Methodenartikel

Kombination von Röntgen-Kristallographie mit kleinen Winkel Röntgenstreuung, unstrukturierte Regionen der Nsa1 aus S. Cerevisiae zu modellieren

DOI:

10.3791/56953

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10. Januar 2018

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1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Methode beschreibt die Klonen, Ausdruck und Reinigung von rekombinanten Nsa1 zur Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie und kleine Winkel Röntgenstreuung (SAXS) und gilt für die Hybrid-Strukturanalyse von anderen Proteinen mit beiden bestellt und Domänen ungeordnet.

Zusammenfassung

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Bestimmung der Struktur der Ribosom Versammlung Faktor Nsa1 von Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae) in voller Länge ist schwierig wegen der ungeordneten und Protease labil C-Terminus des Proteins. Dieses Manuskript beschreibt die Methoden um rekombinante Nsa1 aus S. Cerevisiae für Baustatik durch Röntgen-Kristallographie und SAXS zu reinigen. Röntgen-Kristallographie wurde eingesetzt, um die Struktur der wohlgeordneten WD40 N-terminale Domäne des Nsa1 zu lösen, und dann SAXS wurde verwendet, um die Struktur des C-Terminus des Nsa1 in Lösung zu beheben. Lösung Streuung Daten wurden von in voller Länge Nsa1 in Lösung. Die theoretische Streuung Amplituden wurden von der hochauflösenden Kristallstruktur des Geschäftsfeldes WD40 berechnet, und dann offenbart eine Kombination des steifen Körpers und ab-initio -Modellierung der C-Terminus des Nsa1. Durch diesen Hybridansatz wurde die quartäre Struktur des gesamten Proteins rekonstruiert. Die hier vorgestellten Methoden sollten in der Regel für die Hybrid-Strukturaufklärung anderer Proteine, bestehend aus einer Mischung aus strukturierten und unstrukturierten Domänen gelten.

Einleitung

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Ribosomen sind große Ribonucleoprotein Maschinen, die die wesentliche Rolle der Übersetzung von mRNA in Proteine in allen lebenden Zellen durchführen. Ribosomen bestehen aus zwei Untereinheiten, die in einem aufwändigen Verfahren bezeichnet Ribosom Biogenese1,2,3,4hergestellt werden. Eukaryotische Ribosom Versammlung stützt sich auf die Hilfe von Hunderten von wesentlichen ribosomale Montage Faktoren2,3,5. Nsa1 (Nop7 verbunden 1) ist ein eukaryotische Ribosom Versammlung-Faktor, der speziell für die Produktion der großen ribosomalen Untereinheit6erforderlich ist, und ist bekannt als WD-Wiederholung, 74 (WDR74) in höheren Organismen7enthält. WDR74 hat gezeigt, dass für die Blastozyste Bildung in Mäusen8erforderlich und der WDR74-Promoter ist häufig in Krebs Zellen9mutiert. Die Funktion und die genauen Mechanismen der Nsa1/WDR74 im Ribosom Versammlung sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Um zu beginnen, die Rolle der Nsa1/WDR74 während der Reifung eukaryotische Ribosom aufzudecken, wurden mehrere strukturelle Analysen durchgeführt, einschließlich Röntgen-Kristallographie und kleinen Winkel x-ray Scattering (SAXS)10.

Röntgen-Kristallographie, Kernresonanzspektroskopie (NMR), Elektronenmikroskopie und SAXS sind alle wichtigen Techniken für makromolekulare Struktur zu studieren. Größe, Form, Verfügbarkeit und Stabilität der Makromoleküle Einflüsse der Strukturbiologie Methode, für die ein bestimmtes Makromolekül wird am besten sein, geeignet, jedoch kombiniert mehrere Techniken durch einen sogenannten "Hybrid"-Ansatz ist immer ein immer vorteilhaft Werkzeug11. Insbesondere sind Röntgen-Kristallographie und SAXS kraftvoll und ergänzende Methoden zur Strukturaufklärung von Makromolekülen12.

Kristallographie bietet hochauflösende atomare Strukturen von kleinen Molekülen bis hin zu großen zellulären Maschinerie wie das Ribosom und führte zu zahlreichen Durchbrüchen in das Verständnis der biologischen Funktionen von Proteinen und anderen Makromoleküle13. Darüber hinaus nutzt Struktur basierende Wirkstoff-Design die Kraft der Kristallstrukturen zum molekularen Andocken von Berechnungsmethoden, Droge-Entdeckung und Entwicklung14eine kritische Dimension hinzuzufügen. Trotz seiner breiten Anwendbarkeit sind flexibel und ungeordneten Systeme schwer zu beurteilen von Kristallographie da Kristall Verpackung behindert kann oder Elektron Dichte Karten möglicherweise unvollständig oder von schlechter Qualität. Umgekehrt ist SAXS ein lösungsorientierter und mit niedriger Auflösung struktureller Ansatz in der Lage, flexible Systeme, die ungeordneten Schlingen und Termini bis hin zu intrinsisch ungeordneten Proteine12,15,16, zu beschreiben. Wenn man bedenkt, dass es kompatibel mit einer breiten Palette von Teilchen Größen12, kann SAXS synergistisch arbeiten mit Kristallographie, biologische Fragestellungen erweitert, die durch strukturelle Studien behandelt werden können.

Nsa1 eignet sich für ein Hybrid-strukturellen Ansatz, denn es enthält eine gut strukturierte WD40 Domäne gefolgt von einer funktionalen, aber flexible C-Terminus nicht Röntgen-Kristallographie Methoden zugänglich ist. Es folgt ein Protokoll für das Klonen, Ausdruck und Reinigung von S. Cerevisiae Nsa1 für Hybrid Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie und SAXS. Dieses Protokoll kann angepasst werden, um die Strukturen von anderen Proteinen zu studieren, die aus einer Kombination von geordneten und ungeordneten Regionen bestehen.

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Protokoll

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(1) rekombinante Protein-Produktion und Reinigung des Nsa 1

  1. Nsa1 Expression Plasmid Design und Klonen
    1. Erhalten oder S. Cerevisiae genomischen DNA zu kaufen.
    2. PCR verstärken die Zielsequenzen Nsa1 (Nsa1FL, Rückstände 1-463) und C-terminalen abgeschnitten Nsa1 (Nsa1ΔC, Rückstände 1-434) mit entsprechenden Grundierungen mit genomische DNA isoliert von S. Cerevisiae und eine Schmelztemperatur von ca. 60 ° C mit einer Verlängerung von 1-2 min. Die folgenden Primer wurden benutzt, um Nsa1 zu verstärken:
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGCGC
      SC_Nsa1ΔcFw:GGGCGCCATGGGATCCATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGG
      SC_Nsa1ΔcRv: GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAACCTTCCTTTTTTGCTTCCC
    3. Nsa1 in der Escherichia coli (E. Coli) Ausdruck Vektor pHMBP mit einer N-terminalen subclone 6 X-Histidin-Tag gefolgt von Maltose Binding Protein (MBP) und eine Tabak Etch Virus (TEV) Protease-Website mit standard Klonierungstechniken17 .
    4. Verwenden Sie DNA-Sequenzierung, um sicherzustellen, dass Nsa1 im Frame mit dem N-terminalen seine MBP Tag geklont wurde.
  2. Nsa1 Protein-Expression
    1. Der Ausdruck Plasmid(s) verwandeln sich in eine geeignete E. Coli Ausdruck-Sorte mit einem T7 Promotor-basierten System. Die Transformanten auf LB-Agar-Platten mit 100 µg/mL Ampicillin Teller und die Platte umgedreht über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    2. Impfen Sie eine 50 mL-Kultur der LB mit 100 µg/mL Ampicillin aus der Transformation-Platte zu, und wachsen Sie es über Nacht mit Schütteln bei 200 u/min bei 37 ° C.
    3. Impfen Sie 3 x 1000 mL LB in Fernbach Fläschchen mit 100 µg/mL Ampicillin mit 15 mL der Übernacht-Kultur zu und wachsen sie mit Schütteln bei 200 u/min bei 37 ° C.
      Hinweis: Für Proteinlösung Struktur, Selenomethionyl (SeMet) Aufnahme lässt sich durch die wachsende Zellen in M9 minimaler Medium, der mit SeMet und eine Mischung der Aminosäure Methionin-Produktion vor der Induktion, im Gegensatz zu LB Medien zu hemmen ergänzt wird 18.
    4. Ausdruck der Nsa1 erreicht die OD600 ~0.8 durch Zugabe von Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG) auf eine Endkonzentration von 1 mM, gefolgt von Inkubation bei 25 ° C über Nacht mit Schütteln bei 200 u/min zu induzieren.
    5. Ernten Sie Zellen durch Zentrifugation bei 4 ° C für 15 min bei 5.050 x g.
      Hinweis: Zellen können langfristige bei-80 ° C gelagert oder sofort für Proteinreinigung verwendet werden.
  3. Nsa1 Proteinreinigung
    1. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in 25 mL Lyse-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10 % Glycerin, 10 mM MgCl2) vorab gekühlt bei 4 ° C mit einer EDTA-freie Protease Inhibitor Tablette.
    2. Lyse der Zellen durch Ultraschallbehandlung bei 4 ° C (7 min., 2 s auf Zyklus 2 s off-Zyklus; Amplitude: 70 %).
    3. Klären Sie lysate durch Zentrifugation bei 26.900 x g 45 min bei 4 ° C.
    4. Wenden Sie auf eine Schwerkraft fließen Spalte geladen mit 10 mL der immobilisierten Kobalt Affinität Harz lysate geklärt, vorab mit Lysis Puffer equilibriert an.
    5. Ermöglichen des Überstands übergehen das Harz durch Schwerkraft bei 4 ° C und waschen Sie das Harz zweimal mit 100 mL Lyse-Puffer.
    6. Eluieren Sie Nsa1 mit 20 mL Elution Buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 % Glycerin und 200 mM Imidazol).
    7. Nehmen Sie 15 μl Eluat und führen Sie es auf einem 4-15 % SDS-PAGE Gel um sicherzustellen, dass das Protein aus dem Harz Affinität (Abbildung 1A) eluiert wird.
    8. Entfernen Sie das MBP-Tag von TEV Protease Verdauung. Die Nsa1 Affinität Harz Elution 1 mL der TEV Protease19 (1 mg/mL Brühe) hinzufügen und es über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
    9. Konzentrat MBP gespalten Nsa1, ~ 5 mL mit einem zentrifugalen Filter mit einem Molekulargewicht abgeschnitten 10 kDa.
    10. MBP gespalten Nsa1 anwenden um eine Gel-Filtration-Spalte equilibriert vorab im Puffer einen (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 5 % Glycerin und 1 mM β-Mercaptoethanol) (Abbildung 1 b).
    11. Analysieren Sie Spalte Fraktionen aus Gel Filtration um sicherzustellen, dass MBP ist gespalten und vom Nsa1 getrennt durch 15 μl Proben auf ein 4-15 % SDS-PAGE Gel (Abbildung 1 b) ausgeführt.
    12. Kombinieren Sie Brüche mit Nsa1 und bis 8 mg/mL mit einem zentrifugalen Filter mit einem Molekulargewicht von 10 kDa abgeschnitten zu konzentrieren.
    13. Konzentration des Proteins zu bestimmen, durch Messung der Absorption bei 280 nm auf einem Spektrophotometer mit dem Aussterben Koeffizient 42530 M–1cm–1. Verwenden Sie Protein für proteolytischen Screening und Kristallisation Versuche sofort.

2. Kristallisation und proteolytischen Screening der Nsa 1

  1. Sparse Matrix Crystal Screening von Nsa1
    1. Zentrifugieren Sie 500 μL des 8 mg/mL Bestandes an Nsa1 bei 16.000 x g bei 4 ° C für 10 min.
    2. Setup-Kristallisation Studien unter Verwendung einer Kristallisation Roboter und dünnbesetzte Matrix Kristall Bildschirme. Füllen Sie das Reservoir von 96 gut Tabletts mit 30 µl der einzelnen Kristalls Bildschirm Reagenzien aus dünnbesetzte Matrix Kristallisation Bildschirme. Setup-Sitzung Tropfen mit dem Roboter durch das Mischen von 250 nL der gut Lösung mit 250 nL die Proteinlösung.
    3. Versiegeln Sie die Kristallisation Platten mit Klebeband und inkubieren sie bei 25 ° C.
    4. Prüfen Sie die Platten alle zwei Tage für die ersten 2-3 Wochen mit einem Stereomikroskop.
    5. Vergewissern Sie sich, dass potenzielle Kristalle Hits Protein, mit einem UV-Mikroskop enthalten.
      Hinweis: Für zwei verschiedene Kristallformen Nsa1 (kubisch und orthorhombic, Abb. 2A) wurden innerhalb von 1 Woche von den folgenden Bildschirmen erhalten: JCSG + Zustand B11 (1,6 M Natriumcitrat tribasic entwässern, pH 6,5) und Assistenten Fällungsmittel Synergie Bildschirm Block 2 Zustand der C11 (20.1%(v/v) PEG 1500, 13.4%(v/v) PEG 400, 0,1 M Tris HEPES/Natriumhydroxid, pH 7,5).
  2. Proteolytischen Screening
    Hinweis: Während der Kristallisation Optimierung entdeckte man, dass die orthorhombic Kristalle Nsa1 durch proteolytische Spaltung entstand und die Kristalle nicht dupliziert werden konnte, über das Full-length-Protein. Mit einer Kombination von begrenzter Proteolyse gekoppelt mit Massenspektrometrie, wurde festgestellt, dass der C-Terminus des Nsa1 empfindlich gegen Proteolyse war und Entfernung der C-terminalen Schwanz für die spätere Wiedergabe des orthorhombic Kristall Form (erforderlich war Nsa1ΔC).
    1. Bereiten Sie 1 mg/mL Protease Stammlösungen der folgenden Proteasen α-Chymotrypsin, Trypsin, Elastase, Papain, Subtilisin und Endoproteinase Glu-C.
    2. 01:10, 1: 100 und 1: 1000 Verdünnung von 1 mg/mL Protease bestand mit Verdünnungspuffer (10 mM HEPES, pH 7.5, 500 mM Natrium-Chlorid) erstellen.
    3. Pipette 1 μl Protease-Lager (01:10, 1: 100 und 1: 1000) in 9 μl-Aliquots des Proteins (1 mg/mL) für jeden Protease untersucht werden.
    4. Inkubieren Sie die Lösung bei 37 ° C für 1 h.
    5. Die Reaktion durch Zugabe von 10 μl 2 X SDS-PAGE Probenpuffer zu stoppen und die Reaktion bei 95 ° C für 5 min erhitzen.
    6. Analysieren Sie die Übersichten auf einer 4-15 % SDS-PAGE Gel (Abb. 2 b) ausgeführt.
    7. Identifizieren Sie Protease-resistent Domänen des Zielproteins durch Massenspektrometrie in Gel Analyse.
    8. Das Zielprotein entfernen Sie Protease-labile Regionen indem man abgeschnittene Ausdruck Konstrukte und nach dem Klonen, Ausdruck und Reinigung Protokoll beschriebenen.
  3. Kristallisation Optimierung
    1. Vorzubereiten oder zu erhalten Stammlösungen der folgenden ersten Kristallisation Reagenzien: 1,6 M Natriumcitrat tribasic zu entwässern, pH 6,5, 100%(v/v) PEG 400, 50%(v/v) PEG 1500, 1 M HEPES/Natriumhydroxid pH 7,5.
    2. Bereiten Sie eine Stammlösung Nsa1FL und Nsa1ΔC 8 mg/ml, wie oben beschrieben.
    3. Optimieren Sie die Nsa1 kubische Kristalle (Nsa1FL).
      1. Bereiten Sie eine 24-Well-Rasterbildschirm mit Brunnen mit 500 µL mit einem Gefälle von 1-1, 6 M von Natriumcitrat mit pH 6,5 aus einer Stammlösung von 1,6 M Natriumcitrat tribasic mit pH 6,5.
      2. Mix 1 µL Protein mit 1 µL gut Lösung und die Mischung in eine silikonisierte Abdeckung Folie. Sorgfältig ist invertieren die Abdeckung Folie auf der Oberseite der vorgeschmiert gut und stellen sie sicher gut versiegelt, aber achten Sie darauf, nicht stören die Tropfen oder brechen die Titeldia. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der Behälter voll ist und dann bei 25 ° c lagern
        Hinweis: Kleine kubische Kristalle sollte in 2-7 Tagen angezeigt werden.
      3. Bereiten Sie einen Microseed bestand der kubische Kristalle. Verwenden Sie eine montierte Nylon-Schleife, ~ 10 kleine kubische Kristalle auf einem 1,5 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen, enthält eine kleine Perle und 50 µL 1,6 M Natriumcitrat tribasic Wit pH 6,5 zu übertragen.
      4. Vortex 1,5 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen mit hoher Geschwindigkeit (~ 3000 u/min) für 1 Minute.
      5. Machen Sie eine Reihe von 10-divisibel serielle Verdünnungen von Saatgut mit 1,6 M Natriumcitrat tribasic und Wirbel die Mischung gründlich für 5 s.
      6. Füllen Sie jeweils auch von einer 24-Well-Gitter, Bildschirm mit 500 µL 1,6 M Natriumcitrat tribasic pH 6,5.
      7. Optimieren Sie die Microseeding Bedingungen, durch die Einrichtung von Tropfen mit unterschiedlichen Verhältnissen von Protein mit den Saatgut-Lösungen (Abbildung 3A). Größere kubische Kristalle von hohen Beugung Qualität erscheint in 2-5 Tagen (Abbildung 3).
    4. Optimieren Sie die orthorhombic Kristalle (Nsa1ΔC)
      1. Bereiten Sie einen Rasterbildschirm mit 500 µL in jede Vertiefung mit 24 unterschiedlichen Bedingungen (Abb. 3 b) aus Stammlösungen 50%(v/v) PEG 1500 und 100%(v/v) PEG 400. Neben Steigungen von PEG 1500 und PEG 400 sollte jeder gut auch 0,1 M HEPES/Natrium Hydroxid pH 7,5 enthalten.
      2. Mischen Sie 1 µL Proteinlösung mit 1 µL gut Lösung auf einer Folie silikonisierte Abdeckung. Invertieren die Abdeckung Folie auf der Oberseite der vorgeschmiert gut und stellen sie sicher ist sorgfältig gut abgedichtet. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gesamte Schale gefüllt worden ist. Speichern Sie die Tabletts bei 25 ° C.
        Hinweis: Nsa1 orthorhombic Kristalle sollte in 2-7 Tagen angezeigt werden.
      3. Weiter optimieren die orthorhombic Kristalle von Microseeding wie beschrieben für die kubische Kristalle (Schritte 2.3.3.3, 2.3.3.7) mit 500 µL 20.1%(v/v) PEG 1500, 13.4%(v/v) PEG 400 und 0,1 M HEPES/Natrium Hydroxid pH 7,5 als gut Lösung.
        Hinweis: Nsa1 SeMet Kristalle sollte analog zu den Einheimischen Kristallen optimiert werden.

(3) x-ray Diffraction Datenerhebung und Nsa 1 Struktur Lösung

  1. Cryo-Schutz von Kristallen und x-ray Diffraction Datenerfassung
    1. Für die orthorhombic Kristalle (Nsa1ΔC), bereiten Sie eine 1 mL Kryoprotektivum Lösung mit 22.5%(v/v) PEG 1500, 15%(v/v) PEG 400 und 0,1 M HEPES/Natrium Hydroxid pH 7,5.
    2. Füllen Sie einen Schaum Dewar mit flüssigem Stickstoff, und kühlen Sie einen Kristall Puck vor. Vorsicht beim Arbeiten mit flüssigem Stickstoff und Schutzhandschuhe und Schutzbrille tragen.
    3. Sorgfältig zu invertieren Titeldia der Kristallisation gut mit Kristallen auf der Bühne ein Stereomikroskop.
    4. Pipette 2 µL der Kryoprotektivum Lösung in eine neue Abdeckung Folie.
    5. Legen Sie eine montierte Nylon-Schleife der entsprechenden Größe für den Kristall auf einen magnetischen Cryo-Zauberstab.
    6. Übertragen Sie einen Kristall mit Hilfe von Stereomikroskop, schnell auf die Kryoprotektivum Lösung mit der montierten Cryo-Schleife werden.
    7. Lassen Sie den Kristall für 5 min in die Kryoprotektivum Lösung equilibrate.
    8. Schleife mit Hilfe von Stereomikroskop, schnell den Kristall aus dem Kryoprotektivum Lösung und Sprung-Einfrieren in flüssigem Stickstoff.
    9. Warten auf den flüssigen Stickstoff um den Loop zu stoppen, Kochen und lassen Sie dann die Schleife aus dem Zauberstab in eine bestimmte Position innerhalb der Kristall Puck.
    10. Kubische Nsa1FL Kristalle müssen nicht Cryoprotected werden und kann direkt Blitz eingefroren werden (folgende Schritte 3.1.8-3.1.9 oben).
    11. Den Kristall Puck mit Cryo-Tools zu versiegeln und transfer zum Versand Stock in einem vorgekühlt Dewar. Lagern Sie Kristalle bis zur Datenerhebung in der Pucks/Dewars.
    12. Wenn bei einem Synchrotron Datenerfassung, Schiff Kristalle, um das Synchrotron mit einen trockenen Versender.
    13. X-ray Diffraction Datenerhebung nach Standardtechniken20.
      Hinweis: Für Nsa1 Native und SAD (Einzel-Wellenlänge anomalen Dispersion) Datensätze bei 100 K auf der SER-CAT Strahllinien 22-ID und 22-BM von der Advanced Photon Source am Argonne National Laboratory (Chicago, IL) sammelten. Die SAD Nsa1 Dataset war gesammelt um λ = 0.97911 Å. Daten wurde mit einem 1 s Belichtungszeit und 0,5 ° Schwingungen aufgenommen. Die Mosaicity dieser Kristalle war in der Regel um 0,3 °.
    14. Verarbeiten Sie und skalieren Sie die x-ray Diffraction Bilder um Reflexion Dateien für jeden Datensatz in der entsprechenden Gruppe zu generieren.
      Hinweis: Nsa1 Beugung Datensätze verarbeitet wurden mit HKL200021. Die Nsa1 kubische Kristalle wurden in den Raum Gruppe P213 verarbeitet und orthorhombic Kristalle wurden in den Raum Gruppe P212121verarbeitet.
  2. Nsa1 Struktur Lösung.
    Hinweis: Es gibt mehrere Kristallographie-Software-Pakete, die verwendet werden können, zu lösen und zu verfeinern Kristallstrukturen einschließlich Phenix und CCP422,23. Es folgt das Protokoll für Nsa1 Struktur Lösung unter Verwendung der Phenix Software Suite22.
    1. Analysieren Sie die Native und SAD skaliert Datasets mit phenix.xtriage22.
    2. Lösen Sie die Struktur der Nsa1 mit Phenix.autosol mit den traurigen Höhepunkt Reflexion Datei22,24. Um das Programm von AutoSol auszuführen, geben Sie die Nummer von Selenomethionin Websites (Websites = 9), die Fasta Sequenz Datei Nsa1ΔC, und die traurigen Datenerhebung verwendete Wellenlänge (λ = 0.97911 Å).
      Hinweis: Aus dem Dataset Nsa1 SAD phenix.autosol sollte in der Lage, die experimentelle Phasen zu bestimmen und die meisten des Modells zu bauen.
    3. Anpassungen Sie manuelle auf das Modell mit Blässhuhn25, gefolgt von Verfeinerung in der phenix.refine22,26.
    4. Lösen Sie die Struktur der hochauflösenden native orthorhombic Kristall und der kubischen Kristall durch molekulare Ersatz mit Phaser27,28.
    5. Nach erfolgreichen Struktur Lösung, zu untersuchen, das Modell und die Elektronendichte Karte Blässhuhn25.
    6. Erstellen Sie und verfeinern Sie die Strukturen durch iterative Runden der Verfeinerung in phenix.refine22,26 und Modellbau in Blässhuhn25ausgeführt.

4. SAXS Datenerhebung, Verarbeitung und Modellierung

  1. SAXS Datenerfassung
    Hinweis: SAXS Datenerfassung wurden für Full-length S. Cerevisiae Nsa1 bei Advanced Light Source, auf das Hochdurchsatz-SIBYLLEN Strahlrohr 12.3.1 am Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA29.
    1. Reinigen Nsa1FL nach dem oben beschriebenen Protokoll. 24 h vor dem Versand der Nsa1FL um das Strahlrohr, Überfahren einer Gel-Filtration-Spalte Protein equilibriert bereits im Puffer A.
    2. Pool mit Nsa1 Brüche und Konzentration des Proteins zu bestimmen, wie oben beschrieben.
    3. Bereiten Sie 30 µl-Aliquots einer Konzentration-Reihe von Nsa1 von 1 bis 6,2 mg/mL mit Puffer A. vor
    4. Übertragen Sie 20 μl jeder Konzentration Serie von Nsa1 auf eine klare voller Rock 96 gut Mikrotestplatte zusammen mit Puffer A allein Steuerelemente.
      Hinweis: Auf verdünnten Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen von gereinigten Probe, um Aggregation, Abstoßung zwischen Teilchen und Strahlung Beschädigung Effekte zu vermeiden ist SAXS Daten erhoben.
    5. Versiegeln Sie die Mikrotestplatte mit Silikon abdichten, Matte und Schiff über Nacht bei 4 ° C das Strahlrohr.
    6. Bis zur Datenerhebung lagern Sie Mikrotestplatte bei 4 ° C.
    7. Unmittelbar vor der Datenerhebung drehen Sie die Platte bei 3200 X g für 10 min bei 4 ° C zu entfernen mögliche Aggregate und Luftblasen.
    8. SAXS Datensatzdaten.
      Hinweis: Für Nsa1, SAXS Daten für den Puffer vor und nach jedem Protein Konzentrationsreihe verzeichneten. Dreiunddreißig aufeinander folgende Scans von 0,3 s wurden für Nsa1 gesammeltFL über eine Konzentrationsreihe (1 bis 6,2 mg/mL) bei 10 ° C.
    9. Durchführen Sie Puffer Subtraktion für SAXS Daten.
      Hinweis: Für Nsa1 Puffer Subtraktion erfolgte automatisch an das Strahlrohr aber Puffer Subtraktion kann auch durchgeführt werden, mit Daten-Reduktion-Software wie Scatter30 und die ATSAS Suite31. Puffer-Subtraktion ist ein wichtiger Bestandteil der SAXS Datenanalyse und muss darauf geachtet werden, um sicherzustellen, dass der Puffer verwendet, für die Subtraktion der Protein-Probenpuffer identisch ist.
    10. Durchschnittliche scannt in Folge 33 um eine *ave.dat-Datei für jede Konzentration zu erstellen.
      Hinweis: Overlay 33 aufeinanderfolgenden Rahmen um die Kurven zu vergleichen. Änderungen an der Streuung Kurven im Laufe der Zeit zeugt oft von Strahlenschäden. Diese Frames von durchschnittlich ausschließen. Mittelung der Nsa1 aufeinander folgende Scans wurde automatisch an die SIBYLLEN Strahlrohr durchgeführt.
  2. SAXS Datenverarbeitung und Vergleich der Konzentrationsreihe
    Hinweis: Es gibt mehrere Software-Pakete, die SAXS Datenanalyse verwendet werden können. Für Nsa1 der Radius der Drehung und paarweisen Abstand Verteilungsfunktionen wurden anhand PRIMUS32 und Gnom33 aus der ATSAS 2.7.2 Suite31 und über alle Proteinkonzentrationen sicherzustellen, gab es keine Strahlung im Vergleich Schäden oder Konzentration abhängig Inter Teilchenwechselwirkungen10.
    1. Öffnen Sie eine terminal Shell und gehen Sie zum Verzeichnis mit den SAXS-Daten.
    2. Die PRIMUS32 GUI von innerhalb der terminal-Shell zu starten.
    3. Die PRIMUS-GUI, laden die Streuung Kurven (* ave.dat).
    4. Verwenden Sie AutoRg Radius of Gyration (Rg) ermitteln und weiterleiten Streuung Intensität I(0), für jede Kurve Streuung (* ave.dat).
    5. Kratky Grundstücke für jede Kurve Streuung zu generieren (* ave.dat), um den Grad der Kompaktheit zu bewerten.
    6. Verwenden von AutoGNOM33 die paarweisen Verteilungsfunktion berechnen (auch P(r)) genannt, für jede Kurve Streuung (* ave.dat). Geben Sie eine Start Dmax ≈ 3 * Rg und optimieren den D-max -Wert um eine glatte P(r)-Kurve zu erhalten. Sicherstellen Sie bei der Optimierung der D-max, dass die berechneten P(r) Funktion der experimentellen Streuung Kurve entspricht durch die Überprüfung des gemeldeten χ2 -Wert und visuell beurteilen die gesamte Streuung Kurve passen.
    7. Berechnen Sie das Molekulargewicht des Nsa1 aus der Streuung Kurven über das Volumen der Korrelation34.
    8. Vergleichen Sie die strukturellen Parameter für jede Konzentration um sicherzustellen, dass es keine Strahlenschäden oder Konzentration-abhängige Effekte gibt.
      Hinweis: Konzentration Effekte manifestieren können als eine zunehmende Rg und Dmax in Bezug auf eine zunehmende Konzentration des Proteins. Nach vorn Streuung I(0) geteilt durch die Probenkonzentration sollte auch über die Protein-Konzentration-Serie konstant bleiben.
  3. SAXS Modellierung
    Hinweis: Bestimmen Sie die Position der C-Terminus des Nsa1FL, Nsa1 Kristall Struktur10 (PDB 5SUM) und die Streuung Kurven SAXS dienten, eine Kombination aus steifen Körper und ab-initio Modellierung, mit den Programmen Haufen durchzuführen 35 und Ensemble Optimierung Methode (EOM)36 vom ATSAS Software Suite31. WD40 Bereich Nsa1 wurde als starrer Körper behandelt, während der C-Terminus des Nsa1 sowie mehrere ungeordneten Schleifen aus der Domäne WD40 wurden modelliert, um die experimentellen SAXS Daten passen.
    1. Die Eingabe PDB-Dateien zu generieren. Die PDB-Datei muss geteilt werden, jedes Mal, wenn Rückstände sind von der Hauptkette fehlt und die PDB-Datei nicht enthalten mehrere Konformationen, Liganden, oder Wassermoleküle.
    2. Führen Sie das Programm Pre_BUNCH35 vorzubereiten die Eingabe PDB-Datei für Bündel (pre_bunch.pdb). Geben Sie die Sequenz des Zielproteins (*.seq), die Anzahl der Domänen/PDBs in 4.3.1, generiert und jeweils die einzelnen PDB-Dateien erzeugt oben.
    3. Berechnen Sie die Streuung Amplituden für jede einzelne PDB-Datei mit dem Programm CRYSOL37. CRYSOL Eingabe der einzelnen PDB-Datei und der experimentellen SAXS Streuung Kurve (*.dat) ausgeführt. Dies erzeugt eine Amplituden-Datei (* .alm).
    4. Führen Sie das Programm Haufen35 WD40 Bereich Nsa1 gegen die SAXS-Daten mit einem kombinierten starre Körper und ab-initio -Ansatz zu modellieren. Geben Sie die PDB-Datei von Pre_BUNCH (pre_bunch.pdb), der experimentellen SAXS Streuung Kurve (*.dat) und die einzelnen Amplitude (* .alm) Dateien für jede partielle PDB-Datei, die durch CRYSOL erzeugt.
    5. Vergleichen Sie den χ2 -Wert aus der Ausgangspunkt PDB (5SUM) mit, dass aus dem ab-initio -Modell von Haufen mit den experimentellen SAXS-Daten generiert.
      Hinweis: Ein Erfolgsmodell Haufen sollte einen deutlich geringeren χ2 Wert als Ausgangspunkt Modell haben. Die theoretische Streuung des Modells Haufen sollte auch gut die experimentellen Daten beschreiben wie visuelle Inspektion der Überlagerung zwischen der theoretischen Streuung des Modells Haufen auf die SAXS Daten und Nutzwert χ2 (Abbildung 4, beurteilt Zentrum-Pipeline).
    6. Manuell überprüfen Sie die Ausgabedateien von Haufen Pymol38 , die Kristallstruktur mit dem Modell erzeugte Bündel und die SAXS Umschlag (Abbildung 4, Mitte Rohrleitung) zu überlagern.
    7. Reihe 10 - 20 Mal erneut generieren unabhängige Modelle um zu bestätigen, dass die Modelle ähneln.
      Hinweis: Für Nsa1 gab es eine Reihe von χ2 Werte von ~ 1 bis 3 von 20 unabhängigen läuft.
    8. Ensemble-Modellierung
      Hinweis: als optionale Annäherung an Haufen ausführen, EOM36 oder minimale Ensemble Suche39 (MES). EOM und MES verwenden Ensemble Ansätze, die für Proteine mit flexiblen Domänen/Regionen gut geeignet sind, die in mehreren Konformationen sind.
      1. Führen Sie das Programm EOM36 über den ATSAS Online-Server. EOM ausführen, geben Sie die PDB-Dateien von 4.3.1, die Reihenfolge der das Zielprotein (*.seq) und die Versuchsdaten SAXS (*.dat).
      2. Vergleichen Sie die χ2 Werte aus den Start PDB (5SUM) mit, die aus dem Ensemble von EOM anhand der experimentellen SAXS-Daten generiert.
        Hinweis: Eine erfolgreiche EOM Ensemble sollte einen deutlich geringeren χ2 Wert als Ausgangspunkt Modell haben. Die theoretische Streuung des Ensembles sollten auch gut die experimentellen Daten beschreiben wie beurteilt Sichtprüfung der Überlagerung zwischen der theoretischen Streuung des Ensembles zu den SAXS Daten und Nutzwert χ2 (Abbildung 4, rechts Pipeline). Man sollte auch die χ2 Werte aus Haufen und EOM, um festzustellen, welches Modell am besten beschreibt die Versuchsdaten SAXS vergleichen.
      3. Manuell überprüfen der EOM Konformere Pymol38 um die Kristallstruktur Überlagerung mit den Umformer erzeugt durch EOM (Abbildung 4). Beachten Sie die Gesamtzahl der Umformer und der Anteil der Belegung für jede Anpassungsvorrichtung, die zur Streuung Kurve beiträgt. Für starre Moleküle, wie zum Beispiel Nsa1, die Anzahl der Umformer sollte klein sein (1-5) (Abbildung 4, richtige Pipeline)36.
      4. Re-run EOM mehrmals, um konsistente Ergebnisse zu gewährleisten.
        Hinweis: Für Nsa1 war die Zahl der Umformer in der Regel 3 bis 4 mit χ2 Werte im Bereich von 0,1 bis 0,3.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nsa1 war PCR verstärkt aus S. Cerevisiae genomischer DNA und subcloned in einen Vektor mit einer N-terminalen 6 X-Histidin Affinität Tag gefolgt von MBP und ein TEV Protease-Website. Nsa1 verwandelte sich in E. Coli BL21(DE3) Zellen und hohe Erträge der Proteinexpression wurden nach Induktion mit IPTG und Wachstum bei 25 ° C über Nacht (Abb. 1A). Nsa1 war Affinität auf immobilisierte Kobalt Affinität Harz, gefolgt von MBP Spaltung mit TEV Pr...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unter Verwendung dieses Protokolls, wurde rekombinante Nsa1 aus S. Cerevisiae für strukturelle Studien durch Röntgen-Kristallographie und SAXS generiert. Nsa1 war brav in Lösung und in mehreren Kristallformen kristallisiert. Bei der Optimierung dieser Kristalle entdeckte man, dass der C-Terminus des Nsa1 empfindlich auf Protease-Abbau war. Die hohe Auflösung, orthorhombic Kristallform konnte nur mit C-terminale abschneiden Varianten der Nsa1, wahrscheinlich dupliziert werden, weil der flexible C-Terminus des Nsa...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beugung im Südosten regionale kooperative Zugriffsteam (SER-CAT) 22-ID und 22-BM Beamlines an der Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory Daten. Die SAXS Daten wurden auf die SIBYLLEN Strahlrohr im Voraus Licht Quelle (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Wir möchten den Mitarbeitern bei der SIBYLLEN Strahlrohr für ihre Hilfe bei remote-Datenerfassung und-Verarbeitung danken. Wir sind dankbar für die National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Mass Spectrometry Forschung und Selbsthilfegruppe für Hilfe bei der Bestimmung der Protein-Domänengrenzen. Diese Arbeit wurde durch das uns nationale Institute der Gesundheit intramuralen Forschungsprogramm unterstützt; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) (ZIA ES103247, R. E. S.) und den kanadischen Institutes of Health Research (CIHR, 146626, M.C.P). Verwendung der APS wurde unterstützt durch das US Department of Energy, Office of Science, Büro der grundlegenden Energiewissenschaften unter Vertragsnr. W-31-109-DEU-38. Verwendung von Advanced Light Source (ALS) wurde unterstützt durch die Direktor des Office of Science, Büro von Energie Grundlagenwissenschaften, des US-Department of Energy unter Vertragsnr. DE-AC02-05CH11231. Zusätzlicher Unterstützung für die SIBYLLEN SAXS Strahlrohr kommt aus dem National Institute of Health Projekt MINOS (R01GM105404) und eine High-End-Instrumentierung Grant S10OD018483. Wir möchten auch Danke Andrea Moon und Dr. Sara Andres für ihre kritischen Lektüre des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Molecular Cloning of Nsa1
pMBP2 parallelvector Sheffield et al., Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999)Wir verwendeten eine modifizierte Version von pMBP2, die einen N-terminalen His-Tag (pHMBP)
S. cerevisiae genomische DNAATCC204508D-5
Primer für die Klonierung von Nsa1
SC_Nsa1_FLFwIDTCGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRvIDTAATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFwIDTGGGCGCCATGGGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRvIDTGATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Rekombinante Proteinproduktion und Reinigung von Nsa1
Star CellsInvitrogenC601003
pMBP-NSA1 und verschiedene TrunkierungenLo et al., 2017
SelenomethioninMolecular DimensionsMD12-503B
IPTG, DioxanfreiPromegaV3953
EDTA-freier Proteasehemmer CocktailSigma-Aldrich4693159001
NatriumchloridCaledon Laborchemikalien7560-1-80
Magnesiumchlorid-HexahydratSigma-AldrichM2670
Tris-Puffer, 1 m pH7,5KD MedicalRGF-3340
GlycerinInvitrogen15514-029
Beta-MercaptoethanolSigmaM6250
1M Imidazol, pH 8,0TeknovaI6980-06
Talon Affinity ResinClonetech635503
Amicon Ultra 15 mL Zentrifugalfilter (MWCO 10K)MilliporeUFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Gel in Vorbereitungsqualität FiltrationssäuleGE-Healthcare28989335
TEV-ProteaseHergestellt von NIEHS Protein Expression CoreExpression Plasmid bereitgestellt von NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein GelsBioRad456-8056
Kristallisation, Proteolytisches Screening
KristallsiebHampton ResearchHR2-110
Kristallsieb 2Hampton ResearchHR2-112
Salz RxHampton ResearchHR2-136
IndexsiebHampton ResearchHR2-144
PEG/IonensiebHampton ResearchHR2-139
JCSG+Molekulare AbmessungenMD1-37
Wizard Precipitant SynergyMolecular DimensionsMD15-PS-T
Swissci 96-Well 3-Drop UVP Sitz-Drop-PlattenTTP Labtech4150-05823
3 Zoll breites kristallklares DichtungsbandHampton ResearchHR4-506
Proti-Ace KitHampton ResearchHR2-429
PEG 1500Molekulare AbmessungenMD2-100-6
PEG 400Molekulare AbmessungenMD2-100-3
HEPES/Natriumhydroxid pH 7,5Molekulare AbmessungenMD2-011-Natriumcitrat
tribasischMolekulare AbmessungenMD2-100-127
22 mm x 0,22 mm Silikonisierte DeckfolienHampton ResearchHR3-231
24-Well-Platten mit Dichtmittel (VDX Platte mit Dichtungsmittel)Hampton ResearchHR3-172
18 mM montierte Nylonschlaufen (0,05 mm bis 0,5 mM)Hampton ResearchHR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Rocaille-SetHampton ResearchHR2-320
Magnetische KristallkappenHampton ResearchHR4-779
Magnetischer Kryo-ZauberstabHampton ResearchHR4-729
Kryo-Schaum DewarHampton ResearchHR4-673
Crystal Puck SystemMiTeGenM-CP-111-021
Full Skirt 96 Well Clear PlateVWR10011-228
AxyMat DichtungsmatteVWR10011-130
Equipment
UVEX-mJAN Scientific, Inc.
Nanodrop Lite SpektralphotometerThermo-Fisher
Mosquito RobotTTP Labtech
Software/WebsitesHKL2000
Otwinoski und Minor, 1997
PhenixAdams et al., 2010
Coot Emsley et al., 2010
ATSASPetoukhov et al., 2012https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
ScatterRambo and Tainer, 2013
PymolThe PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrö dinger, LLC.
BUNCHPetoukhov und Svergun, 2005
CRYSOLSvergun et al., 1995
PRIMUSKonarev et al., 2003
EOMTria et al., 2015
Escherichia coli BL21 (DE3)

Referenzen

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ProteinreinigungSAXS DatenanalyseRibosomen AssemblierungsfaktorNsa1 Proteinhybride StrukturmodellierungRigid Body ModellierungAb initio Modellierungproteolytisches Screening

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