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Methoden zur Inszenierung Pupal Perioden und Messung der Flügel Pigmentierung der Drosophila guttifera

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DOI:

10.3791/56935

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24. Januar 2018

 ,  ,  , 
1Graduate School of Science, Kyoto University, 2Graduate School of Science, Osaka City University, 3The Hakubi Center for Advanced Research, Kyoto University, 4Graduate School of Environmental Science, Hokkaido University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Protokolle für die Inszenierung pupal Perioden und Messung der Flügel Pigmentierung der Drosophila Guttifera werden beschrieben. Inszenierung und Quantifizierung der Pigmentierung bieten eine solide Grundlage für das Studium Entwicklungsmechanismen von Erwachsenen Züge und interspezifischen Vergleich der Eigenschaft Entwicklung ermöglichen.

Zusammenfassung

Vielfältige Arten von Drosophila (Fruchtfliege) bieten Möglichkeiten, die Mechanismen der Entwicklung und genetische Veränderungen für evolutionäre Veränderungen verantwortlich zu studieren. Insbesondere ist die adult-Stadium eine reiche Quelle von morphologischen Merkmalen auf interspezifischen Abgleich, einschließlich Flügel Pigmentierung Vergleich. Um Entwicklungsstörungen Unterschiede zwischen den Arten zu studieren, sind detaillierte Beobachtung und entsprechende Inszenierung für präzisen Vergleich erforderlich. Hier beschreiben wir Protokolle für die Inszenierung von pupal Perioden und Quantifizierung der Flügel Pigmentierung eine gepunktete Fruchtfliege Drosophila Guttifera. Zunächst beschreiben wir die Methode für die genaue morphologische Beobachtung und Definition von pupal Stadien basierend auf Morphologien. Diese Methode beinhaltet eine Technik zur Entfernung der Puppenkammer, ist die Radula Außenhülle der Puppe, um detaillierte Beobachtung der pupal Morphologien zu ermöglichen. Zweitens, beschreiben wir die Methode zur Messung der Dauer der definierte pupal Stadien. Schließlich beschreiben wir die Methode zur Quantifizierung der Flügel Pigmentierung basierend auf Bildanalyse mit digitalen Bildern und ImageJ-Software. Mit diesen Methoden können wir eine solide Basis für den Vergleich von Entwicklungsprozessen von Erwachsenen Züge während pupal Stadien feststellen.

Einleitung

Einige der morphologischen Merkmale von Drosophila sind unter Arten1,2,3,4,5breit gefächert. Nähern wir uns der Frage wie morphologische Vielfalt entsteht durch den Vergleich der Mechanismen der Generation diese Morphologien. Beispiele für solche Morphologien sind Larven Trichome, adult Sex Kämme, externe Geschlechtsapparat, Abdominal-Pigmentierung und Flügel Pigmentierung6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. um morphologische Unterschiede zwischen Erwachsenen zu studieren, Beobachtung und Analyse der pupal Stadien sind wichtig, weil das Schicksal der Erwachsenen Züge sich in der späten Larvenstadien richtet und anschließende Morphogenese den pupal Zeitraum geht.

In Studien der Entwicklungsbiologie von Drosophila Melanogaster"Stunden APF" (Stunden nach pupal Bildung) ist die übliche Methode um ein Puppenstadium16anzugeben. Dieses System absoluten Zeit nach pupal Bildung beschäftigt und ist sehr praktisch für routinemäßige Experimente. Allerdings Entwicklungs-Geschwindigkeit abweichen unter Puppen und durch leichte microenvironmental, genetische und epigenetische Unterschiede betroffen sein könnten, und daher mit den gleichen absoluter Zeit nach pupal Bildung garantiert nicht, dass Puppen gleichzeitig sind Entwicklungsstadium. In vielen Fällen sind die Phasen definiert durch morphologische Merkmale für den Vergleich von mehreren Personen vorzuziehen. Vor allem, erfordert ein Vergleich zwischen den Arten präzise Inszenierung und Vergleich unter entsprechenden (homologe) Stufen.

Bainbridge und Bownes17 erkannt 20 pupal Stadien (P1 bis P15(ii)) basierend auf morphologische Merkmale von Drosophila Melanogaster Puppen. Diese Inszenierung ist die am weitesten verbreitete System der morphologischen Entwicklungs-staging-18. In einer früheren Studie führten wir pupal Inszenierung von Drosophila Guttifera , um eine Grundlage für Flügel Pigmentierung Studien19zu schaffen. D. Guttifera hat eine schwarze Polka-Dot Muster auf den Flügeln und gehört der Gattung Modell für Flügel Pigmentierung Bildung20. Obwohl wir den morphologischen Kriterien beschrieben bezeichnet die Bainbridge und Bownes Forschung17, wir direkt gemessen Bühne Dauer durch serielle Beobachtungen19, anstatt Bainbridge und Bownes Schätzung der Bühne Dauer von der beobachteten Frequenz. Hier beschreiben wir die Methode der pupal Inszenierung und Messung der Dauer von pupal Stadien der Drosophila in Fukutomi Et Al19verwendet.

Um den Entwicklungsstörungen Mechanismus der Flügel Pigmentierung zu untersuchen, müssen wir wissen, tritt im pupal oder adulten Stadien die Pigmentierung. Fukutomi Et Al. 19 quantifiziert optische dichten (ODs) der Pigmentierung während pupal und adulten Stadien durch die Bildanalyse Flügel Bilder. Die Pigmentierung von Drosophila Flügel wird gedacht, um durch Ansammlung von schwarzen Melanin21verursacht werden. Für die Quantifizierung der ODs dienten Graustufenbilder und ImageJ Software (https://imagej.nih.gov/ij/)22 . Zu erkennen und quantifizieren die Spot-spezifische Pigmentierung (ΔOD), subtrahieren wir die OD außerhalb ein Spot aus der OD innerhalb einer Stelle. Um diese Methode reproduzierbar und objektiver zu gestalten, sollten die Orte der OD-Messung über Flügel Venen als Wahrzeichen ermittelt werden. In diesem Artikel beschreiben wir ausführlich diese Methode zur Quantifizierung der Flügel Pigmentierung in Drosophila Guttifera.

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Protokoll

1. Lager fliegen

  1. Verwenden Sie Drosophila Guttifera für alle der folgenden Protokolle.
  2. Kunststoff-Fläschchen verwendet werden (Durchmesser 25 mm x Höhe 96 mm) und Zellulose-Stecker (Durchmesser 23 mm x Höhe 26 mm) für die Bestandspflege. Verwenden Sie ein standard Maismehl, Zucker, Hefe, Agar Essen und folgen einer Publikation beschrieben drei andere alternative Rezepte für diese Arten2.
    Hinweis: D. Guttifera (Lagernummer 15130-1971.10) bietet der Drosophila-Arten Stock Center an der University of California, San Diego. Obwohl D. Guttifera zu den Immigrans-Tripunctata Strahlung innerhalb der Gattung23entfernt, D. Melanogaster verwandt ist gehört, hat es viele biologische Eigenschaften gemein D. melanogaster . Dementsprechend kann dieses Protokoll für viele Arten von Drosophila , angewendet werden, obwohl einige Arten erfordern bestimmte Lebensmittel oder technische Tipps zu2gewährleisten.

(2) die Beobachtung der Puppe und Definition von pupal Stadien

Hinweis: Die Puppe für die Beobachtung stammt aus der Fliege bestand gepflegt mit einem 12:12 h hell/dunkel-Zyklus bei 25 ° C. Bainbridge und Bownes17 beschrieben ein geringes Risiko der Bewegung D. Melanogaster Puppen vom ursprünglichen Ort der Verpuppung auf ein Stück feuchtes Seidenpapier (97 % Überleben von 946 zog Puppen). D. Guttifera Puppen können durch im Wesentlichen die gleiche Methode hergestellt werden.

  1. Legen Sie gesunde Erwachsene von Drosophila auf frische Nahrung (standard Maismehl, Zucker, Hefe, Agar) in einer Durchstechflasche aus Kunststoff (Durchmesser 25 mm x Höhe 96 mm) und lassen sie die Eier. Warten Sie 7 Tage, um späten 3. Larvenstadien zu erhalten.
  2. Setzen Sie 1 mL der standard Maismehl, Zucker, Hefe, Agar Essen in jeder 1,5 mL Reaktionscup. Machen Sie 3 Löcher mit 2 mm Abstand in den Deckeln von Mikroröhrchen dringt mit einer Push-Pin um Atmung zu ermöglichen.
  3. Zentrifugieren der Mikroröhrchen mit Essen für 7 s in einem Mini Microcentrifuge (860 X g).
  4. Umkehren Sie, und tippen Sie auf Fläschchen um alle Erwachsenen aus der Durchstechflasche zu entfernen.
  5. Gießen Sie 5-10 mL DdH2O (oder reverse Osmose-Wasser) in die Flasche.
  6. Gießen Sie Larven mit Wasser in einem Kunststoff Petrischale (Durchmesser 90 mm x Höhe 15 mm). Ende 3. Larvenstadien durch ihre große Körpergröße (ca. 3-4 mm in der Länge) identifizieren.
  7. Sanft bewegen späten 3. Instar Larven mit der Pinzette in die Mikroröhrchen mit Lebensmitteln (10 Larven / Reaktionscup). Brüten sie über Nacht bei 25 ° C.
  8. Verschieben der neugeformte Puppen auf ein Stück Seidenpapier, die durch DdH2O befeuchtet und in einem Kunststoff Petrischale gelegt wurde (Durchmesser 35 mm x Höhe 10 mm).
  9. Platzieren Sie der Petrischale in eine feuchte Kammer (mit 10 mL DdH2O unten), und warten Sie, bis die Puppen auf die gewünschte Stufe zu entwickeln.
  10. Puppen auf ein feuchtes Stück Seidenpapier in einem Kunststoff-Petrischale zu bewegen (Durchmesser 60 mm x Höhe 15 mm).
    Hinweis: Die Definition der Phasen kann meist basierend auf den Bühnen von D. Melanogaster17erfolgen. In der Regel kann die pupal Zeitraum von Drosophila in P1 - P15(ii), eingeteilt werden, wenngleich einige Änderungen der Bühne Definition abhängig von der Sorte verwendet werden würde. Wenn möglich, ermöglicht entfernen der Puppenkammer präzise und detaillierte Beobachtung. Details siehe unten (Schritt 3).
  11. Puppen unter dem Stereo-Mikroskop zu beobachten. Fotografieren Sie mit einer digitalen Kamera angeschlossen an das Stereo-Mikroskop.

3. entfernen Puppenkammer

Hinweis: Puppen von Drosophila sind durch eine Struktur namens der Puppenkammer abgedeckt. Ein Insekt von Muscomorpha (fliegen) HAART nicht seine Larven Kutikula zur Verpuppung; Stattdessen, es härtet die Nagelhaut nach Apolysis und verwendet es als eine Schutzhülle für die Puppe, die Puppenkammer24. Eine Puppe, die ihren Wohnsitz in einer Puppenkammer hat eine wahre pupal Kutikula, die sehr weich und zerbrechlich ist. Bevor Apolysis um P4(ii) stattfindet, Epithelien und Puppenkammer hängen zusammen, und daher entfernen der Puppenkammer ohne Beschädigung ist sehr schwierig. Nach P5 ist das Entfernen der Puppenkammer mühsam, aber nützlich für die morphologische Beobachtung und Definition von pupal Stadien. Der Prozess wird wie folgt durchgeführt.

  1. Befestigen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einem Stück Küchenpapier.
  2. Legen Sie eine Puppe auf der Doppel-Klebeband ventralen Seite nach oben (Abb. 1A).
  3. Suchen Sie den Abstand zwischen der vorderen Seite der Puppenkammer und die interne Puppe. Erfassen der Puppenkammer um diese Lücke mit Pinzette entfernen und Aussetzen der vorderen Seite des Leiters der Puppe.
  4. Stecken Sie die Spitze von einer Pinzette, indem Sie es parallel zu der anterior-posterioren Achse verschieben. Heben Sie die Spitze der Zange, die Puppenkammer lokal zu brechen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der Bruch den hinteren Teil der Puppenkammer erreicht. Stellen Sie sicher, dass eine Lücke zwischen der Puppenkammer und pupal Beine, auch gebildet wird und brechen der Bauchseite der Puppenkammer und minimieren die Schäden an den internen Puppe (Abbildung 1 b).
  5. Nehmen Sie nach dem Bruch der Puppenkammer so weit wie möglich die Puppe mit einem feinen Pinsel (#5/0) (Abbildung 1).
  6. Legen Sie die Puppe auf ein Stück Seidenpapier, die mit DdH2O angefeuchtet und in einem Kunststoff Petrischale gelegt wurde (Durchmesser 60 mm x Höhe 15 mm). Fotografieren Sie so bald wie möglich weil die exponierten Puppe anfällig ist und wird leicht trocken.
    Hinweis: Puppen ohne eine Puppenkammer eignen sich nicht zur Messung der Dauer der pupal Perioden (Schritt 4), weil Stress (z. B. Austrocknung) und physischen Schaden könnte stören die normale Entwicklung.

4. Messung der Dauer von pupal Stadien

  1. Bereiten Sie Puppen zur Messung der Dauer von pupal Stadien wie in Schritt2 beschrieben. Sammeln Sie Puppen von 1-2, 2-3 und 3-4 Tage nach pupal Bildung (20 Puppen). Geben Sie einzelnen Identifikations-Nummern (1-60) Puppen zur Identifikation. Weiterhin neu sammeln Puppen während der folgenden Schritte aus, um 20 weitere junge Puppen zu erhalten gebildet. Die neu gebildeten Puppen individuellen Identifikationsnummern (61-80) verleihen. Legen Sie eine Puppe auf ein Stück von DdH2O angefeuchtet Tissue-Papier in einen Brunnen (3,9 cm2) von einer 12-Well Kultur Zellplatte (1 Puppe/Brunnen, 12 Puppen/Platte). Füllen Sie den Inter gut Raum der Platten mit DdH2O, Luftfeuchtigkeit zu erhalten, setzen Sie den Deckel auf und legen die Platten in 25 ° C, Dauerlicht (24:0 h hell/dunkel) Bedingungen.
    Hinweis: Puppen ohne eine Puppenkammer eignen sich nicht zur Messung der Dauer der pupal Perioden. Bitte entfernen Sie nicht die Puppenkammer.
  2. Morphologische Eigenschaften einschließlich Körperfarbe, Borsten, Malpighian Tubuli und Gelbkörper alle Puppen, sobald alle 30 min und Datensatz Phasen beobachtet (P1 - P15(ii), basierend auf der Referenzen-17,-19) in eine Strichliste zu beobachten.
  3. Weiter über vier Tage lang (96 h) durch eine rotierende Verschiebung von drei (oder mehr) Personen aufnehmen.
  4. Zählen der Anzahl von Datensätzen für jede einzelne Phase, und sie im Durchschnitt (durchschnittliche Anzahl von Beobachtungen / Puppen). Dann multiplizieren Sie sie mit 0,5 (h), wodurch die geschätzte Länge der Etappen (h).

5. Messung der Intensität der schwarzen Flecken auf einem Flügel

Hinweis: Die Intensität der schwarzen Flecken auf einem Flügel pupal oder Erwachsenen kann durch Messung der optischen Dichte (OD) quantifiziert werden. Ein Glasfilter mit bekannten ODs (gestufte Dichte Filter) dient zur Kalibrierung25, damit man die OD eines bestimmten Bereichs von einem digitalen Bild eines Flügels berechnen kann. OD in einem Ort und die OD außerhalb der Stelle gemessen, und letztere wird abgezogen, aus dem ehemaligen, die Intensität des Spots (ΔOD) zu erhalten. Hier beschreiben wir die Methode der Dissektion, Messung und Berechnung von ΔOD. Dieses Verfahren kann nach Schritt2, unabhängig von Schritt 3 und Schritt 4 durchgeführt werden. Sobald man Schritt2 ausgeführt hat und alle pupal Stadien versteht, können direkt starten oder wiederholen Sie Schritt 5.

  1. Bild-Vorbereitung
    1. Bereiten Sie eine neue Puppe eine fokale Phase, wie in Schritt2 beschrieben. Entfernen Sie den vorderen Teil einer Puppenkammer mit der Pinzette. Entnehmen Sie die Puppe mit Pinzette und legen es in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, Tabelle 2) in einem Kunststoff-Petrischale (Durchmesser 35 mm x Höhe 10 mm).
    2. Schneiden Sie das Grundgelenk eines Flügels (Grundgelenk ist der schmale proximalen Teil des Flügels). Wie die Flügel gefaltet ist, legen Sie sie in einem Kunststoff-Petrischale (Durchmesser 35 mm x Höhe 10 mm) gefüllt mit DdH2O, durch osmotischen Druck (die Flügel entfaltet sich von selbst) zu verlängern.
    3. Sammeln Sie neu geschlüpften Erwachsene einmal alle 10 Minuten von einem Lager Fläschchen. Betäuben Sie eine Fliege mit CO2 mit einem CO2 betäubende Pad zu, bestätigen Sie Anesthetization durch Immobilität und schneiden Sie das Grundgelenk eines Flügels.
    4. Platz 10 µL PBS auf einen Glasobjektträger legen die Flügel gibt, und mit einem Deckglas (18 x 18 mm).
    5. Schalten Sie das Licht des Stereomikroskops. Legen Sie das Licht bei maximalem Niveau sein. Setzen Sie das Objektiv 11,5 X. Legen Sie die Membran der offenste Staat. Schalten Sie die Kamera ein. Stellen Sie die Kamera sein (ISO: 100, Modus SHQ 3136 x 2352 Pixel, Verschlusszeit: 1/20 s). Konzentrieren Sie sich auf die Probe durch verschieben den Fokusknopf des Mikroskops.
    6. Drücken Sie den Auslöser an der Fernbedienung, um das Bild aufzunehmen. Nehmen Sie 3 Bilder pro Flügel, von denen jeder eine Campaniform Sensillum, längs-Ader vor Ort oder posterior Crossvein, Positionierung der distale Teil des Flügels auf der linken Seite und den vorderen Teil des Flügels auf der oberen Seite zentriert werden muss.
  2. Kalibrierung
    1. Nehmen Sie Bilder von 9 Teile eines abgestuften Dichte-Filters mit der gleichen Kameraeinstellungen verwendet, um die Flügel-Bild zu erhalten.
    2. ImageJ Software (https://imagej.nih.gov/ij/)22zu initiieren.
    3. Klicken Sie -Datei | Offenen | und wählen Sie eines der Bilder der abgestuften Dichte Filter.
    4. Klicken Sie auf Bild | Typ | 8-Bit | um das Bild in einem 8-Bit-Bild umzuwandeln.
    5. Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Geben Sie | und Oval und zentriert Spalte zu überprüfen. Schreiben Sie 100 (Pixel) in Breite Spalte, 100 (Pixel) in Höhe Spalte, 1568 in Spalte X koordinieren und 1176 in Spalte Y zu koordinieren . Klicken Sie auf "OK".
    6. Klicken Sie auf analysieren | Maßnahme |. Die "mittlere Grauwert" ausgewählte Bereiche werden gemessen.
    7. Wiederholen Sie 5.2.3. auf 5.2.6. für die 8 verbleibenden Bilder.
    8. Klicken Sie auf analysieren | Kalibrieren Rodbard25 in Funktion Spalte auswählen und schreiben Sie die folgende Nummer in der rechten Spalte in der Mitte (0,04, 0.336, 0.632, 0.928, 1.224, 1.52, 1.816, 2.112, 2.408; diese Zahlen hängen die Dichte der trat Dichte Filter).
    9. Überprüfen Sie globale Kalibrierung Spalte, und klicken Sie auf "OK".
      Hinweis: Durch dieses Verfahren durchführen, "meint Grauwert" werden in "optische Dichte (OD)" mit der Rodbard Funktion konvertiert. Nach diesem Schritt kann die optische Dichte für einen bestimmten ausgewählten Bereich in ImageJ-Software berechnet werden.
  3. Wahl der Messungen
    Hinweis: Flecken sind in der Regel verbunden mit Sehenswürdigkeiten wie dem Campaniform Sensillen, längs-Ader Tipps und Crossveins. Diese und andere Sehenswürdigkeiten auf einem Flügel lässt sich die Region von Messungen auswählen. Hier ein Beispiel inD. guttifera(Abbildung 2) wird beschrieben.
    1. Definition von Punkt A, Campaniform Sensillum Ort.
      1. Öffnen Sie ein Bild, in dem ein Campaniform Sensillum Fleck in der Mitte des Bildes ist. Klicken Sie auf Bild | Typ | 8-Bit | um das Bild in einem 8-Bit-Bild umzuwandeln.
      2. Klicken Sie auf Rechteck im Bereich Auswahlwerkzeuge und zeichnen Sie ein Rechteck. Stellen Sie den oberen linken Eckpunkt des Rechtecks so ein, dass es von einem Campaniform Sensillum Fleck an der hinteren Linie der dritte längs-Ader und mehr distalen ist. Stellen Sie der rechten Seite des Rechtecks so ein, dass es sich auf der rechten Seite der Campaniform Sensillum vor Ort befindet.
      3. Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Manager hinzufügen |. Überprüfen Sie Alle anzeigen -Spalte.
      4. Klicken Sie auf Winkel Werkzeug in Linie Auswahlwerkzeuge. Zeichnen Sie die erste Zeile auf der hinteren Linie der dritte längs-Ader. Legen Sie den linken Endpunkte der Linie auf den Scheitelpunkt des Rechtecks in Schritt 1 erstellt. Zeichnen Sie die zweite Linie, auf der oberen Seite des Rechtecks. Taste "m" drücken, um den Winkel zwischen zwei Linien, die in diesem Schritt messen. Klicken Sie auf das Fenster des Bildes auf dem Bildschirm des Computers.
      5. Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Manager hinzufügen |.
      6. Klicken Sie auf Rechteck im Bereich Auswahlwerkzeuge und zeichnen Sie ein Rechteck von etwa 1/9 die Größe des Bildfensters. Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Drehen |. Schreiben Sie die Minusgrade des Winkels in Schritt 5.3.1.4 gemessen. im Winkel Spalte und klicken Sie auf "OK" , um das Rechteck gezeichnet in diesem Schritt drehen.
      7. Bewegen Sie das Rechteck in Schritt 5.3.1.6 gezeichnet. mit Hilfe der Pfeiltasten. Legen Sie den Endpunkt der hinteren Linie der zweiten längs-Ader auf der linken Seite des Rechtecks und die untere Seite des Rechtecks an der hinteren Linie der dritte längs-Ader angeschlossen. Bestätigen Sie, dass eine senkrechte Linie vom Endpunkt der zweiten längs-Ader an der hinteren Linie der dritte längs-Ader in diesem Verfahren erstellt wird. Definieren Sie den Fuß der senkrechten Linie als Punkt A (Abbildung 2A).
      8. Notieren Sie die X-Koordinate und die y-Koordinate von Punkt A, unten Bereich Auswahlwerkzeuge angegeben, bei der Platzierung des Cursors auf Punkt A.
    2. Definition von Punkt B, längs-Ader Tipp vor Ort
      1. Öffnen Sie ein Bild, in dem eine längs-Ader Spitze Spot in der Mitte des Bildes ist. Klicken Sie auf Bild | Typ | 8-Bit | , das Bild in einem 8-Bit-Bild umzuwandeln.
      2. Wiederholen Sie den Vorgang im Schritt 5.3.1 beschrieben. (Definition von Punkt A, Campaniform Sensillum vor Ort), Punkt A im Bild zu finden.
      3. Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Manager hinzufügen |.
      4. Klicken Sie auf Rechteck im Bereich Auswahlwerkzeuge und zeichnen Sie ein Rechteck. Legen Sie den oberen linken Eckpunkt des Rechtecks am Endpunkt der hinteren Linie der dritte längs-Ader.
      5. Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Manager hinzufügen |.
      6. Klicken Sie auf Winkel Werkzeug in Linie Auswahlwerkzeuge. Zeichnen Sie die erste Linie um Punkt A und den Endpunkt der hinteren Linie der dritte längs-Ader zu verbinden. Definieren Sie diese Linie als Linie A. zeichnen die zweite Zeile auf der oberen Seite des Rechtecks in Schritt 5.3.2.4 gezeichnet. Taste "m" drücken, um den Winkel zwischen den beiden Linien zu messen.
      7. Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Manager hinzufügen |.
      8. Klicken Sie auf Rechteck im Bereich Auswahlwerkzeuge und zeichnen Sie ein Rechteck von etwa 1/9 die Größe des Bildfensters. Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Drehen |. Schreiben Sie die Minusgrade des Winkels in Schritt 5.3.2.6 gemessen. im Winkel Spalte und klicken Sie auf "OK" , um das Rechteck gezeichnet in diesem Schritt drehen. Bewegen Sie das Rechteck mit den Pfeiltasten. Stellen Sie die obere Seite des Rechtecks so ein, dass er mit Linie A und der Endpunkt der vorderen Linie der vierten längs-Ader verbunden ist, so dass es auf der linken Seite des Rechtecks.
      9. Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Manager hinzufügen |.
      10. Klicken Sie auf Rechteck im Bereich Auswahlwerkzeuge und zeichnen Sie ein Rechteck von etwa 1/9 die Größe des Bildfensters. Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Drehen |. Schreiben Sie die Minusgrade des Winkels gemessen in Schritt 6 in Winkel Spalte und klicken Sie auf "OK" um das Rechteck gezeichnet in diesem Schritt zu drehen. Bewegen Sie das Rechteck mit den Pfeiltasten. Die unteren linken Eckpunkt des Rechtecks so einstellen, dass es am oberen linken Eckpunkt des Rechtecks in Schritt 5.3.2.8 gezeichnet ist., was bei der Beschaffung der senkrechten Linie vom Endpunkt der vorderen Linie der vierten längs-Ader Linie A. definieren die Schnittpunkt der senkrechten Linie und der hinteren Linie der dritte längs-Ader als Punkt B (Abb. 2 b).
      11. Notieren Sie die X-Koordinate und die y-Koordinate von Punkt B, unten Bereich Auswahlwerkzeuge angegeben, bei der Platzierung des Cursors auf Punkt B.
    3. Definition der Punkt C, hintere Crossvein vor Ort
      1. Öffnen Sie ein Bild, in dem eine posteriore Crossvein Fleck in der Mitte des Bildes ist. Klicken Sie auf Bild | Typ | 8-Bit | , das Bild in einem 8-Bit-Bild umzuwandeln.
      2. Definieren Sie Punkt C als der hinteren Punkt der vorderen Linie von der vierten längs-Ader im Knotenpunktbereich der hinteren Crossvein und die vierte längs-Ader (Abbildung 2).
      3. Notieren Sie die X-Koordinate und die y-Koordinate der Punkt C, unten Bereich Auswahlwerkzeuge angegeben, bei der Platzierung des Cursors auf Punkt C.
    4. Definition von Punkt D, Regelzone
      1. Öffnen Sie ein Bild, in dem ein Campaniform Sensillum Fleck in der Mitte des Bildes ist. Klicken Sie auf Bild | Typ | 8-Bit | um das Bild in einem 8-Bit-Bild umzuwandeln.
      2. Klicken Sie auf gerade Linie Auswahlwerkzeuge und zeichnen Sie eine Linie verbindet den Endpunkt der vorderen Linie der zweiten längs-Ader und den Endpunkt der hinteren Linie der vierten längs-Ader. Definieren Sie Punkt D als Kreuzungspunkt von dieser Linie und der hinteren Linie der dritte längs-Ader (Abb. 2D).
      3. Notieren Sie die X-Koordinate und die y-Koordinate der Punkt D, unten Bereich Auswahlwerkzeuge angegeben, bei der Platzierung des Cursors auf Punkt D.
  4. Messungen
    1. Öffnen Sie eines der Bilder der Flügel-Spots (für Messung von Punkt A, öffnen Sie das Bild mit Punkt A in der Mitte). Klicken Sie auf Bild | Typ | 8-Bit | um das Bild in einem 8-Bit-Bild umzuwandeln.
    2. Klicken Sie auf Rechteck im Bereich Auswahlwerkzeuge und zeichnen Sie ein Rechteck von etwa 1/9 Größe des Bildfensters.
    3. Klicken Sie auf Bearbeiten | Auswahl | Geben Sie |. Oval und zentriert Spalte zu überprüfen. 100 (Pixel) in Höhe und Breite Spalten zu schreiben, schreiben Sie die X-Koordinaten von Punkt A (oder Buchstabe B oder Buchstabe C) und in Spalte X koordinieren und schreiben die y Koordinaten von Punkt A (oder Punkt B oder Buchstabe C) und D in Spalte Y zu koordinieren . Klicken Sie auf "OK".
    4. Klicken Sie auf analysieren | Maßnahme |. Wenn die Kalibrierung in 5.2 beschrieben bereits abgeschlossen hat, sind ODs in Meine Spalte angegeben.
    5. ΔODs durch Subtrahieren OD von Punkt D von ODs der Punkte A, B und c berechnen
      Hinweis: Punkt D befindet sich in einer durchsichtigen Teil des Flügels und beinhaltet keine Pigmentierung und eignet sich somit für ein Hintergrund-Steuerelement.

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Ergebnisse

Die pupal Zeitraum von D. Guttifera gliedert sich in 17 Stufen (P1 - P15(ii), Bilder von drei Vertreter, die Phasen (P1, P5 - 6, P10) gezeigt werden, Abbildung 3und alle 17 Stufen sind in Abbildung 4dargestellt). Obwohl Bainbridge und Bownes17 20 Etappen in D. Melanogastererkannt, könnten einige dieser Phasen nicht auf D. Guttiferaangewendet werden. Die Reihenfolge der beiden ent...

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Diskussion

Wir beschreiben hier die Protokolle für die Definition von pupal Stadien entfernen der Puppenkammer für detaillierte Beobachtung, Messung der Dauer von pupal Stadien und Messung der Intensität der schwarzen Flecken auf einem Flügel in D. Guttifera. Diese Protokolle können viele Drosophila beantragt werden und im Zusammenhang mit Fliege Arten, vor allem mit Flügel Pigmentierung.

Eingehende Beobachtung und Beschreibung der detailliertere entwicklungspolitische Veranstaltungen k...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir danken Sean B. Carroll und Thomas Werner für die Bereitstellung von fliegen Bestände, Naoyuki Sicherung für Ausrüstung, Byung Seok Jin für seine Hilfe bei Dreharbeiten, Kiyokazu Agata für mentoring und Elizabeth Nakajima zur englischen Bearbeitung. Diese Arbeit wurde durch KAKENHI unterstützt 17K 19427 und Takeda Science Foundation.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Drosophila guttiferaThe Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego15130-1971.10Drosophila guttifera, eine Fruchtfliegenart, die in diesem Artikel verwendet
KunststofffläschchenHightechMKC-30Kunststofffläschchen für die Pflege von Fliegenvorräten
Buzz Plugs Fläschchen und Flaschenverschlüsse für GlasfläschchenFisher ScientificAS-271Zellulosestopfen, für die Pflege von Fliegenbeständen
Weißer WeichzuckerMitsui ZuckerJ-500gWeißer Weichzucker, für Standard-Maismehl/Zucker/Hefe/Agar-Lebensmittel
MaismehlNippon Flour MillsFMaismehl, für Standard-Maismehl/Zucker/Hefe/Agar-Lebensmittel
Maisgrieß - CNippon MehlmühlenGCMaisgrieß - C, für Standard-Maismehl/Zucker/Hefe/Agar-Lebensmittel
Agar-PulverMatsuki Kanten SangyoNo.602Agar Pulver, für Standard Maismehl/Zucker/Hefe/Agar Lebensmittel
Trockene BierhefeAsahi Food & GesundheitswesenY2ABiertrockenhefe für Standard-Maismehl/Zucker/Hefe/Agar-Lebensmittel
Butyl-p-HydroxybenzoatNacalai Tesque06327-02Butyl-p-hydroxybenzoat, für Standard-Maismehl/Zucker/Hefe/Agar-Lebensmittel
EthanolWako057-00456Ethanol, für Standard-Maismehl/Zucker/Hefe/Agar-Lebensmittel
Mikroröhrchen mit flachem BodenIna OpticaCF-01501,5 mL Mikroröhrchen, für Puppensammlung
CAPSULEFUGETomyPMC-060Mini-Mikrozentrifuge, zum Sammeln von Puppen
Sterilisierte Schale NBSansei Medical01-013Petrischale aus Kunststoff (Durchmesser 90 mm x Höhe 15 mm)
SerumröhrchengestellIwaki9796-050Wird als Feuchtkammer verwendet, für die Beobachtung von Puppen
Corning Falcon Easy-Grip GewebekulturschaleCorning353001Petrischale aus Kunststoff (Durchmesser 35 mm x Höhe 10 mm)
Falcon Standard-GewebekulturschaleCorning353002Petrischale aus Kunststoff (Durchmesser 60 mm x Höhe 15 mm)
StecknadelKokuyo51233709Stecknadel zum Bohren von Nadellöchern auf dem Deckel des Mikroröhrchens
StereomikroskopOlympusSZX16Stereomikroskop für die morphologische Beobachtung
DigitalkameraOlympusDSE-330-ADigitalkamera, für die Bildgebung
NICETACK doppelseitiges KlebebandNichibanNW-15SFDoppelseitiges Klebeband, zum Entfernen von Puppen
Dumont #5 Pinzetten FineScience Tools11252-20Pinzette, zum Entfernen von Puppen
Van Gogh VISUAL PinselTalens JapanGWVR-#5/0Pinsel, zum Entfernen von Puppen
Greiner CELLSTAR 12 Well ZellkulturplatteMerck665-18012-Well-Zellkulturplatte, zur Messung der Duration der Puppenperiode
NaClWako191-01665NaCl, für PBS
KClNacalai Tesque285-14KCl, für PBS
Na2HPO4· 12H2OWako196-02835Na2HPO4· 12H2O, für PBS
KH2PO4Nacalai Tesque28721-55KH2PO4, für PBS
Stufen-Neutraldichtefilter (ND) 0,04 - 3,0Edmund Optics64-384Stufendichtefilter, zur Kalibrierung der Pigmentierungsmessung
ImageJ SoftwareNIH1.8.0-101ImageJ Software, zur Messung der Intensität von schwarzen Flecken auf einem Flügel (https://imagej.nih.gov)
FINE FROST ObjektträgerMatsunami Glas IndFF-001Objektträger, zur Messung der Intensität von schwarzen Flecken auf einem Flügel
Quadratisches Mikroskop Deckglas 18 x 18Matsunami Glas IndC018181Deckglas, zur Messung der Intensität von schwarzen Flecken auf einem Flügel
wird

Referenzen

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