Charakterisierung von Tumorzellen mit einem medizinischen Draht zur Erfassung von zirkulierenden Tumorzellen: 3D Ansatz basierend auf Immunfluoreszenz und DNA-Fisch

CTC repräsentieren einen wichtigen Schritt der Krebs Zelle Verbreitung¹. Ihre Anwesenheit im peripheren Blut des Patienten ist (metastatische) Rezidiv und Krankheit Fortschreiten^2,3zugeordnet. CTC-Isolierung und Charakterisierung aus dem Blut von Krebspatienten ist eine Art von nicht-invasiven Flüssigbiopsie. In den letzten Jahren immer deutlicher geworden, dass die Überwachung von Fortschritt und Reaktion der Tumoren auf verschiedene Behandlungen, die mit dieser Art von Analyse liefert wichtige klinische Informationen^4,5. Flüssigbiopsie ist noch nützlicher, wenn Chirurgie nicht möglich ist oder wenn die primären Tumorgewebe nicht verfügbar, ist alsofür nicht-Biopsiable Läsionen. Daher ist dieser Ansatz vielversprechend in bestimmten Krebs-Einstellungen wie metastasiertem NSCLC, wo die Anwesenheit von CTCs nachgewiesen wurde eine negative prognostische Rolle⁶haben. NSCLC ist ein Tumor, der profitiert vor allem von zielgerichtete Therapieansätze^7,8,9 entwickelt, um auf bestimmte Moleküle (molekulare Targets) bekannt, in dem Wachstum, Fortschritt, einbezogen zu handeln und Ausbreitung der Krankheit. Daher ist die Erkennung von spezifischen Ziele während der Progression der Erkrankung erforderlich. CTC-Untersuchung ist eine äußerst interessante diagnostischen Ansatz zu erkennen und zu überwachen Drogeziele ohne die Notwendigkeit einer primären oder metastatischen Gewebes. Beispielsweise ist die Erkennung von ALK-gen Translokationen in NSCLC Zellen mit Sensibilität für Crizotinib, eine spezifische gezielte Therapie¹⁰verbunden. Allerdings ist die Erkennung von ALK Translokationen derzeit nur auf fein-Nadel-Aspiraten oder kleinen Biopsien ausgeführt; Infolgedessen ist ohne einen Tumor Gewebe ALK Analyse nicht möglich. CTC sind eine mögliche Alternative zu Tumor Gewebe-basierte Untersuchungen und stellen einen vielversprechenden Begleiter diagnostischen Ansatz dar.

Trotz ihrer potenziellen Bedeutung unterliegen CTCs noch eine große Debatte unter Forschung, vor allem wegen ihrer Seltenheit (1-10 Zellen/mL peripherem Blut¹¹). Aktuelle flüssigen Biopsie-Methoden verwenden eine begrenzte Menge an Blut (d.h., 1-30 mL)^12,13, aber dadurch entsteht eine Situation der suboptimalen Sensitivität für den Nachweis von CTCs. daher, Forschung ist gerechtfertigt, um die Feststellung Ansätze und entwickelnden Geräte flüssigen Biopsien CTC gezielt auf ein größeres Volumen des peripheren Blutes durchführen.

Ein alternatives Gerät, einen funktionalisierten medizinische Draht (siehe Tabelle der Materialien), wurde entwickelt, um Blut Probenahme Grenzen zu überwinden und eine repräsentative Analyse der CTC erhalten. Dieser funktionalisierten Draht ist eine CE-Zulassung medizinisches Gerät, das direkt aus dem Blutkreislauf des Krebs Patienten¹CTCs erfasst. Mit einer 2-cm-langen funktionalisierten Spitze beschichtet mit einer 0,2 µm dicke Schicht aus Gold besteht aus einem 16 cm lange Edelstahl-Draht (Abbildung 1a). Die Schicht wird wiederum durch eine 1 bis 5 µm dicken Polycarboxylatether Hydrogel Schicht kovalent verbunden mit Antikörper gegen EpCAM, eines der am häufigsten exprimierten Antigene auf der Oberfläche des CTC¹⁴abgedeckt. Die funktionalisierten Spitze des Drahtes wird in eine Vene des Arms des Patienten eingeführt und bleibt in Position für mindestens 30 Minuten. Dieser Ansatz ermöglicht Isolation von CTCs in-vivo, direkt im peripheren Blut und Bildschirm etwa 1,5-3,0 L Blut (ca. 300-fold mehr als das Volumen für alternative Ansätze verwendet)¹.

Pantel Et Al. demonstriert die Wirksamkeit dieses Ansatzes CTCs direkt in die Arm-Venen der Lunge-Krebs-Patienten-¹⁵zu isolieren. Sie führten Draht Immunfluoreszenz Färbung CTCs mit herkömmlichen Antikörper gegen EpCAM und Pan-Cytokeratin und CD45 für äußerst Erkennung identifizieren. Der Draht wurde unter eine optische Fluoreszenz-Mikroskop-¹⁵untersucht. Die Autoren zeigten, dass das Gerät in der Lage war, CTCs zu isolieren, aber sie keine Therapie-bezogenen Ziele, wie ALK Translokationen untersuchen.

Die vorgestellte Methode soll vermeintliche CTCs in NSCLC-Zell-Linien auf der Grundlage der phänotypischen Parameter, z.B., EpCAM Positivität und das Vorhandensein von molekularen Biomarker, zum Beispiel den ALK-Status (Abbildung 1 b) zu ermitteln. Dieses 3-Tages-langen Verfahren kombiniert einen funktionalisierten Draht und Immunfluoreszenz-Färbung mit DNA-Fluoreszenz -in-Situ-Hybridisierung (DNA-Fisch), Immuno-DNA-Fisch benannt. Da die CTCs seltene Entitäten sind, ist der Vorteil dieses Protokolls, dass auf dem gleichen Draht in Bezug auf Immunophenotypic Funktionen und DNA Rearrangements CTCs charakterisiert werden können.

1. Immuno-DNA Fisch auf einem 2D Deckgläschen

1. Deckglas Vorbereitung und anhaftende Zelle Aussaat
   Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte unter einem laminar-Flow-Haube unter sterilen Bedingungen.
   1. Tauchen Sie das Deckglas in 100 % igem Ethanol um sie zu desinfizieren.
      Hinweis: Wir verwenden 12 mm × 12 mm Silikon-gestützten quadrierten Deckgläsern (alle Reagenzien sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt).
   2. Platzieren Sie die Deckgläsern in einer Petrischale (100 mm Durchmesser). Trocken mit gezwungen Luftstrom für 5 Minuten.
   3. Waschen der Petrischale mit 15 mL steril 1 × Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
   4. Waschen Sie die Petrischale mit 10 mL der kompletten Medium (siehe Tabelle 1).
   5. Seed adhärente Zellen (etwa 1.650.000 Zellen in 10 mL Medium, gezählt von FACS-Analyse) durch sanft Fallenlassen der Zellsuspension auf der Petrischale, einheitliche Zelle Beschichtung (ca. 30.000 Zellen/cm²) zu erhalten.
      Hinweis: Bei ~ 70 % Zusammenströmen, adhärenten Zellen auf Deckgläsern für mindestens 48 Stunden kultiviert werden sollten.
2. Fixierung und Permeabilisierung
   Achtung: Aceton ist eine brennbare und irritierend flüchtige Substanz. Verwenden Sie nur Aceton-resistenten Kunststoff oder Glasbehälter (kein PVC oder PVDF).
   Hinweis: Führen Sie diese Schritte unter einem chemischen Abzug.
   1. Entfernen Sie das Kulturmedium mit einem Einweg-Absaugnadeln pipettieren.
   2. Waschen Sie die Petrischale mit 1 × PBS.
   3. Mit einer Pinzette, waschen Sie die Deckgläsern durch Eintauchen in ein Becherglas mit 5 mL 1 × PBS.
   4. Trocknen Sie die Deckgläsern auf Löschpapier.
   5. Befestigen Sie die Zellen auf dem Deckglas durch Eintauchen in eine 100 %-Aceton-Lösung für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
   6. Entfernen Sie das Deckglas mit einer Pinzette. Trocknen Sie Deckglas mit eine erzwungene Luftströmung für 5 min.
      Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden. Das Deckglas sollte bei-20 ° c gelagert werden
3. Immunfluoreszenz-Tag 1
   Hinweis: Diese Phase beinhaltet eine Übernachtung (O/N) Inkubation (~ 16 h).
   1. Waschen Sie die Deckgläsern zweimal in 1 × PBS.
   2. Drop 100 µL Antikörper Verdünnungspuffer (siehe Tabelle 1 für Details) auf das Deckglas und 30 min bei RT inkubieren
      Hinweis: Auf der Grundlage der Deckglas Oberfläche um die gesamte Deckglas abdecken und vermeiden das Risiko der Überlauf sollte Lösung Volumen angepasst werden.
   3. Vorbereiten den Antikörper-Mix (Tabelle 1) mit einem 01:20 Verdünnung von monoklonalen Primärantikörper konjugiert mit Fluorochrom und Antikörper Verdünnungspuffer, wie in dem Datenblatt des Herstellers angegeben.
      Hinweis: Es wird dringend empfohlen, monoklonale Antikörper konjugiert mit thermostabile Fluorochrom zu verwenden. Wenn ein nicht-thermostabile Fluorochrom verwendet wird, kann die Temperatur während der DNA-Fisch-Schritte des Protokolls genutzt beschädigen die Fluorochrom und fluoreszierenden Emissionen zu löschen. In diesem Protokoll, wir entschieden uns für einen EpCAM-FITC Antikörper (01:20 Verdünnung), die keine erheblichen Probleme mit der eingesetzten Temperatur nicht zeigen.
   4. Spülen Sie die Deckgläsern zweimal in 1 × PBS.
   5. Stellen Sie Deckgläsern Zelle-Seite nach oben in eine feuchte Kammer- and -Drop 100 µL des Antikörper-Mix auf dem Deckglas.
      Hinweis: Volumen der Lösung sollte auf der Grundlage der Deckglas Oberfläche zur Deckung der gesamten Deckglas und verringern das Risiko eines Überlaufs angepasst werden.
   6. O/N inkubieren (~ 16 h) im Dunkeln bei 4 ° C.
4. Immunfluoreszenz-Tag 2
   1. Blockieren Sie Antikörper Inkubationszeit durch den Deckgläsern zweimal in 1 × PBS waschen.
      Hinweis: Laden inmitten der Deckgläsern 100 µL 1 × PBS bei 4 ° C in einer Kammer mit konstanter Luftfeuchtigkeit im Dunkeln bis der FISH-Test durchgeführt wird.
5. 2D DNA-Fisch-Tag 2
   Achtung: Besondere Aufmerksamkeit muss auf die hohe Temperatur der Instrumente und der feuchten Kammer.
   1. Einrichten der Hybridisierung Ofen und trockene Hitze-Ofen (~ 3 h vor dem Start der DNA-FISH-Protokoll). Festlegen der Hybridisierung Ofen bei 75 ° C, trockene Hitze Backofen bei 37 ° C eingestellt und kühlen 0.4 × SSC Lösung (pH = 7,0 ± 0,1) (SSC Rezept siehe Tabelle 1) bis 4 ° C.
      Hinweis: pH-Status des Fisch-Puffer ist wichtig: pH = 7,0 ± 0,1.
   2. Waschen Sie das Deckglas in eiskalten 0.4 × SSC Lösung dreimal.
   3. Trocknen Sie das Deckglas unter einem chemischen Abzug für 10 min in der Dunkelheit.
   4. Wirbel für 10 s, und führen Sie einen schnelle Spin-down (mit maximalen Rate) der Sonde von der Wand von der Sonde.
   5. Legen Sie die Deckglas Zelle-Seite nach unten auf einen Rückgang von 5 µL Fisch Sonde auf einer Rutsche und einer Dichtung alle Kanten des Deckglases mit Gummilösung.
      Achtung: Die nächsten beiden Schritte beinhalten hohe Temperaturen. Tragen Sie Schutzhandschuhe.
   6. Legen Sie die Folie in eine dunkle feuchte Kammer im Ofen für 8 min bei 75 ° C für vollständige Denaturierung der DNA-Hybridisierung.
   7. Verschieben Sie die feuchte Kammer in trockener Hitze Backofen bei 37 ° C O/N.
6. 2D DNA-Fisch-Tag 3
   1. Im Wasserbad bei 72 ° C eingestellt und legen Sie eine Folie Färbung Glas mit 0,4 × SSC-Puffer hinein (Tabelle 1). Nach 30 min, überprüfen Sie die Temperatur des Puffers 0.4 × SSC, die sein müssen, bei 72 ± 1 ° C.
   2. Bereiten Sie zwei Glas Becher: mit 2 × SSC + 0,05 % Tween-Puffer (pH = 7,0 ± 0,1) (Tabelle 1) und einen zweiten mit destilliertem Wasser.
   3. Die feuchte Kammer aus dem Ofen nehmen, sorgfältig die Gummilösung aus der Folie entfernen und das Deckglas mit einer Pinzette zu lösen.
   4. Waschen Sie das Deckglas durch Eintauchen in 0.4 × SSC für 2 min bei 72 ° C.
   5. Waschen Sie das Deckglas durch Eintauchen in 2 × SSC + 0,05 % Tween Puffer für 30 s.
   6. Spülen Sie das Deckglas in destilliertem Wasser.
   7. Trocknen Sie die Deckgläsern unter einem chemischen Abzug für 10 min in der Dunkelheit.
   8. Montieren Sie das Deckglas in flüssigen Eindeckmittel mit 1,5 µg/mL 4´, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), Gesamt-DNA Gegenfärbung. Legen Sie die Deckglas Zelle-Seite nach unten auf einen Rückgang von 5 µL Eindeckmedium auf einer Folie, drücken Sie die Pinzette auf das Deckglas, die Luft heraus zu bekommen, und mit Nagellack versiegeln.
      Hinweis: Montage mittleren Lautstärke sollte auf der Grundlage der Größe des Deckglases Oberfläche angepasst werden.
7. 2D Mikroskop Beobachtung und Analyse
   Hinweis: Bilder können mit verschiedenen Mikroskopsystemen erworben werden.

1. Abrufen von Bildern mit einem 12-Bit digital-Kamera und 20 × / 0,50 NA und 40 × / 0,65 NA Ziel mit entsprechenden Filtern für rot (Anregung: 599 nm, Emission: 588 nm), grün (Anregung: 509, Emission: 524), und blau (Anregung: 367 nm, Emission: 452 nm) Sonden.
2. Analysieren von Bildern mit Softwaretool der Wahl.
   Hinweis: Um die Immunfluoreszenz-Färbung und der ALK-Sonde Lokalisierung zu bewerten, haben wir ImageJ. Folien können bei-20 ° C im Dunkeln für maximal 3 Wochen gespeichert werden. Für längere Lagerung empfehlen wir, mit spezifischen Eindeckmedium für langfristige Lagerung.

(2) Immuno-DNA Fisch auf Draht

1. Zelle Spike-Line-in auf Draht (3D-Unterstützung)
   Hinweis: Vorläufige Aufstellung beinhaltet eine genaue Auswahl der adhärenten Zellen Linien auf EpCAM-Positivität. Der Draht ist mit Anti-EpCAM Antikörper funktionalisiert, so dass nur EpCAM-positiven Zellen gefärbt sind.
   Hinweis: Berühren Sie nicht die funktionalisierten Teil des Drahtes um Beschädigungen zu vermeiden.
   Hinweis: Alle Schritte sollten unter einem Laminar-Flow-Haube in sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
   1. Aufschwemmen Sie der gesamte Inhalt einer Flasche T75 (80 % Zusammenfluss) in eine 5 mL-Fläschchen mit 4 mL des kompletten Medium; für ein einzelnes Spike-in sollten etwa 2.000.000 Zellen Zellen Adhäsion an den Draht zu maximieren.
   2. Entfernen Sie das Kabel aus der Glasverpackung.
   3. Tauchen Sie die funktionalisierten gold Teil des Drahtes in das Fläschchen, um sicherzustellen, dass der Draht-Stopper eine wasserdichte das Fläschchen passt. Seal mit Labor-Film.
      Hinweis: Die Verwendung von 5 mL-Tube wird empfohlen, um eine korrekte Übereinstimmung zwischen der Draht-Stopper und das Fläschchen zu ermöglichen.
   4. 30 min bei RT in ein Rohr Rotator inkubieren (0-120 Winkel).
   5. Spülen Sie den Draht dreimal in 1 × PBS-Lösung mit 3 verschiedenen sauberen Fläschchen.
2. Fixierung und Permeabilisierung
   Achtung: Aceton ist eine brennbare Substanz, die die Atemwege reizen kann. Verwenden Sie nur Aceton-beständige Kunststoff- oder Glasbehälter (kein PVC oder PVDF).
   Hinweis: Führen Sie diese Schritte unter einem chemischen Abzug.
   1. Trocknen Sie den Draht an der Luft.
   2. Befestigen Sie den Zellen durch Eintauchen des Drahtes in Aceton 100 % Lösung für 10 min bei RT. Nutzung eine 5 mL-Tube.
      Hinweis: Der Draht-Stopper muss nicht das Fixiermittel in Berührung.
   3. An der Luft trocknen der Leitung für 5 min bei RT
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Der Draht muss bei-20 ° c gelagert werden Wenn den Draht für die langfristige Lagerung, Verpackung, legen Sie den Draht-Stopper neben der funktionalisierten Spitze und legen Sie den Draht in die Lagerung Glasrohr, kümmert sich nicht um die funktionalisierten Spitze beschädigen. Schließen Sie das Speicher-Glas und speichern Sie (vertikal oder horizontal) bei-20 ° C.
3. Immunfluoreszenz-Tag 1
   Hinweis: Diese Phase beinhaltet eine O/N Inkubation (~ 16 h).
   1. Waschen Sie zweimal in 1 × PBS-Lösung mit 5 mL Tube.
   2. Inkubieren Sie den Draht in Verdünnungspuffer Antikörper für 30 min bei RT mit 5 mL Tube.
   3. Bereiten Sie 150 µL Antikörper-Mix mit einer Verdünnung von monoklonalen Primärantikörper konjugiert mit Fluorochrom in Verdünnungspuffer Antikörper, wie im Datenblatt angegeben. EpCAM-FITC Antikörper wurde z. B. mit einem 01:20 Verdünnung.
   4. Verwenden Sie einen p200 Tipp Inkubation wie folgt durchführen: Auszug den Draht aus der Draht-Stopper und sanft stecken Sie das Kabel durch die größere Öffnung an der Spitze. Einführen Sie unfunctionalized Ende zuerst und ziehen Sie den Draht durch das kleinere Loch langsam, bis das gold direkt hinter das größere Loch ist.
   5. Sanft fallen 150 µL des Antikörper-Mix (z. B. anti-EpCAM_FITC Antikörper 01:20 verdünnt) in die Spitze. Um die Gefahr von Blasenbildung zu vermeiden, wirbeln Sie sanft den Draht, bis der funktionalisierten Teil komplett getaucht wird.
   6. Seal bis das Loch an der Spitze. Labor-Film um das Loch wickeln kann helfen.
   7. Inkubieren Sie vertikal O/N (~ 16 h) im Dunkeln bei 4 ° C.
4. Immunfluoreszenz-Tag 2
   1. Blockieren Sie Antikörper Inkubationszeit durch den Draht zweimal in 1 × PBS waschen.
   2. Setzen Sie den Draht in die Draht-stopfen.
      Hinweis: Laden in 1 X PBS bei 4 ° C in 5 mL Fläschchen bis der FISH-Test durchgeführt wird.
5. 3D-FISCHE DNA-Tag 2
   Achtung: Besondere Aufmerksamkeit muss auf die hohe Temperatur der Instrumente und feuchte Kammer.
   1. Einrichten der Hybridisierung Ofen und trockene Hitze-Ofen (~ 3 h vor dem Start der DNA-FISH-Protokoll). Hybridisierung Ofen bei 75 ° C eingestellt, die trockene Hitze Backofen bei 37 ° C eingestellt und kühlen die 0.4 × SSC-Lösung (pH = 7,0 ± 0,1) bis 4 ° C.
      Hinweis: Der pH-Status der Fisch Puffer ist von entscheidender Bedeutung und muss 7,0 ± 0,1.
   2. Waschen Sie den Draht 3 Mal im eiskalten 0.4 × SSC-Lösung.
      Hinweis: Halten Sie den Draht im Dunkeln Fluorochrom Immunofluoreszenz bei den folgenden Verfahren zu vermeiden.
   3. 10 min in der Dunkelheit unter dem Laborabzug trocknen lassen.
   4. Wirbel und drehen Sie die Sonde für 5 s.
   5. Sollte Mikroröhrchen 10 µL der Sonde ablegen. Deckel mit Labor-Film.
   6. Drehen Sie die Mikroröhrchen wie folgt: wickeln Sie die Reaktionscup in einem trockenen, saugfähigen, Papier Put in ein 50-mL-Röhrchen, und drehen Sie kurz.
   7. Sorgfältig den getrockneten Draht in die Reaktionscup und schieben Sie den Draht-Stopper. Mit Gummilösung abdichten.
      Achtung: Die nächsten beiden Schritte beinhalten hohe Temperaturen.

Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens ist möglich, einen Fisch Immuno-DNA-Test auf CTCs (oder anderen gleichwertigen Zellen) bereichert durch die funktionalisierten Draht durchzuführen. Vor der Inbetriebnahme dieses Protokolls war die Kompatibilität der beiden Techniken bestimmt (Immuno-Fluoreszenz mit Fisch) auf standard 2D unterstützt. Zwei verschiedenen NSCLC Zell-Linien mit dem Ausdruck EpCAM (verpflichtet, sich an den Draht gepaart mit Antikörper gegen EpCAM) wurden ausgewählt. Sie haben einen anderen ALK-Status, ist nützlich, um unterschiedliche Ausgangsbedingungen zu testen. Das erste, NCI-H1975, haben Wildtyp (WT) ALK Gene, während das zweite, NCI-H3122 zeichnet sich durch ALK Translokationen.

Ein ALK-gen brechen auseinander Erkennungssystem für die Fisch-Assay wurde verwendet. Das System besteht aus zwei Sonden, eine (Orange) Hybridisierung, die proximalen Bereich innerhalb von ALK auf 2p 23 und einer (grün) Hybridisierung distal zum ALK. Auf 2D unterstützt vorgesehen Immuno-DNA Fisch gut definierte Signale für Antikörper und Sonde (Abbildung 2). Insbesondere Zellinien beide zeigte klar definierte EpCAM-Membran-Lokalisierung. Darüber hinaus erschien Sonde Signale hell und scharf: NCI-H1975 Zellen zeigte überlappende orange und grüne Sonden, bestätigt den Wildtyp-Status des ALK-gen (Abbildung 2a, b). Im Gegensatz dazu zeigte NCI-H3122 Zellen überlappende Signale und einzelne grüne Punkte, was eine Löschung des ALK-gen (Abbildung 2 c, d). Wenn der Fisch Immuno-DNA Test durchgeführt wurde auf die 3D Unterstützung funktionalisierten Draht, Antikörper und Sonde Signale wurden in der Regel weniger als auf die 2D Unterstützung definiert. EpCAM Färbung zu sehen war. ALK-Sonde Signale waren weniger definiert aber noch reflektiert den erwarteten ALK-Status (Abbildung 3). Ergebnisse zeigten, dass die Immunfluoreszenz-Färbung nicht DNA Fisch Signale beeinträchtigt. Die Sonden hybridisiert speziell mit ihren Zielen. NCI-H3122-Zell-Linie zeigte einen aberranten ALK gen-Status (Abb. 3 b), im Gegensatz zu NCI-H1975, mit einem Wildtyp-ALK-gen (Abbildung 3a).

Abbildung 1 : Draht, schematische Anordnung der ALK Pause auseinander Sonden, Schema der erwarteten Muster von ALK-Umlagerung und speziellen Halter funktionalisiert. (ein) rote Kästchen markieren die drei Hauptteile des Drahtes: funktionalisiert, Spitze, Draht-Stopper und UN-funktionalisierten Spitze. Die funktionalisierten Spitze ist der empfindlichste Teil des Drahtes und muss bei der Handhabung um Zelle Ablösung oder Schäden zu vermeiden nicht berührt werden. (b) die Sonden grünen und roten bzw. binden an Sequenzen vor- und nachgelagerten Loci ALK-gen (auf der linken Seite). Auf der rechten Seite erscheinen Plastiche Muster von ALK-Arrangements. Rote und grüne Co Lokalisierung Signale auf normale Zellen; getrennte grüne und rote Signale zeigen ein ALK-gen Chromosom Pause (Translokation von ALK-gen) und ein grün-Orange NS1 Signal (aberrante Zelle-1). Ein rotes Signal und zwei grüne Signale zeigen den Verlust von ein rotes Signal, was auf eine chromosomale Translokation und eine Deletion (aberrante Zelle-2). (c) Draht-Halter; rote Kästchen markieren Bereiche, wo Pflege, beim Umgang mit des Drahts während der Mikroskopie-Analyse benötigt wird. Der Draht kann eine 360° Analyse unterziehen, durch drehen den Rotator. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Immuno-DNA Fisch-Assay auf 2D Unterstützung (Deckglas). (ein, b) NCI-H1975 Zellen schwach positiv für EpCAM. EpCAM FITC Signale waren spürbar. Die Orangen und grünen Sonden des ALK Pause-apart überschnitten WT Status des ALK-gen in NCIH1975 Zelllinie bestätigen. Zellen, die Anzeige von mehr als zwei gekoppelte Signale waren aufgrund ihrer Aneuploidie. (c, d) In der hohen EpCAM exprimierenden NCIH3122-Zell-Linie waren Immunfluoreszenz Signale hell, die wurde in Zell-Zell-Verbindungen akzentuiert. Fisch Analysen bestätigten Löschungen von der ALK-gen, typisch für diese Zelllinie. Rote Pfeile zeigen einzelne grüne Sonden (ohne entsprechende orange Sonden), ALK-gen Löschung widerspiegelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Immuno-DNA Fisch assay mit funktionalisierten Draht als 3D-Unterstützung. (einem) Vertreter Bild des NCI-H1975 Zellen auf den Draht. Obwohl die 3D Form der Zellen auf dem Draht erschweren, voll unscharfe Bilder zu erwerben, ist in allen Zellen EpCAM Signal gut sichtbar. (b) Vertreter Bild von NCI-H3122 Zellen auf den Draht. ALK-Sonden zeigten gen löschen (rote Pfeile), wie zuvor auf die 2D Unterstützung gesehen. Die sichtbaren Hintergrund Signale wurden höchstwahrscheinlich aufgrund des Vorhandenseins der Polymerschicht. Jedoch es nicht erheblich beeinträchtigen, Zellanalyse Identifikation oder Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1: Lösungen Rezepte.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.