Einem Rattenmodell der orthotopen Lebertransplantation mit einer neuartigen magnetischen Anastomose-Technik für Suprahepatic Vena Cava Wiederaufbau

Rattenmodell der orthotopen Leber Transplantation (OLT) ist unerlässlich für die Transplantation Forschung^1,2. Die erste Ratte OLT wurde von Lee Et Al. 1973³beschrieben. Bei diesem Modell wurden die Schiffe durch die Hand-Nahttechnik rekonstruiert. Hand-Nahttechnik erfordert fortgeschrittene mikrochirurgischen Kenntnisse, welche Grenzen deutlich seine Verwendung. Seitdem wurden verschiedene Modifikationen des ursprünglichen Protokolls Ratte OLT gemeldet. Unter ihnen die Manschette-Technik für die Anastomose der Pfortader (PV) und Infrahepatic Vena Cava (IHVC) berichtet von Kamada Et Al. im Jahr 1979 eine wesentliche Verbesserung zu diesem Modell gilt als erheblich die Wiederaufbau-Verfahren^{4 vereinfacht} . Aufgrund der kurzen vorderen Wand die Empfänger Suprahepatic Vena Cava (SHVC) ist die Manschette Technik jedoch sehr schwierig, für den Wiederaufbau der SHVC verwenden. Die meisten Forscher auf diesem Gebiet nutzen noch die Hand-Nahttechnik für SHVC Rekonstruktion, wodurch es den Engpass Schritt in der Ratte OLT^5,6,7.

Die magnetische Anastomose Technik (d.h., Magnamosis) ist eine Methode für die Verbindung von zwei Schiffen oder anderen röhrenförmigen Strukturen über die anziehende Kraft zwischen zwei Magneten^8,9,10,11. Die magnetische Kraft allmählich komprimiert und das Gewebe in eine starke, sutureless Anastomose^12,13umbaut. Diese Kompression Anastomose nachweislich wirksam bei Menschen^14,15. Wir haben ein paar magnetische Ringe speziell für die Anastomose SHVC bei Ratten konzipiert. Unsere aktuelle Studie hat gezeigt, dass die magnetische Anastomose Technik Hand-Nahttechnik für den Wiederaufbau der SHVC in Ratte OLT¹⁶überlegen ist. Der Zweck dieses Artikels ist es, eine ausführliche, schrittweise Protokoll für den Wiederaufbau der SHVC bei Ratten mit der neuartigen magnetischen Anastomose-Technik zur Verfügung zu stellen.

Das Protokoll wurde gemäß den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurde vom Ausschuss für die Ethik des Tieres Experimente von Xi Jiaotong-Universität, Xi ' an, Provinz Shaanxi, China genehmigt.

Hinweis: Keines der Verfahren in diesem Protokoll wurde unter einem Operationsmikroskop durchgeführt.

1. präoperative Vorbereitung

1. Das Design und die Form der magnetische Ringe (Abbildung 1)
   1. Montieren Sie das magnetische Anastomose Gerät indem man ein paar Neodym-Eisen-Bor Magnet Ringe.
   2. Entwerfen der Ringe entsprechend den Parametern der Ratte SHVC mit einer Hauptachse Durchmesser, Nebenachse Durchmesser, Dicke und Gewicht von 8 mm, 5,5 mm, 1 mm, 0,5 g, beziehungsweise.
   3. Kurve die Ringe in die gewünschte Form durch einen Draht-Elektroden-Schleif-Verfahren beschichten die erzielten Ringe mit einer Titan-Oxid-Airbrush und Sterilisieren mit 500 mg/L Ethylenoxid bei 55-60 ° C für 6 h.
2. Die Manschetten (Abbildung 2)
   1. Bereiten Sie die Manschette durch Schneiden der Polyethylenschlauch Anastomose der IHVC und PV vor. Sicherzustellen, dass die Manschette Körper 5 mm ist lang mit einem 2 mm-Manschette-Erweiterung.
      Hinweis: Die innere und äußere Durchmesser der PV-Manschette sind 1,8 und 2,1 mm, während diejenigen der IHVC Manschette 2,6 und 2,8 mm, beziehungsweise.
3. Der Stent (Abbildung 2)
   1. Vorbereiten des Stents Anastomose der BD durch Schneiden 24-G intravenös Kanüle mit einer Länge von 5 mm, schräge an beiden Enden zu produzieren.
4. Versuchstiere
   1. Verwenden Sie männliche Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht zwischen 250 und 280 g als Geber und Empfänger. Stellen Sie sicher, dass der Empfänger das gleiche Gewicht oder etwas schwerer (< 10 g) als der Geber.
   2. Halten Sie die Ratten in klimatisierten Zimmern mit kostenfreiem Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser vor der Operation.

(2) Spender Betrieb

1. Injizieren Sie Buprenorphin (0,05 mg/kg) subkutan als Analgetikum 1 Stunde vor der Operation.
2. Die Spender-Ratte von Isofluran Inhalation zu betäuben. Verwendung 5 Vol % Isofluran bei einer Durchflussrate von 1,5 L/min in einem Plexiglas-Kasten für die Induktion der Anästhesie und 2 Vol % Isofluran bei einer Durchflussrate 0,6-0,8 L/min auf den Kegel Maske für die Aufrechterhaltung der Narkose. Bestätigen Sie die Tiefe der Narkose durch eine Prise Zehe und eine Prise Haut.
3. Rasieren Sie die gesamte Bauchhaut der Ratte mit einen elektrischen Rasierer für sauberere Belichtung ermöglichen. Desinfizieren Sie die entsprechenden Haut mit Povidon-Jod-Lösung.
4. Öffnen die Bauchhöhle über einen kreuzförmigen Schnitt mit chirurgische Schere aus der Wurzel des Penis Verlängerung um 1 cm oberhalb der so entlang Linea Alba, Verlängerung vom Mittelpunkt der längs-Schnitt, die midaxillary Linie. Exteriorize Magen-Darm-Trakt auf der linken Seite und mit nassen Gaze abdecken.
5. Spannen Sie und ziehen Sie so in Richtung zum Kopf mit einem blutstillende Zangen. Das falciform Ligament und das Bindegewebe um die Leber zu sezieren. Isolieren Sie und verbinden Sie die linken minderwertigere Phrenicus Vene mit einer 6-0 Seide Naht.
6. Den Stent in den Gallengang einfügen.
   1. Klemmen Sie die BD nur oberhalb der Stelle, wo die Gastroduodenal Ader die Pfortader mündet, und ziehen sie um ein wenig Spannung mit einem Mikrozangen zu erhalten. Führen Sie dann einen "V" Einschnitt 1 mm Länge an der vorderen Wand ca. 5 mm proximal bis zum biliären Zusammenfluss von Mikro Schere.
   2. Einsetzen Sie den Stent in das Lumen der Gallenwege mit einer gebogenen Mikrozangen. Sicherstellen Sie, dass mindestens die Hälfte der Stent liegt außerhalb der Gallengang.
   3. Den Stent mit einer 6-0 Seide Naht zu sichern. Schneiden Sie ein Ende der Naht. Halten Sie die andere, während spätere Anastomose zu halten. Transekt unterhalb der Stent im Gallengang und sicherstellen, dass die Galle von Stents kommen kann.
7. IHVC bis auf die Ebene der linken Nieren Ader zu isolieren. Befreien Sie IHVC vom vorderen und seitlichen umgebenden Gewebe von Baumwolle Knospe Dissektion, bis die IHVC skelettiert ist. Trennen Sie und verbinden Sie der rechten Nebenniere Ader und die rechts renal Ader mit einer 6-0 Seide Naht.
8. Heparinize der Ratte durch Injektion 50 U von Heparin verdünnt in 2 mL normale Kochsalzlösung über die dorsale Vene des Penis.
9. Durchspülen der Leberzellkrebs.
   1. Isolieren der Bauchschlagader unterhalb der linken Nieren Ader. Legen Sie einen 22-G-Katheter in die Aorta.
   2. Führen Sie eine Thorakotomie, Spannen der thorakalen Aorta mit einer Mikrozangen.
   3. Durchspülen Sie die Spenderleber durch den Katheter in der Aorta mit 20 mL normale Kochsalzlösung enthält 25 U von Heparin (4 ° C) in Höhe von 3 mL/min mit einer Infusionspumpe. In der Zwischenzeit schneiden Sie die untere Hohlvene unten rechts renal Vene erlauben die Perfusion-Lösung fließen aus der Leber.
   4. Transekt SHVC zusammen mit Teil der Membran und IHVC auf der Ebene der linken Nieren Ader als die Spenderleber Bleiche wurde.
10. Das Bindegewebe rund um die PV durch zwei Mikro-Pinzetten zu sezieren. Verbinden Sie und teilen Sie die Pylorus Venen mit einem 8: 0 Prolene Naht. Transekt PV auf der Ebene der Milz Ader. Verbrauchsteuern Sie die Spenderleber und spülen Sie ihn mit kaltem normale Kochsalzlösung. Statt es in eine kalte Saline Bad 4 ° C.

(3) Transplantat Vorbereitung

Hinweis: Alle Verfahren für die Erstellung der Leber Transplantation sind in einem kalten saline Bad bei 4 ° c durchgeführt.

1. Befestigen Sie eine Manschette des Spenders IHVC (Abbildung 3).
   1. Legen Sie die IHVC in die Manschette mit der Manschette-Erweiterung in Richtung der Leberzellkrebs. Positionieren Sie die Manschette Erweiterung an der hinteren Wand des IHVC. Befestigen Sie die Manschette-Erweiterung und die IHVC mit einer gebogenen Mikrozangen selbst befestigt mit einem Datei-Clip mit dem Bad-Behälter.
   2. Evert das distale Ende der IHVC über die Manschette Körper mit zwei Mikro-Pinzetten.
   3. Sichern Sie den Rand mit einer 6-0 Seide Naht. Stellen Sie sicher, dass die IHVC während des Prozesses nicht verdreht ist.
2. Wiederholen Sie Schritt 3.1 auf dem PV des Spenders PV eine Manschette beimessen.
3. Befestigen Sie einen Magnetring des Spenders SHVC (Abbildung 4).
   1. Ziehen Sie die Membran durch die vier Zangen und schneiden Sie die SHVC.
   2. Übergeben Sie die SHVC durch den magnetischen Ring mit der Titan-Legierung Mikro Pinzette.
   3. Evert das distale Ende des die SHVC über den Ring.
   4. Befestigen Sie den Ring mit einer 6-0 Seide Naht. Stellen Sie sicher, dass die SHVC während des Prozesses nicht verdreht ist.
   5. Entfernen Sie die überschüssige Membran um die Leber.
4. Tauchen die Spenderleber in einem kalten normale saline Bad und Lagerung bei 4 ° C.

4. Empfänger Betrieb

Hinweis: Das Schema der Graft Implantation in die Empfänger Ratte ist in Abbildung 5dargestellt.

1. Injizieren Sie Buprenorphin (0,05 mg/kg) subkutan als Analgetikum 1 Stunde vor der Operation. Die Spender-Ratte von Isofluran Inhalation zu betäuben. Verwendung 5 Vol % Isofluran bei einer Durchflussrate von 1,5 L/min in einem Plexiglas-Kasten für die Induktion der Anästhesie und 2 Vol % Isofluran bei einer Durchflussrate 0,6-0,8 L/min auf den Kegel Maske für die Aufrechterhaltung der Narkose.
2. Rasieren Sie die gesamte Bauchhaut der Ratte. Desinfizieren Sie die entsprechenden Haut mit Povidon-Jod-Lösung.
3. Öffnen Sie die Bauchhöhle über einen 4 cm Mittellinie Schnitt. Legen Sie die Bauch Retraktoren. Ziehen Sie die Rippen so weit auseinander wie möglich von der Mittellinie.
4. Spannen Sie und ziehen Sie so in Richtung zum Kopf mit einem blutstillende Zangen. Das Bindegewebe und die Bänder um die Leber zu sezieren. Verbinden Sie und teilen Sie die hepatotoxischen-und Speiseröhrenkrebs Ligament. Verbinden und Teilen der hepatischen Arterie mit einer 8-0 Prolene Naht.
5. Isolieren Sie den Choledochus aus dem ersten hepatische Portal. Legen Sie eine 6-0 Seide Naht um den Choledochus knapp unterhalb seiner Division und verbinden Sie den Choledochus.
6. IHVC unten rechts renal Vene zu sezieren. Verbinden und Teilen der rechten Nebennieren Ader. Legen Sie ein Band in der SHVC der Leber.
7. Klemmen Sie die IHVC oberhalb rechts renal Ader mit kapilläre Clips. Klemmen Sie die PV auf der Ebene der Pylorus Ader mit kapilläre Clips.
   1. Um das Blut aus der Leber zu spülen, Spritzen Sie langsam 2 mL normale Kochsalzlösung durch die PV. Ziehen Sie nach unten die Leber durch den zuvor platzierte Gurt ziehen. Klemmen Sie die SHVC und Teil der Membran mit einer Satinský-Klammer.
   2. Transekt IHVC nahe dem Parenchym und PV an der Porta Hepatis. Verbrauchssteuern der Leberzellkrebs durch die SHVC knapp oberhalb der Leber vor. Entfernen Sie die Empfänger Leber schnell.
8. Befestigen Sie einen Magnetring des Empfängers SHVC.
   1. Ein Magnetring des Empfängers verbleibenden SHVC einfügen.
   2. Befestigen Sie den magnetischen Ring auf eine Satinský Klammer durch magnetische Anziehungskraft.
   3. Die SHVC über den magnetischen Ring Evert, bis das Schiff erstreckt sich der Rand des Ringes.
9. Legen Sie die Spender Leber Transplantation Orthotopically und bedecken Sie es mit einem kalten nassen Gaze.
10. Füllen Sie das Lumen des Spenders und des Empfängers SHVCs mit normalen Kochsalzlösung. Entfernen Sie Luftblasen Vermeidung von Luftembolien gründlich. Beenden Sie den SHVC Wiederaufbau durch die Kopplung der Magnetringe, eingebettet in die des Spenders und des Empfängers SHVC durch Magnetkraft zusammen.
11. Die PV zu rekonstruieren.
    1. Trakt der rechten und linken Zweig der des Empfängers PV durch ein 8: 0 Prolene Faden ziehen um die Spannung der PV beizubehalten.
    2. Bewegen Sie die Klemme des Empfängers PV nach unten aus der Pylorus Vene, die Milz Vene um die Vene vollständig offen zu legen.
    3. Einschneiden der vorderen Wand des Empfängers. Füllen Sie das Lumen der PV mit normalen Kochsalzlösung.
    4. Halten Sie die Manschette Erweiterung des Spenders PV mit einer gebogenen Pinzette.
    5. Legen Sie die Manschette Körper des Spenders PV in des Empfängers PV beim halten der PV-Lumen mit normalen Kochsalzlösung spülen.
    6. Sichern Sie es mit einem umlaufenden Seide Ligatur 6-0. Wiederherstellen Sie die Durchblutung der Leber Transplantat durch Lösen der Klemmen auf der PV und SHVC.
12. Wiederholen Sie Schritt 4.11 auf die IHVC, die IHVC zu rekonstruieren.
13. Der Gallengang durch eine Stent-Technik zu rekonstruieren.
    1. Eine "V" auf der vorderen Wand des Empfängers Hauptgallengang einzuschneiden.
    2. Den Spender-Stent in das Lumen des Empfängers BD und befestigen Sie es mit einer 6-0 Seide umlaufende Naht. Ziehen Sie die Fäden auf die zwei Gallengänge zusammen und binden Sie die Fäden um die BD nahe beieinander zu bringen.
    3. Wickeln Sie Omentum Gewebe um die Anastomosen Website, Galle Leck zu verhindern.
14. Spülen Sie die Bauchhöhle mit warmen normale Kochsalzlösung. Schließen Sie dem Bauch Schnitt in zwei Schichten mit einer durchgehenden 3: 0 nicht resorbierbaren chirurgischen Naht.
15. Verwaltung von 16 mg/kg Cefuroxim (ein Antibiotikum) und 0,05 mg/kg Buprenorphin (Analgetikum) durch subkutane Injektion nach der Operation sofort.
16. Legen Sie die Ratte in einem sauberen Käfig und lassen Sie Speisen und Wasser Ad Libitum.
17. Spritzen Sie Cefuroxim (16 mg/kg) und Buprenorphin (0,05 mg/kg) in die Bauchhöhle alle 12 Stunden für 3 Tage.

Nach ca. 10 versuchen die magnetische Anastomose-Technik für den Wiederaufbau der SHVC erfolgreich ein Forscher meisterten hatte keine vorherige mikrochirurgische Ausbildung. Die Rekonstruktion der SHVC dauerte weniger als 2 Minuten. Die Anhepatic Phase für die Empfänger Ratten war ca. 10 Minuten. Keine Thrombosen, Blutungen oder Angiostegnosis wurde am SHVC Anastomosen Standort 1, 5 und 30 Tage nach Reperfusion beobachtet. Die minderwertigen Vena Cavography wurde in 2 Wochen nach der Transplantation durchgeführt. Wie in Abbildung 6dargestellt, die magnetische Ringe waren intakt, und die Durchblutung war patent durch die SHVC Anastomose. Die nach der Transplantation Überlebensrate betrug 95 % am Tag 1, Tag 3, 90 % und 85 % bei Tage 7 bis 30 (Abbildung 7).

Abbildung 1 : Das Design (A) und (B) Foto von den magnetischen Ring für Anastomose von der SHVC.
SHVC: Suprahepatic Vena Cava.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Die Ärmelbündchen und der Stent für Anastomose IHVC (A), PV (B) und BD (C).
IHVC: Infrahepatic Vena Cava; PV: Pfortader; BD: Gallengang. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Schema der Manschette Anastomose der IHVC und PV. Stecken Sie die IHVC oder PV in einer Manschette (A); Evert das distale Ende des IHVC oder PV über die Manschette Körper mit zwei Mikrozangen (B); Sichern Sie den Rand mit einer 6-0 Seide Naht (C); Legen Sie die Manschette Körper des Spenders IHVC oder PV in IHVC oder PV (D) des Empfängers.
IHVC: Infrahepatic Vena Cava; PV: Pfortader. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Schema der magnetischen Anastomose von der SHVC. Übergeben Sie die SHVC durch einen magnetischen Ring mit Titan-Legierung Mikrozangen (A); Evert das distale Ende des SHVC über den Ring (B); Befestigen Sie den Ring mit einer 6-0 Seide Naht (C). Paar die Magnetringe eingebettet in die des Spenders und des Empfängers SHVC durch Magnetkraft (D) zusammen.
SHVC: Suprahepatic Vena Cava. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Schema der Graft Implantation in die Empfänger Ratte. Rekonstruktion der SHVC: magnetische Anastomose; Rekonstruktion der IHVC und PV: Manschette Anastomose; Rekonstruktion der BD: Stent Anastomose. Rekonstruktion des HA: nicht durchgeführt.
SHVC: Suprahepatic Vena Cava; IHVC: Infrahepatic Vena Cava; PV: Pfortader; BD: Gallengang; HA: hepatische Arterie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 : Minderwertige Vena Cavography der Ratte 2 Wochen nach der Transplantation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7 : Repräsentative überleben Heilung nach der Transplantation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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