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Methodenartikel

Einfache und schnelle Methode, um qualitativ hochwertige Tumor DNA von klinischen pathologischen Proben mit Touch Impressum Zytologie zu erhalten

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DOI:

10.3791/56943

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21. März 2018

 ,  ,  , 
1Genome Analysis Center, Yamanashi Central Hospital, 2Pathology Division, Laboratory Department, Yamanashi Central Hospital, 3The University of Tokyo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Erhalten qualitativ hochwertige genomischen DNA von Tumorgewebe ist ein wichtiger erster Schritt für die Analyse von genetischer Veränderungen, die Sequenzierung der nächsten Generation. In diesem Artikel präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode, um Tumorzellen zu bereichern und intakte DNA von Touch Impressum Zytologische Proben erhalten.

Zusammenfassung

Es ist entscheidend für die Mutationszucht Status bei Krebs vor Verwaltung und Behandlung der spezifische molekulare zielgerichtete Medikamente für Krebspatienten zu bestimmen. In der klinischen Einstellung sind Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe für Gentests verbreitet. Proteinkinase DNA ist jedoch in der Regel beschädigt und bei der Fixierung mit Formalin fragmentiert. Proteinkinase DNA ist daher manchmal nicht ausreichend für die genetische Untersuchung wegen geringer Qualität und Quantität der DNA. Hier präsentieren wir eine Methode der Touch Impressum Zytologie (TIC), genomischen DNA von Krebszellen zu erhalten, die unter dem Mikroskop beobachtet werden kann. Zelle Morphologie und Krebs-Zell-Zahlen können mit TIC Proben ausgewertet werden. Darüber hinaus kann die Extraktion von genomischer DNA aus TIC Proben innerhalb von zwei Tagen abgeschlossen werden. Den Gesamtbetrag und die Qualität der TIC DNA erhalten mit dieser Methode war höher als die der Proteinkinase DNA. Diese schnelle und einfache Methode erlaubt Forschern, qualitativ hochwertige DNA für genetische Untersuchungen (z.B., nächste Generation Sequenzierung Analyse, digitale PCR und quantitative Real-Time PCR) zu erhalten und um die Bearbeitungszeit für die Berichterstattung über Ergebnisse zu verkürzen.

Einleitung

Nächste Generation Sequencing Technologie hat Forscher erhebliche Fortschritte bei der Analyse von Genominformationen in genetischen Variationen, Mendelian Krankheit, erbliche Veranlagung und Krebs 1,2,3 bereitgestellt . Die Cancer Genome Atlas (TCGA) und internationalen Krebs Genom Konsortium (ICGC) haben die Identifizierung der genetischen Veränderungen, die in verschiedenen Arten von gemeinsamen Krebserkrankungen4verfolgt. Hunderte von wesentlicher Treiber Krebsgene erfolgreich identifiziert worden, und einige dieser Moleküle sind für Droge-Entwicklung1,5,6angestrebt.

In der klinischen Einstellung sind FFPE-Proben für die pathologische Diagnose und molekulare Tests für verschiedene Krankheiten, einschließlich Krebs gebräuchlich. Jedoch bei der Fixierung mit Formalin, tritt Vernetzung der DNA-Protein oder DNA-DNA und DNA-Fragmentierung wird induziert. Somit eignen sich FFPE DNA-Proben nicht immer zur genetischen Analyse wegen der geringen Qualität und Quantität der DNA-7,8,9. Darüber hinaus dauert es mehrere Tage FFPE-Proben vorbereiten und technisches Geschick ist notwendig, um die Abschnitte genau vorbereitet. Daher ist es wünschenswert, eine einfache und schnelle Methode zur Gewinnung qualitativ hochwertige intakte DNA zu entwickeln.

Zytologie ist eine alternative Methode für die pathologische Diagnose. Zytologische Probenvorbereitung ist eine einfachere, weniger teuer und schneller Ansatz im Vergleich zu FFPE Vorbereitung10. Die TIC-Technik wurde auf Sentinel-Lymphknoten und marginale Gewebe von Patientinnen mit Brustkrebs für intraoperative Schnelldiagnose für einige Jahre11,12durchgeführt. Allerdings gibt es einige Berichte, die untersucht, ob qualitativ hochwertige genomischer DNA aus TIC Proben extrahiert werden kann und für spätere genetische Analyse verwendet. Zytologische Präparate sind häufig mit Papanicolaou (Pap) oder Giemsa Färbung gefärbt, und wir haben bereits berichtet, dass die Menge und Qualität der von TIC Proben (vor allem Giemsa gefärbten Proben) extrahierte DNA Proben aus FFPE überlegen sind Gewebe-13. Verglichen mit PAP-Färbung, hat Giemsa Färbung einen Vorteil in weniger befleckenden Verfahren erfordern. Pap-Färbung, nach die Proben wurden behoben, und gebeizt, müssen sie montiert werden mit Montage Medium (z. B.Malinol) Probe Inhalt, z. B. Tumorzellen normalen Zellen und entzündlichen Zellen unter dem Mikroskop zu unterscheiden. Wenn die Pap-Probe ohne Montage Schritt bereit ist, ist es fast unmöglich, die Zellen unter dem Mikroskop zu beobachten, weil die Probe getrocknet ist. Zum Vergleich: Giemsa Färbung im getrockneten Zustand beobachtet werden, daher die Montage-Schritt ist nicht erforderlich für schnelle zelluläre Bewertung. Für Mikrodissektion ist die Giemsa Färbung besser geeignet, da trockene Proben erforderlich.

In diesem Bericht wir stellen eine einfache und schnelle Methode für die Zubereitung von TIC Exemplare mit Giemsa Färbung und zeigen, dass TIC eine bessere Quelle für DNA verglichen mit FFPE-Proben.

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Protokoll

(1) TIC Vorbereitung für schnelle mikroskopische Beurteilung mit normalem Glas gleitet

  1. Nach klinischen pathologischen Gewebe Materialien zur Verfügung stehen durchführen Sie die TIC-Vorbereitung so bald wie möglich. Wenn TIC Proben sofort vorbereitet werden können, halten Sie die Gewebe Materialien bedeckt mit Kochsalzlösung befeuchtet steriler Gaze und lagern im Kühlschrank Trocknen des Gewebes zu verhindern.
  2. Bereiten Sie 5 mm3 Gewebematerial wie soliden Tumoren (z.B.Leber, Lunge und Brustgewebe) klinisch durch Operation oder Endoskopie gewonnen.
    1. Sanft reinigen Sie das Gewebe mit steriler Gaze beschichtet mit physiologischer Kochsalzlösung und entfernen Sie Blut zu, wenn die Gewebeoberfläche eine Menge Blut hat.
    2. Halten Sie für mikroskopische Präparate wie Biopsiematerial die Probe mit steriler Gaze getränkt in physiologischer Kochsalzlösung befeuchtet.
  3. Schneiden Sie und trimmen Sie das normale Gewebe mit einem Trimmmesser und setzen Sie die Oberfläche des Tumors Läsion, aus, wenn die Tumormassen grob nicht sichtbar sind.
  4. Berühren Sie die Tumor-Oberfläche der resezierten Exemplare auf einem normalen Objektträger mehrmals mit behandschuhten Händen. Bestätigen Sie visuell, dass berührte Bereich über 80 % der normalen Glas Folie ist.
  5. Leicht andrücken der normalen Glas Folie gegen eine Polyethylen naphthalate (PEN) Membran Folie und 2-3 Mal mit behandschuhten Händen einmassieren. Bestätigen Sie visuell, dass die Zellen aus der normalen Objektträger in Stift Membran Folie übertragen werden.
  6. Trocknen Sie das Glas und Stift Membran Folien für 5 min bei Raumtemperatur an der Luft.
  7. Färben Sie die normalen Objektträger für direkte zytologische Untersuchung. Tauchen Sie den Objektträger mit Fixativ Lösung für 5 s und dann Fleck mit Giemsa Färbung Lösung für 15 s.
  8. Bewerten und Bildschirm Tumor Inhalte und Zellularität auf normales Glas Folie vollständig mit einem Mikroskop für schnelle Beurteilung. Tumorzellen, die auf der Grundlage mehrerer Kriterien zu bewerten; nukleare Erweiterung, abnorme Karyotyp, reichlich Chromatin, ungleiche Verteilung der Zellen, Verhältnis von nuklearen Komponente/zytoplasmatischen Komponente, Zellengröße und Zellpolarität.

2. Vorbereitung des Stift-Membran-Dia-Film für Gentests

  1. Wenn das Beispiel Tumor Zellularität zeigt mehr als 60 % durch schnelle mikroskopische Beurteilung (Schritt 1,8), den Tumor berührt Film der Stift Membran Folien für DNA-Extraktion mit einem Messer geschnitten und behandschuhten Händen. Übertragen Sie den geschnittenen Film zu einem sterilen Microcentrifuge Schlauch mit einer Pincette und Handschuhen.
  2. Wenn der Tumor Zellularität so niedrig (weniger als 60 % des Inhalts Tumor) durch schnelle mikroskopische Beurteilung (Schritt 1,8) bestimmt wurde, nutzen Sie Laser Capture Microdissection und einholen Sie Tumorproben.
    1. Führen Sie Giemsa Färbung um die Tumorzellen unter Verwendung von standard-Protokollen zu beurteilen.
    2. Schneiden Sie die Folie von der PEM-Membran-Folie von geeigneten Laser Capture Microdissection.
    3. Übertragen Sie den geschnittenen Film zu einem sterilen Microcentrifuge Schlauch mit einer Pincette und Handschuhen.
    4. Speichern Sie den Film-haltigen Microcentrifuge Schlauch bei 4 ° C bis DNA-Extraktion (das Protokoll kann hier angehalten werden).

3. DNA-Extraktion

  1. Durchführen Sie DNA-Extraktion aus den TIC oder FFPE Gewebeproben mit einem FFPE DNA Extraktion Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen. Eine gleichwertige Kit ist verfügbar für die Proteinkinase DNA Extraktionsschritt.
  2. Fügen Sie 180 µL Gewebe Lyse Puffer (pH = 8.3) mit dem Film-haltigen Microcentrifuge Schlauch mit einer manuellen 200 µL Pipette. Fügen Sie 20 µL Proteinase K mit einer manuellen 20 µL Pipette und Mix durch Vortexen mit einem Vortex-Mixer mit maximaler Geschwindigkeit (ca. 2500 u/min) für 5 s.
  3. Inkubieren Sie die Proben bei 56 ° C über Nacht mit einem Luft-Inkubator.
  4. Bzw. Inkubieren Sie die Proteinkinase und TIC Proben bei 90 ° C in einem Hitze-Block für 1 h und 10 min. Kurz spin-down der Microcentrifuge Schlauch 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur mit einer Mini-Zentrifuge.
  5. Hinzufügen 200 µL Puffer lyse der Probe mit einem 200-µL Pipette und Mischung gründlich durch Vortexen mit maximaler Geschwindigkeit für 5 s.
  6. 200 µL Ethanol (96-100 %) mit einer 200-µL Pipette und gründlich mischen von vortexen mit maximaler Geschwindigkeit für 5 s. kurz spin-down der Microcentrifuge Schlauch 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur mit einer Mini-Zentrifuge.
  7. Übertragen Sie sorgfältig die gesamte lysate auf die Spin-Spalte mit einem 1.000 µL Pipette und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min bei 25 ° C.
  8. Setzen Sie die Spin-Säule in einer sauberen 2-mL-Kollektion-Röhre mit behandschuhten Händen, und verwerfen Sie dem Sammelrohr mit der Durchfluss in einem Kunststoff Entsorgungsbox.
  9. Die Spin-Spalte mit einem 1.000 µL Pipette und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min bei 25 ° c 500 µL Waschpuffer hinzufügen
  10. Setzen Sie die Spin-Säule in einer sauberen 2-mL-Kollektion-Röhre mit behandschuhten Händen, und verwerfen Sie dem Sammelrohr mit der Durchfluss in einem Kunststoff Entsorgungsbox.
  11. Die Spin-Spalte mit einem 1.000 µL Pipette und Zentrifuge bei 6.000 x g für 1 min bei 25 ° c 500 µL Waschpuffer hinzufügen
  12. Das Sammelröhrchen mit der Durchfluss in einem Kunststoff Entsorgungsbox zu verwerfen. Setzen Sie die Spin-Säule in einem sauberen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit behandschuhten Händen und Zentrifugieren bei 20.000 x g für 3 min bei 25 ° C um die Membran zu trocknen.
  13. Setzen Sie die Spin-Säule in einem DNA-niedrige Bindung Rohr mit behandschuhten Händen.
    1. Das Zentrum der Membran mit einer 100 µL Pipette 40-50 µL der Elution Puffer hinzufügen.
    2. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min und Zentrifuge bei 20.000 x g für 1 min bei 25 ° C.
    3. Speichern Sie die DNA-Proben bei-20 ° C erst im nächsten Schritt (das Protokoll kann hier angehalten werden).

4. Einschätzung der Qualität der DNA durch Quantitative Real-Time PCR

  1. Bereiten Sie den master-Mix in einem sterilen Microcentrifuge Schlauch mit einer Pipette, wie folgt: 10 µL 2 x Echtzeit-PCR Master Mix, 1 µL 20 x RNase P Primer-Sonden Mix (Amplikons Größe: 87 bp), und 8 µL steriler Nuklease-freies Wasser.
  2. Der zweite master-Mix in einem sterilen Microcentrifuge Schlauch wie folgt vorbereiten: 10 µL 2 x Echtzeit-PCR Master Mix, 1 µL 20 x RNase P Primer-Sonden Mix (Amplikons Größe: 268 bp), und 8 µL steriler Nuklease-freies Wasser.
  3. Durchführen Sie Verdünnungsreihen menschlicher Kontrolle genomic DNA (beiliegenden) 4 Mal für ein fünf-Punkte-Standardkurve und bestimmen Sie die absolute DNA-Konzentrationen13.
  4. Fügen Sie 19 µL der zwei vorbereiteten Meister Mischungen (vorbereitet in Schritt 4.1 und 4.2) in separaten Vertiefungen eines optische Reaktion der 96-Well-Platte mit einem 20-µL Pipette.
  5. Fügen Sie 1 µL FFPE DNA oder TIC-DNA, Brunnen, enthält die Reaktion Mischung mit einer 2-µL Pipette zu trennen. Fügen Sie 1 µL Nuklease-freies Wasser in einen separaten Brunnen mit der Reaktion-Mix für die keine Vorlage-Kontrolle.
  6. Halten der nichtklebenden Seite des optischen Klebefolie und ziehen Sie die schützende Rückendeckung von der Mitte des Films. Vorsichtig ziehen Sie den Applikator über den Film und versiegeln Sie den Film über die 96-Well-Platte zu.
  7. Vorsichtig mischen die 96-Well-Platte mit einer 96-Well-Platte-Mixer für 10 s bei Raumtemperatur bei 2.000 u/min. Zentrifugieren Sie die Platte kurz bei 1.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur.
  8. Schalten Sie die Echtzeit-PCR Instrument und Einfügen der 96-Well-Platte. Führen Sie das folgende Protokoll mit PCR-Reaktionen: 95 ° C für 20 s, gefolgt von 45 Zyklen von 95 ° C für 1 s bis 60 ° C für 20 s. Verwendung "Standardkurve" und "schnell-Modus."
  9. Bewerten Sie DNA-Fragmentierung mit dem Verhältnis von DNA (relative Quantifizierung; RQ) erhalten für die lange Amplifikate (268 bp), die kurzen Amplifikate (87 bp). RQ ist der Mittelwert der lange Amplikons/der Mittelwert der kurzen Amplikons13.

5. Vorbereitung der nächsten Generation Sequenzierung Bibliothek

  1. Bereiten Sie die Sequenzierung-Bibliothek für die Sequenzierung der nächsten Generation gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  2. Die Multiplex-PCR-master-Mix in einem sterilen Microcentrifuge Schlauch pro Probe wie folgt vorbereiten: 4 µL 5 x Multiplex PCR-Reaktion-Lösung, 4 µL 5 x Grundierung Pool, ≤6 µL TIC oder Proteinkinase DNA (1-100 ng), und fügen Sie Nuklease-freies Wasser bis zu 20 µL.
    1. Hinzu kommen die Multiplex-PCR-master-Mix eine PCR Rohr und Mischung sanft durch Tippen auf das Rohr.
    2. Kurz spin-down der Microcentrifuge Schlauch 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur mit einer Mini-Zentrifuge.
  3. Führen Sie das folgende Protokoll mit PCR-Reaktionen: 99 ° C für 2 min, gefolgt von 20 Zyklen von 99 ° C für 15 s und 60 ° C für 4 min und halten Schritt 10 ° C. Kurz spin-down das PCR-Röhrchen mit einer Mini-Zentrifuge bei 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Bestimmen Sie die Anzahl der Zyklen, die basierend auf der Anzahl von Primer-Paaren.
  4. Öffnen Sie den Deckel der PCR-Röhre, und fügen Sie 2 µL Restriktionsenzym mit einer 2-µL Pipette. Schließen Sie den Deckel des PCR-Röhrchen und Mischung sanft durch Tippen auf das PCR-Röhrchen. Kurz spin-down das PCR-Röhrchen mit einer Mini-Zentrifuge bei 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur.
  5. Führen Sie das folgende Protokoll mit PCR-Reaktionen: 50 ° C für 10 min, 55 ° C für 10 min, 60 ° C für 20 min, und halten Schritt 10 ° C. Kurz spin-down das PCR-Röhrchen mit einer Mini-Zentrifuge bei 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur.
  6. Fügen Sie die Adapter-Ligatur master-Mix in die nun jeweils die verdaute PCR-Amplifikate mit einer Pipette wie folgt: 4 µL Adapter Ligatur Lösung 0,5 µL Barcode, 0,5 µL des Adapters, 2 µL Nuklease-freies Wasser und 2 µL DNA Ligase. Schließen Sie den Deckel des PCR-Röhrchen und Mischung sanft durch Antippen. Kurz spin-down das PCR-Röhrchen mit einer Mini-Zentrifuge bei 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur.
  7. Führen Sie das folgende Protokoll mit PCR-Reaktionen: 22 ° C für 30 min, 68 ° C für 5 min, 72 ° C für 5 min, und halten Schritt 10 ° C.
  8. Reinigen Sie die Sequenzierung Bibliothek mit magnetischen Beads nach den Anweisungen des Herstellers.
  9. Übertragen Sie die Adapter ligiert Bibliothek Lösung in 1,5 mL DNA niedrige unverbindliche Rohr. Fügen Sie 45 µL des magnetischen Beads in das DNA niedrige unverbindliche Rohr für die 1St -Reinigung. Durch Tippen auf das Rohr vorsichtig mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  10. Legen Sie die DNA-niedrige Bindung Röhre in einem magnetischen Rack, dann 2 min bei Raumtemperatur inkubieren Sie, bis die Lösung klar ist. Sorgfältig entsorgen des Überstands mit einer 200-µL Pipette ohne störende magnetische Beads.
  11. Fügen Sie 150 µL von frisch zubereiteten 70 % Ethanol mit einer 200-µL Pipette hinzu, dann verschieben Sie die Tube Seite zu Seite des Magneten, die Perlen zu waschen. Sorgfältig entsorgen des Überstands ohne störende magnetische Beads.
  12. Wiederholen Sie Schritt 5.11 für einen zweiten Waschgang.
  13. Spin-down der Röhre kurz mit Mini-Zentrifuge bei 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur. Legen Sie die DNA niedrige unverbindliche Röhre in einem magnetischen Rack, und entsorgen Sie sorgfältig die Ethanol-Tröpfchen mit einer 10 µL Pipette.
  14. Fügen Sie 50 µL TE tief in das DNA-Low-Bindung-Rohr mit magnetischen Beads Pellet um die Perlen zu verteilen. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  15. Legen Sie die DNA niedrige unverbindliche Röhre in einem magnetischen Rack und Inkubation bei Raumtemperatur für 2 min, bis die Lösung klar ist.
  16. Übertragen Sie 50 µL Überstand in das neue DNA niedrige unverbindliche Rohr und fügen Sie 75 µL des magnetischen Beads mit einer 100 µL Pipette für die 2Nd -Reinigung. Durch Tippen auf das Rohr vorsichtig mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  17. Legen Sie die DNA niedrige unverbindliche Röhre in einem magnetischen Rack, dann 2 min bei Raumtemperatur inkubieren Sie, bis die Lösung klar ist. Sorgfältig entsorgen des Überstands mit einer 200-µL Pipette ohne störende magnetische Beads.
  18. Fügen Sie 150 µL von frisch zubereiteten 70 % Ethanol mit einer 200-µL Pipette hinzu, dann verschieben Sie die Tube Seite zu Seite des Magneten, die Perlen zu waschen. Sorgfältig entsorgen des Überstands ohne störende magnetische Beads.
  19. Wiederholen Sie Schritt 5.18 für einen zweiten Waschgang.
  20. Kurz spin-down das Rohr mit einer Mini-Zentrifuge bei 1.500 x g für 5 s bei Raumtemperatur. Legen Sie die DNA niedrige unverbindliche Röhre in einem magnetischen Rack, und entsorgen Sie sorgfältig die Ethanol-Tröpfchen mit einer 10 µL Pipette.
  21. Fügen Sie 50 µL der niedrigen TE in das DNA-Low-Bindung-Rohr mit magnetischen Beads Pellet um die Perlen zu verteilen. 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  22. Legen Sie die DNA niedrige unverbindliche Röhre in einem magnetischen Rack und Inkubation bei Raumtemperatur für 2 min, bis die Lösung klar ist.
  23. Die 45 µL des Überstands mit gereinigtem Bibliothek in das neue DNA niedrige unverbindliche Rohr mit einer 100 µL Pipette zu übertragen.

(6) quantifizieren Sie die Bibliothek-Konzentration durch Quantitative Real-Time PCR

  1. Bestimmen Sie die Konzentration der jede Bibliothek gemäß des Herstellers Anweisungen13.
    1. Bereiten Sie eine 20-fold Verdünnung Lösung wie folgt: Mischen Sie 2 µL der gereinigten Bibliothek und 38 µL Nuklease-freies Wasser in einem DNA-Low-Bindung-Rohr mit einer 2-µL und 100 µL Pipette.
    2. Speichern Sie die unverdünnten Bibliotheken bei-20 ° C bis Schritt 7.3.
  2. Bereiten Sie eine 200-fold Verdünnung Lösung wie folgt: Mischen Sie 5 µL der 20-fold verdünnter gereinigten Bibliothek (in Schritt 6.1 vorbereitet) und 45 µL Nuklease-freies Wasser in einem DNA-Low-Bindung-Rohr.
  3. Bereiten Sie eine 2,000-fold Verdünnung Lösung wie folgt: Mischen Sie 5 µL der 200-fold verdünnter gereinigten Bibliothek (in Schritt 6.2 vorbereitet) und 45 µL Nuklease-freies Wasser in einem DNA-Low-Bindung-Rohr.
  4. Die Reaktion-master-Mix wie folgt vorbereiten: 10 µL 2 x master-Mix Lösung und 1 µL 20 x Primer-Sonden-Assay-Lösung in sterilen Microcentrifuge Schlauch mit einer Pipette, vermischen dann durch Tippen auf das Rohr. Fügen Sie 11 µL der Reaktion-master-Mix in die Vertiefungen einer optischen 96-Well-Reaktion.
  5. Jede Vertiefung mit einer 10 µL Pipette 9 µL der 2,000-fold verdünnter Bibliothek, 9 µL jeder standard-Steuerelement oder 9 µL Nuklease-freies Wasser hinzufügen.
  6. Halten Sie die nichtklebenden Seite optische Klebefolie und ziehen Sie die schützende Rückendeckung von der Mitte des Films.
    1. Vorsichtig ziehen Sie den Applikator über den Film und versiegeln Sie den Film über die 96-Well-Platte zu.
    2. Vorsichtig mischen die 96-Well-Platte mit einer 96-Well-Platte-Mixer für 10 s bei Raumtemperatur.
    3. Zentrifugieren Sie die Platte kurz bei 1.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur.
  7. Schalten Sie die Echtzeit-PCR Instrument und Einfügen der 96-Well-Platte. Führen Sie das folgende Protokoll mit PCR-Reaktionen: 50 ° C für 2 min, 95 ° C für 20 s, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 1 s bis 60 ° C für 20 s. Verwendung "Standardkurve" und "schnell-Modus."
  8. Berechnen Sie unverdünnt Bibliothek Konzentration durch Multiplikation der Konzentration von 2.000 mit qPCR ermittelt.

(7) next Generation Sequencing

  1. Planen Sie den laufen Zustand und legen Sie den laufen Parameter innerhalb der Software.
    1. Klicken Sie auf [Register "Plan"] und [Vorlage], und wählen Sie die entsprechende run-Methode.
    2. Wählen Sie die Anwendung und Technik aus, und klicken Sie auf [weiter].
    3. Wählen Sie das Instrument, Probe Vorbereitungssatz (optional), Kit Bibliothekstyp, Vorlage Kit, Sequencing Kit, Basis Kalibriermodus, chip-Typ, Sequenz (optional) und Barcode zusammengestellt und klicken Sie auf [weiter].
    4. Wählen Sie Plugins und klicken Sie auf [weiter].
    5. Wählen Sie Projekt aus und klicken Sie auf [weiter].
    6. Wählen Sie Standard-Referenz und Bett-Dateien für Ihre gezielte Gegend.
    7. Geben Sie den Probennamen, wählen Sie den Barcode, und klicken Sie auf [Plan ausführen].
  2. Vorlage-Vorbereitung durchführen und chip-laden in einem automatisierten Instrument nach den Anweisungen des Herstellers. Die Reagenzkassette bei Raumtemperatur für 45 min vor dem Gebrauch auftauen.
  3. Verdünnen der unverdünnten Bibliothek mit Nuklease-freies Wasser entsprechend der Bibliothek-Konzentration in Schritt 6,8 berechnet und 20 Uhr Bibliotheken zu machen.
    1. Bereiten Sie eine gepoolte Bibliothek für Sequenzierung und Shop auf Eis.
    2. Fügen Sie 25 µL der gepoolten Bibliothek mit einer 100 µL Pipette auf den Boden des Probenröhrchens. Verwenden Sie die gepoolte Bibliothek innerhalb von 48 h.
  4. Schalten Sie ein und öffnen Sie die Abdeckung des automatischen Instruments.
    1. Legen Sie die Sequenzierung Chip, Chip-Adapter, Bereicherung Patrone, Tipp Patrone, PCR Platte, PCR-Frame Dichtung, Erholung Rohr, Lösung Patrone und Reagenzkassette an die gewünschte Position des automatisierten Instruments.
    2. Tippen Sie auf [Setup ausführen] und [Schritt für Schritt] auf dem Bildschirm.
    3. Schließen Sie die Abdeckung, und tippen Sie auf [Start überprüfen] auf dem Bildschirm.
    4. Nach dem Deck scan-Prozess, tippen Sie auf [weiter] auf dem Bildschirm.
    5. Prüfen Sie den Displayinhalt (Kit-Typ, Chip, chip-ID, Proben-ID, Pläne), stellen Sie die Zeit, und tippen Sie auf [OK] auf dem Bildschirm.
  5. Nach Beendigung der Chip-laden:
    1. Tippen Sie auf [weiter] auf dem Bildschirm, und öffnen Sie die Abdeckung.
    2. Entladen den Sequenzierung Chip von Chip Adapter mit behandschuhten Händen.
    3. Platzieren Sie den Chip in der Chip-Container, Rap mit Parafilm und Store bei 4 ° C bis die Sequenzierung Reaktion.
    4. Die Anreicherung Patrone, PCR Platte PCR Frame Dichtung, Erholung Rohr, Lösung Patrone und Reagenzkassette entfernt aus der entsprechenden Position des automatisierten Instruments mit behandschuhten Händen.
    5. Übertragen Sie eine Patrone leer-Tip auf die Abfälle Tipp-Position des automatisierten Instrument mit behandschuhten Händen.
    6. Tippen Sie auf [weiter] und schließen Sie die Abdeckung.
    7. Tippen Sie auf [Start] und reinigen Sie der automatisierten Instrument durch ultraviolette Strahlen für 4 min.
  6. Lösen Sie eine Natrium-Chlorit-Tablette in 1.000 mL Reinstwasser und Filter-Lösung mit einer Filtereinheit 0,22 µm Filter fließen.
    1. Schalten Sie das Instrument der Sequenzierung.
    2. Tippen Sie auf [Clean] und [weiter] auf dem Bildschirm des Gerätes Sequenzierung.
    3. Reinigen Sie die Sequenzierung Instrument mit 250 mL Filter sterilisiert Natrium-Chlorit-Lösung und anschließend 250 mL Reinstwasser.
  7. Berühren Sie [initialisieren] und wählen Sie das entsprechende Sequencing Kit auf dem Bildschirm.
    1. Installieren Sie einen grauen Versender an der entsprechenden Stelle mit behandschuhten Händen.
    2. Initialisieren Sie die Sequenzierung Instrument mit der Waschlösung (mitgelieferten), die pH-Anpassung-Lösung (mit 350 µL 100 mM Natriumhydroxid) und der pH-Standardlösung (mitgelieferten).
  8. Fügen Sie 20 µL dATP, dGTP, dCTP und dTTP Nukleotide (mitgelieferten) in 50 mL Röhrchen (sofern im Kit) mit einer 100 µL Pipette.
    1. Installieren Sie einen grauen Versender an der entsprechenden Stelle mit behandschuhten Händen.
    2. Laden Sie die 50-mL-Tube und Schraube auf die Sequenzierung Instrument.
    3. Tippen Sie auf [weiter] auf dem Bildschirm, um die Initialisierung Schritt zu beginnen, der dauert ca. 25 Minuten.
  9. Nach Abschluss den Initialisierung Schritt:
    1. Berühren Sie [Run] auf dem Bildschirm und wählen Sie die entsprechende Bibliothek Vorbereitung Instrument.
    2. Scannen Sie den zweidimensionalen Barcode des Chips.
    3. Stecken Sie die Sequenzierung Chip auf die gewünschte Position.
    4. Schließen Sie die Chip-Klemme und Instrument Tür.
    5. Berühren Sie [Chip überprüfen], [Next] und [OK] auf dem Bildschirm, um die Sequenzierung Lauf starten.
  10. Übertragen Sie nach der Sequenzierung Reaktion die Daten und Datenanalyse Pipeline für die Sequenzierung Server13,17ausführen.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt den gesamten Prozess von der Vorbereitung TIC Proben zur DNA-Extraktion. Insbesondere übernimmt die Prozedur nur zwei Tage genomischen DNA von TIC Proben zu erhalten. Wir bewerten alle Effekte der Tumor Lagerung vor der Verarbeitung der Folie. Wir fanden, dass Tumorzellen auf dem Objektträger befestigt wurden, wenn Gewebeproben sofort auf die Folie berührt wurden und Geweben in Kochsalzlösung befeuchtet steril-Gaze für 1 h (

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Diskussion

In dieser Studie haben wir eine alternative Methode für den Erhalt der Tumor DNA aus klinischen pathologischen Proben mit TIC vorgestellt. TIC-Zubereitung ist sehr einfach und benötigt weniger Zeit im Vergleich zu FFPE Methoden, ohne die Forderung nach speziellen Instrumenten10. Alle Verfahren von der TIC-Vorbereitung zur DNA-Extraktion können innerhalb von zwei Tagen (Abbildung 1) abgeschlossen werden. Diese Methode verkürzt somit die Turnaround-Zeit für die Durchfüh...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken allen medizinischen und Dienstpersonal des Krankenhauses und die Patienten für die Zustimmung zur Teilnahme. Wir bedanken uns bei Gabrielle White Wolf, PhD, Edanz-Gruppe (www.edanzediting.com/ac) für einen Entwurf des Berichts bearbeiten. Diese Studie wurde unterstützt durch eine Beihilfe für Genome Research Project aus der Präfektur Yamanashi (YH und M.O.) und einen Zuschuss von der YASUDA Medical Foundation (YH).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
FINE FROST weiß20 Mikro-ObjektträgerglasMatsunami Glass ind, LtdSFF-011
Arcturus PEN Membran Glas-ObjektträgerThermo Fisher ScientificLCM0522
Cyto Quick A LösungMuto Pure Chemicals20571
Cyto Quick B LösungMuto Pure Chemicals20581
May-Grunwald LösungMuto Pure Chemicals15053
Giemsa-LösungMuto Pure Chemicals15002
QIAamp DNA FFPE-GewebekitQiagen56404
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557
TaqMan RNase P Nachweisreagenzien-KitThermo Fisher Scientific4316831
TaqMan Assay aus FFPE DNA QC Assay v2Thermo Fisher Scientific4324034
MicroAmp Schnelle optische 96-Well-Reaktionsplatte Thermo Fisher Scientific4346907
MicroAmp optische KlebefolieThermo Fisher Scientific4311971
MicroMixer E36TITEC0027765-000
ViiA 7 Real-Time PCR SystemThermo Fisher ScientificVIIA7-03
Himac CF16RXIIHitachi-kokiCF16RII
Ionenbibliothek TaqMan QuantifizierungskitThermo FisherScientific 4468802
Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2Thermo FisherScientific 4475346
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0Thermo Fisher Scientific4480442
Ion Xpress Barcode-Adapter 1-16 KitThermo FisherScientific 4471250
Ion PGM Hi-Q View Sequenzierungskit (200 Basis)Thermo Fisher ScientificA30044
Ion Chef SystemThermo Fisher Scientific4484177
Veriti 96-Well-ThermocyclerThermo Fisher ScientificVeriti200
Ion 318 Chip Kit v2 BCThermo Fisher Scientific4488150
Ion PGM SystemThermo Fisher ScientificPGM11-001
Ion PGM Wash 2 Flaschen KitThermo Fisher ScientificA25591
Agencourt&Handel; AMPure&Handel; XP KitBeckman CoulterA63881
Magnetstativ mit 16 PositionenThermo FisherScientific 4457858
Antihaftbeschichtete, RNasefreie Mikrofuge-Röhrchen, 1,5 mL (Röhrchen mit geringer Bindung)Thermo FisherScientific AM12450
Nukleasefreies WasserThermo Fisher ScientificAM9938
MicroAmp Optische 96-Well-ReaktionsplattenThermo Fisher Scientific4306737
MicroAmp™ Durchsichtige KlebefolieThermo Fisher Scientific4306311
; AMPure&Handel; XP KitBeckman CoulterA63881
Ethanol (99.5)Nacalai Tesque08948-25
Natriumhydroxid (10M)Sigma72068
DTU-NeoTAITEC0063286-000
E-36TAITEC0027765-000
ECLIPSE Ci-LNikon704354
Pipet-Lite LTS Pipette L-2XLS+METTLER TOLEDO17014393
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+METTLER TOLEDO17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+METTLER TOLEDO17014392
Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+METTLER TOLEDO17014384
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+METTLER TOLEDO17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+METTLER TOLEDO17014382
Petit-Change:WAKENMODEL8864Mini-Zentrifuge
Petit-InkubatorWAKENWKN-2290Luft-Inkubator
SensiCare Puderfreie Nitril-UntersuchungshandschuheMEDLINESEM486802
Sterile GazeOsaki11138
Kühlschrank MediCoolSANYOMPR-312DCN-PJ
TRIMMING BLADFEATHERNr.130
FEATHER TRIMMING BLADFEATHERNo.260
FEATHER SFEATHERFA-10
Vortex Genius 3IKA41-0458Vortex Mixer
PincetteNATSUMEA-5
1,5 mL MikroröhrchenBIOBIKRC-0150
Agencourt&trade FEATHER

Referenzen

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