 | |
| CBA - human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife |
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 |
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids |
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 |
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |
| Mice experiments | |||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |
| Sutures | Ethicon | V926H | |
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
- Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795 (2013).
- Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
- Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
- Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
- Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
- Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31 (2017).
- Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
- Huang, W. -H., Chang, M. -C., Tsai, K. -S., Hung, M. -C., Chen, H. -L., Hung, S. -C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
- Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
- Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
- Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
- Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
- Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
- Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
- Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127 (2015).
- Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
- Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
- Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
- Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
- Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
- Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).
