Summary
Vi beskriver stegen som möjliggör snabb i situ provtagning av en liten del av en enskild cell med hög precision och minimal invasion med kapillär-baserade micro-provtagning, för att underlätta kemisk karakterisering av en ögonblicksbild av metabolisk aktivitet i levande embryon med en specialbyggd enda cell kapillär elektrofores och masspektrometri plattform.
Abstract
Kvantifiering av små molekyler i enstaka celler väcker nya potentialer för att bättre förstå de grundläggande processer som ligger bakom embryonal utveckling. Att aktivera encelliga utredningar direkt i levande embryon, nya analytiska metoder behövs, särskilt de som är känsliga, selektiv, kvantitativa, robust och skalbar till annan cell storlekar. Här presenterar vi ett protokoll som möjliggör de i situ -analysen av metabolism i enstaka celler i fritt utveckla embryon av sydafrikanska kloförsedda grodan (Xenopus laevis), en kraftfull modell i cell- och utvecklingsbiologi. Denna metod använder en kapillär microprobe att aspirera en definierad del från enda identifierade cellerna i embryot, medan angränsande celler intakt för efterföljande analys. Insamlade cellinnehållet analyseras av ett hur provtagningsutrustningen skall kapillärelektrofores elektrospray jonisering (CE-ESI) gränssnitt kopplad till en högupplöst tandem masspektrometer. Detta synsätt är skalbar till olika cell storlekar och kompatibel med komplexa tredimensionella strukturen hos det växande embryot. Som ett exempel visar vi att microprobe encelliga CE-ESI-MS gör förtydligandet av metabola cell heterogenitet som utspelar sig som en progenitor cell ger upphov till ättlingar under embryots utveckling. Förutom cell och utvecklingsbiologi är encelliga analysprotokoll som beskrivs här mottagliga för andra cell storlekar, typer eller modeller.
Introduction
En omfattande förståelse av embryonal utveckling kräver karakterisering av alla molekylära förändringar som utvecklas i varje cell organismens utveckling. Medan nästa generations sekvensering med molekylär förstärkning möjliggör är djupa mätning av encelliga transcriptomes1 i utveckla system2,3, betydligt mindre känt om sviten av mindre molekyler produceras i enstaka embryonala celler, inklusive proteiner och, särskilt, metaboliter (molekylmassa < ~ 1 500 Da). Med snabba och dynamiska svar på inre och yttre händelser fungerar bröstmjölkssammansättningen som en kraftfull deskriptor i cellens molekylär stat. De encelliga bröstmjölkssammansättningen, väcker därför potential att spåra rumsliga och tidsmässiga utvecklingen av cell heterogenitet i det tidiga embryot och att identifiera nya molekyler för funktionella studier. Dock utan molekylära amplifiering tillgänglig för dessa molekyler kräver upptäckt av bröstmjölkssammansättningen enastående känslighet med masspektrometri (MS), som är tekniken för val för metaboliten analys.
Encelliga MS är en samling av tekniker med tillräcklig känslighet att mäta metaboliter i enstaka celler (se recensioner 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). Reproducerbara provtagning av celler och effektiv utvinning av metaboliter är avgörande för framgångsrik påvisning av metaboliter i enstaka celler. Hela-cell dissekering av identifierade celler från embryon som Xenopus har aktiverat karakterisering av små molekyler och peptider16. Andra metoder använder Mikropipetter att prova enskilda levande celler följt av detektering med elektrospray jonisering (ESI) MS. Till exempel mättes metaboliter i växten eller däggdjursceller av encelliga video MS17, trycket sonden18, enda sonden19och fluidic force microscopy20, bland andra tekniker21, 22,23,24. Dessutom förenklar införlivandet av kemisk separation före jonisering i encelliga MS arbetsflödet effektivt de bröstmjölkssammansättningen, således att lindra eventuella störningar under ion generation innan upptäckt. Allt erbjuder separation också förening-specifik information för att hjälpa i molekylär identifieringar. Kapillärelektrofores (CE) har använts för att identifiera metaboliter i enda dissekerade25,26 eller microsampled27nervceller, fånga småmolekylär skillnader mellan neuron fenotyper. Vi anpassade nyligen CE till ESI tandem MS att aktivera spårningsnivå detektion av hundratals metaboliter i enskilda celler som var dissekeras från tidiga embryon Xenopus laevis16,28. Dessa studier visade överraskande metabola skillnader mellan embryonala celler i ett tidigt skede av utvecklingen och ledde till upptäckten av metaboliter med tidigare okänd fosterskadande effekter16.
Här tillhandahåller vi ett protokoll som aktiverat påvisning av metaboliter i enstaka celler direkt i en levande ryggradsdjur embryon som använder microprobe encelliga CE-ESI-MS29,30. Modellen organismen valt är 8--32-cellen till X. laevis embryo, även om metoden är också tillämplig på senare stadier av utveckling och andra typer av modellorganismer. Detta protokoll använder vässade kapillärer med fleraxliga translationell kontroll under vägledning av en högupplöst bildsystem för att aspirera ett ~ 10 nL portionr av identifierade celler i situ i morfologiskt komplexa utvecklande embryot. Detta microprobe är skalbar till mindre celler och fungerar inom sekunder, vilket är tillräckligt snabbt för att spåra cell härstamningar i embryot. Efter utdrager polar eller apolar små molekyler, som metaboliter och peptider, från insamlade stickprovet i ~ 4-5 µL extraktionslösningen, en ~ 10 nL av resulterande extraktet analyseras i en specialbyggd CE-plattformen bindestreck till en ESI masspektrometer. Byggande och drift av CE-ESI-MS plattformen bygger på protokoll som beskrivs på andra ställen. 31 , 32 det co-axial CE-ESI-gränssnittet är konstruerad som beskrivs på andra ställen. 31 denna plattform bibehålls i den kon-jet bespruta regimen att uppnå spårningsnivå känslighet med en kapacitet för kvantifiering över en 4-5 log-order dynamiskt omfång (relativa28,29,30 eller absoluta16). CE-ESI-MS plattformen erbjuder en 60-amol lägre detektionsgräns med 8% Relativ standardavvikelse (RSD) i kvantifiering över ett testade 10 nM till 1 µM för små molekyler16, som är tillräckliga för att karakterisera endogena metaboliter i X. laevis celler. Microprobed celler fortsätter att dela som embryo fortskrider genom utveckling30, möjliggör temporally och rumsligt löst analys av cellulär metabolism. Faktiskt, encelliga CE-ESI-MS kan användas för att hitta metabola skillnader mellan celler som upptar den dorsala-ventrala16,29, djur-vegetal16, vänster-höger28 utvecklingsmässiga axlar samt och celler som bildar den nervvävnad ödesbestämda dorsala härstamning från en gemensam stamfader cell i X. laevis30. Förutom hämtar metabola skillnader mellan enskilda embryonala celler i olika utvecklingsstadier av X. laevis embryo30, vi räknar med att de protokoll som beskrivs här är tillämpliga på ett brett spektrum av biomolekyler och enstaka celler microsampled från olika skeden av embryonal utveckling samt andra typer av celler och modellorganismer. Dessutom skulle microprobe kunna användas för microsampling medan en annan plattform som är kompatibel med minimala prover skulle kunna användas för separation eller karakterisering av biomolekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll som avser underhåll och hantering av Xenopus laevis godkändes av institutionella djur vård och användning kommittén vid George Washington University (IACUC ingen. A311).
1. beredning av provtagning instrument, Media, lösningsmedel och provtagning rätter
- Bered 1 x Steinbergs lösning (SS) genom upplösning följande salterna i ultrarent vatten (~18.2 MΩ.cm vid 25 ° C) i följande ordning och vid de angivna koncentrationer efter en standard protokoll33: natriumklorid (58,2 mM), kaliumklorid ( 0,67 mM), kalciumnitrat (0,34 mM), magnesiumsulfat (0,83 mM), Tris-hydroklorid (4,19 mM) och Tris base (0,66 mM). 0,5 x SS av två gånger, och 0,1 x SS av tiofaldig utspädning, 1 x SS använder ultrarent vatten.
- Förbereda provtagning rätter av första gör 2% agaros 1 x SS. autoklav vid 120 ° C i 20 min att upplösa. Medan fortfarande flytande, täck botten av 60 mm petriskålar med lösningen. När agarosgel har svalnat och stelnat, flamma i slutet av en sex-tums Pasteur-pipett tills den bildar en boll, och nudda det uppvärmda slutet på imprint 5-10 brunnar, ~ 1 mm djup, in Agarens.
Obs: Dessa brunnar används för att immobilisera embryon under provtagning. - Laga av metaboliten extraktionsmedel. Skräddarsy de fysikalisk-kemiska egenskaperna av lösningsmedel (t.ex., polaritet och pH) till klasserna av molekyler som är av intresse i studien.
Obs: till exempel vi använder 40% metanol och 40 procent acetonitril i LC-MS-grade vatten som en upptäckten metod för att rikta främst polära metaboliter och några apolar metaboliter och peptider28. - Gör hår loopar med rent hår och en Pasteur-pipett som beskrivs på andra ställen33 för att försiktigt flytta embryon i petriskålar med minimal störning.
- Fabricera avsmalnande spets Mikropipetter som visas i figur 1a.
- Först dra Borsilikat kapillärer (1000/500 µm yttre/inre diameter) i en flammande-Brown-typ kapillär avdragare med följande inställningar: värme = 355; pull = 65, hastighet = 80; tid = 150.
- Nästa, paus-off toppen av den drog mikropipett använder ett par fina vass pincett för att erhålla en kapillär spets ytterdiameter på ~ 20 µm. utföra detta steg under ett stereomikroskop stöd precision och reproducerbarhet.
Obs: Kapillärer med ett litet tips är benägna att igensättning under aspiration av trögflytande cytoplasman. Medan kapillärer med större spets säkert hjälpa undvika igensättning och aspirera mer av cellulära innehåll, kan stora-bore kapillärer utgöra utmaningar under provtagning av mindre celler och eventuellt skada cellen för efterföljande provtagning. Noggrann justering av trycket och tid för aspiration kan delvis lindra dessa utmaningar. Vi hitta Mikropipetter med ~ 20 µm ytterdiameter idealisk för det arbete som presenteras här.
2. Microsampling enstaka celler och metaboliten utvinning
- Skaffa embryon (befruktade ägg) genom gonadotropin-inducerad naturlig parning av vuxen Xenopus laevis eller via in vitro- befruktning som beskrivs i protokoll någon annanstans33,34.
Obs: Naturlig parning säkerställer att de embryonala utvecklingsstadierna är vacklade medan embryon erhållits genom in vitro- befruktning är mer tillförlitliga för leverans. In vitro- fertilisering kräver dock att offra vuxna manliga grodan. - Nymalen förbereda 2% cystein dejellying lösning genom att lösa upp 4 g av cystein till 200 mL ultrarent vatten och droppvis justera lösningen på pH 8 med 10 N natriumhydroxidlösning.
- Ta bort gelé rockar omgivande embryon som de börjar att klyva in i 2-cells arrangerar följande: låt embryon vila i dejellying lösningen i 2 min och sedan snurra försiktigt dem för en ytterligare 2 min att förhindra embryon från ansluter sig till ytan av samlingen skålen.
- Häll försiktigt skålen innehållet i en ren bägare och häll snabbt upp den dejellying lösningen från bägaren. Omedelbart täcka äggen med 0.1 x SS att skölja av den återstående dejellying lösning, snurra försiktigt och häll sedan upp lösningen. Upprepa detta steg fyra gånger för att tvätta på embryon.
Obs: Begränsa exponering av embryon till dejellying lösning till 4 min att säkerställa bärkraft. Omfattande protokoll ta bort gelé rockar finns tillgängliga någon annanstans33. - Överför dejellied embryon till 1 x SS i en petriskål. För att minimera trängsel inom plattorna, placera ~ 100 embryon per 100 mm maträtt33.
Obs: Rätter som innehåller embryon kan lagras mellan 14-18 ° C att bromsa utvecklingen och få embryon i successiva utvecklingsstadier från de samma föräldrarna. Ytterligare riktlinjer temperaturberoendet för tillväxt och utveckling publiceras på Xenbase och på andra håll33,35,36,37. - Sortera klyva embryon i 2-cellstadie i en separat skål i vilka stereotypa pigmentering tryggt markerar den dorsala-ventrala axeln, med hänvisning till etablerade cell öde kartor38,39,40.
- Identifiera korrekt proteinspjälkande embryon genom att säkerställa att den första klyvning fåran, som demarks Mediana, bisects den mörkt (ventrala) och lätt (dorsala) pigmenterad djur pole så att de två halvorna är spegelbilder41.
- Montera en fabricerade mikropipett på en multi-axlig micromanipulator (manuell eller fjärrstyrda). Anslut mikropipett till en microinjector.
- Använd en plast överföring pipetten att aspirera ~ 5 av de 8-cells embryona och överföra dem till provtagning skålen som innehåller 0,5 x SS.
Obs: Identifiera de celler baserat på pigmentering och position i embryot, med hänvisning till cell öde kartor38,39,40.
Obs: till exempel vi rutinmässigt aspirera ~ 10-15 nL volym från cellen genom att tillämpa ~ 3 pulser av-30 psi kapillären. Detta hela steg varar ~ 5 s för aspiration30.
- Tätt nära injektionsflaskan för att förhindra avdunstning och placera injektionsflaskan tillbaka i 4 ° C is hink tills provtagning är klar. Kassera den använda mikropipett i en behållare för vassa föremål att förhindra sekundärstick fara.
Obs: För att bestämma volymen av aspirerade cellinnehållet, injicera aspirera i mineralolja, där det erhåller en sfärisk form. Diametern på detta område kan mätas med hjälp av ett mikroskop. Beräkna volymen aspirerade: V = 4/3 π r3, där V är volym, och r är radien av sfären.
3. CE-ESI-MS mätning
- Utarbetandet av standarder och lösningar för CE-ESI-MS
- Förbereda bakgrund elektrolyten (BGE) bestående av 1% myrsyra i LC-MS grade vatten.
- Bered den slida att innehålla 50% metanol i LC-MS grade vatten och 0,1% myrsyra.
- Bered 50 nM acetylkolin i slida lösningen för daglig utvärdering av CE-ESI-MS systemet.
- Förbereda 150 mM natriumkloridlösning som mass-kalibrering standard för intervallet låg m/z i positiv Jon läge. En massa (m/z) noggrannhet på < 10 ppm rekommenderas. Följ masspektrometer leverantörens instruktioner för att utföra detta steg.
Obs: Alternativt andra standarder med kända m/z -värden kan användas till massa-kalibrera masspektrometer.
- Byggandet av den CE-ESI-plattformen
- Konstruera en CE injektion plattform som kan snabb vertikal översättning av ett skede holding BGE injektionsflaskan och provet lastning mikrorör. För byggande och drift av plattformen, se detaljer i referens31.
- Montera gränssnittet CE-ESI (figur 1 c) enligt följande. Montera elektrospray metall utsändaren (130/260 µm inre/yttre diameter och ~ 35 mm längd) i en 3-port T-union. Foder separation CE kapillären (40/105 µm inre/yttre diameter och ~ 100 cm längd) genom elektrospray sändaren gör det möjligt att sticka ut ~ 40-100 µm bortom spetsen på sändaren. Arbeta under ett stereomikroskop stöd noggrannhet.
- Anslut slida lösning kapillären (75/360 µm inre/yttre diameter och ~ 100 cm längd) till kvarvarande porten leverera den elektrospray lösningen. Använd lämpliga ärmar och skruva anslutningar för läckagefri drift av gränssnittet CE-ESI. Se föregående protokoll31,32 för information om montering och felsökning av detta gränssnitt.
Obs: Kapillär dimensioner påverka signal-brus-förhållandet (S/N) och varaktigheten av separation. Exempelvis underlätta smala-bore och korta kapillärer snabb separationer med högre separation spänningar42,43. Dessutom, beroende på vilka typer av molekyler som är av intresse i en studie, kan separation kapillärer vara belagd för att minimera/undvika oönskade molekyl-kapillär väggen interaktioner44.
- Anslut slida lösning kapillären (75/360 µm inre/yttre diameter och ~ 100 cm längd) till kvarvarande porten leverera den elektrospray lösningen. Använd lämpliga ärmar och skruva anslutningar för läckagefri drift av gränssnittet CE-ESI. Se föregående protokoll31,32 för information om montering och felsökning av detta gränssnitt.
- Med hjälp av en tallrik-hållare, montera CE-ESI gränssnittet till en tre-axeln översättning scenen och placera elektrospray emitter spetsen ~ 2 mm från masspektrometer öppningen (figur 1 c).
- Till rena komponenter av gränssnittet, skölj genom att tillhandahålla elektrospray slida lösningen genom elektrospray utsändaren 1 µL/min och BGE genom CE avskiljandet kapillär. Använd sprutpumpar för att mata lösningsmedlen i en stadig takt.
- Spola CE separation kapillären före varje mätning genom att ansluta en spruta till kapillär inloppet slutet. Använd tillräckligt stora sprutor för att minimera påfyllning och grundning av lösningsmedel matarledningar.
Obs: Experiment använder vanligtvis 1 mL gastät sprutor för att leverera elektrospray slida lösningsmedlet och en 500 µL spruta för att spola separation kapillären.
- Validering av CE-ESI-MS plattform och mätning av metaboliter
Obs: Målet med detta steg är att bekräfta instrumentet CE-ESI-MS Analytisk känslighet dagligen före analysera encelliga extrakt.
- Efter sköljning överför avskiljandet kapillär för ~ 5 min, dess inlopp till BGE lösningen ligger i en injektionsflaska av rostfritt stål.
- Placera elektrospray emitter spetsen ~ 2 mm från masspektrometer öppningen och finjustera detta avstånd med en översättning stage för att generera elektrospray i stabil kon-jet regimen samtidigt övervakning spray använder ett stereomikroskop (se referenser 31,45). Övervaka stabiliteten i den totala ion nuvarande (TIC) för ~ 30-45 min att säkerställa stabil drift.
- Tillämpa ~ 20 kV till BGE injektionsflaskan genom gradvis upprampning potential över ~ 15 s, vanligtvis genererar ~7.5 µA nuvarande över separation kapillären med 1% myrsyra som BGE. Före varje mätning skall säkerställa systemets stabilitet genom att övervaka TIC profilen för ~ 5-10 min och sedan överläggsgrafer lägre separation (CE) potential till 0 V (marken).
Obs: Semi automatisera denna process, vi använder en anpassad-skriven programvara för att fjärrstyra CE högspänning makt leverans31. Om CE-ESI-MS plattformen är instabil, noggrant utvärdera källan till instabilitet genom att testa den CE-ESI-MS-plattformen först i ESI-läge och sedan i CE-ESI operativa läget som rekommenderat någon annanstans31. Kort, för att testa plattformen i ESI-only-läge, Stäng av den höga spänningen för CE och övervaka TIC för ~ 30 min i kon-jet bespruta regimen. Om det behövs, gör följande adress fel: (i) inspektera anslutningar för läckor; (ii) ren elektrospray sändaren med vatten, isopropanol, vatten och metanol; (iii) de gas lösningsmedel. (iv) spola sändaren för ~ 25 min innan du testar igen. Om CE-ESI plattformen finns stabil i ESI-bara läget men blir instabil under CE separation, inspektera systemet för Joule värme eller elektrolys: (i) spola separation kapillären med BGE för ~ 25 min och upprepa experimentet; (ii) använda lägre separation potentialer för att upprätthålla en linjär ohmsk respons (dvs.linjära CE nuvarande vs. separation spänning kurva); (iii) inspektera CE kapillären för potentiella skador, såsom sprickor, och Byt kapillären vid behov. - Analysera ~ 6 nL av provet enligt följande:
- Pipettera 1 µL standardlösning acetylkolin i injektionsflaskan med injektion.
- Överföra separation kapillären från injektionsflaskan BGE i injektionsflaskan med injektion.
- Lyft CE injektion scenen 15 cm i 1s.
- Håll scenen förhöjda för 60 s hydrodynamiskt injicera ~ 6 nL av provet till separationen kapillär.
- Därefter Översätt scenen tillbaka till Start nivåer (i linje med kapillär utlopp).
- Flytta försiktigt kapillär inloppet slutet till BGE.
- Omedelbart efter, ramp upp CE spänningen till starta elektroforetisk separation.
- Start MS datainsamling.
Obs: Systemets prestanda kan kännetecknas med någon kemisk standard. Den encelliga CE-ESI-MS levererar lägre detektionsgränser ~ 10 nM (~ 60 amol) för acetylkolin, metionin och histidin16. Den volym som injiceras (Vinj), beror in i kapillären i nL, på höjdskillnaden (H, cm) under injektion, densitet (ρ, g cm-3) och viskositet (η, kg m-1s-1) för BGE, längd (L, m) och radie (r, µm) CE- Kapillär och injektion varaktighet (tinj, s). Denna relation uttrycks genom följande formel, där g (m s-2) är gravitationsacceleration:
- När standarden har upptäckts, stoppa datainsamling, lägre separation spänningen stegvis till 0 V (marken) och sedan hämta sändaren till 2 cm från öppningen. Spola separation kapillären för 5 min innan analysera cell extrakt.
- Åtgärd 10 nL av encelliga extrahera genom att upprepa steg 3.3.1-3.3.5 med 90 s hydrodynamiskt injicera provet.
Obs: Målet med databehandlingen är att identifiera och kvantifiera föreningar mellan enstaka celler. Encelliga CE-ESI-MS protokollet genererar smala electropherographic toppar med typiska bas bredder av några sekunder. Genom att utföra dataanalys semi manuellt, är det möjligt att hitta molekylära funktioner (unik m/z -värden med unika migreringstiden) med följande steg. Representativa separation visas Välj identifierade metaboliter i figur 2a.
- Mass-kalibrera rådata filer post datainsamling.
Obs: Vi använder signaler från natrium formate-kluster som genereras under separation av riklig natriumjoner från provet, som är inbyggt i cellerna eller extraherade från embryo kultur media. Målet med detta steg är att förbättra metabolit identifiering i senare steg genom att säkerställa en hög massa (m/z) noggrannhet, helst < 5 mDa, eller < 10 ppm, mellan m/z 50-1, 000. Här inlägget data förvärv kalibrering gör det möjligt att rutinmässigt få massa exaktheter < 1 mDa, eller < 2 ppm för m/z 50-500. - Använda en Bearbetningsskriptet, Sök för molekylär funktioner över upptäckta massa. Genomsnittlig masspektra i varje topp att bestämma korrekt massan, och anteckna deras motsvarande migreringstiden. För identifiering av låg massa metaboliter i intervallet m/z 50-500, använda ett 500 mDa steg fönster för att övervaka molekylär funktioner med S/N > 3.
- Integrera peak område-under-the-kurvan för varje molekylära funktion manuellt eller automatiskt. Resultatvärdena område används som ett mått på metaboliten överflöd.
- Identifiera molekylära funktioner av intresse med högt förtroende enligt följande (Se Fig.
- Först, jämföra korrekt massa molekylär funktioner mot en metabolit databas (t.ex., Metlin46 och HMDB47) med 10 ppm noggrannhet för att få en lista av förmodad massa matcher.
- Nästa, utvärdera dessa massa matcher genom att jämföra deras tandem masspektrum erhållits från cell extrakt med tillgängliga data i metaboliten databaserna eller tandem mass spektrumet mätt för den motsvarande kemiskt standard.
- Senast, validera dessa tilldelningar genom att jämföra migration tidpunkten för molekylär funktioner registreras i cell extrakt med kemiska standarder analyseras av samma CE-ESI-MS instrument.
Obs: För att förbättra experimentell genomströmning, identifierar vi vanligtvis bara molekylär funktioner som är statistiskt signifikant skillnad mellan experimentella förhållanden eller celltyper. Representativa identifieringar visas i figur 2. För att identifiera metaboliter med hög massa noggrannhet, rekommederar vi externt kalibrera masspektrometer dagligen, realtid omkalibrering under varje mätning med intern standard och/eller externt mass-kalibrera varje mätning fil efter datainsamling (t.ex., för natrium formate kluster här) rekommenderas.
Obs: I vårt experiment, online programvara plattformar47 användes för att utföra alla steg i efterföljande dataanalys, inklusive följande: jag) filtrering av molekylär funktioner med förekomst i minst 50% av varje prov-set (t.ex., det cell typ); (II) normalisering av uppgifterna. (III) statistiska (t.ex., t-test) och multivariat dataanalys, såsom principalkomponentanalys (PCA) och hierarkiska klusteranalys (HCA). Vi använder p < 0,05 (Student's t-test) att markera statistisk signifikans och ≥ 1,5 till observera biologiska betydelse-faldig förändring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har nyligen anställt microprobe encelliga CE-ESI-MS att karakterisera metaboliter i enskilda identifierade celler i fritt utveckla Xenopus laevis embryon29,30. Microprobe möjliggör snabb (~ 5 sec/cell), i situ aspiration av ~ 10 nL från en enskild cell, flera ambitioner i samma cell, eller flera olika celler i de samma eller senare stadierna av levande fosterutvecklingen (figur 1b). Aspirerade cellulära innehållet utvinns med hjälp av lämpligt lösningsmedel och metaboliter separeras sedan och joniserat i specialbyggda CE-ESI-gränssnittet och upptäcks av MS. Typically, metoden ger ~ 300 nonredundant metabolit signaler (efter avlägsnande isotopiska och kluster toppar) från varje cell. Separation exemplifieras för Välj molekyler i figur 2a. Vi identifierade 70 olika signaler med högt förtroende som små polära metaboliter, baserat på flyttningstid och MS/MS fragmentering mönster av cell extrahera signaler, jämfört med de från en standard eller tandem mass spektralbibliotek. Figur 2b visar exempelvis säker identifiering av histidin baserat på kombinationen av dessa ortogonala bitar av information.
Microprobe CE-ESI-MS möjliggör kvantifiering av metabola skillnader mellan enstaka celler. CE-ESI-MS har en kvantitativ repeterbarhet på 8% RSD baserat på under-the-kurva peak områden i markerad-Jon elektroferogrammen16,30. Med microprobe provtagning är denna tekniska reproducerbarhet 14% RSD30, vilket är tillräckligt för att fråga metabolisk aktivitet skillnader mellan celler till en statistisk och biologiska betydelse. Som ett exempel visar figur 3 att mikrob CE-ESI-MS aktiverad i situ mikro-provtagning av tre dorsal-celltyper (figur 3a). Dessutom PCA kvantitativa metadata avtäckt metabola förändringar som en identifierad progenitor cell 8-cells embryot (se D1R cell) uppdelat att bilda en cell klon i 16-cellen (se D11R cell) och 32-cell (D111R cell) embryo (figur 3b). Representativa trender visas för Välj metaboliter i figur 3 c. Metaboliter såsom acetylkolin minskade i överflöd med celldelning, medan trolamine och Ser-Arg visade motsatta trender i dessa cell typer. Trolamine minskade i överflöd från den 8 - 16-cells embryon och sedan blev berikad i 32-cell embryot, samtidigt Ser-Arg skildras en motsatt trend genom att öka till 16-cells embryot innan minskar i 32-cell embryot. Arginin förändrades inte betydligt i överflöd mellan dessa cell stadier. Dessa trender förväntas sprida mer ljus över de grundläggande processer som ligger bakom de tidiga utvecklingsstadierna av X. laevis.
Figur 1: Experimental arbetsflöde för i situ microprobe encelliga kapillärelektrofores (CE) masspektrometri (MS). (A) fabricerade Mikropipetter (överst) innan och (nederst) efter klyva spetsen i 20 µm yttre diameter för användning i microsampling. (B) Microsampled celler fortsatte för att dela som 8-cells embryot utvecklats till 16-cellen scenen, öppna scenen för in-vivo studier. (C) identifierade enstaka celler var provtas med en microprobe (µP) i 8-cellen Xenopus laevis embryo (se V1R och D1R celler), cell metaboliterna extraheras och analyseras med CE-MS. skala barer = 250 µm (mörk/grå); 10 mm (vit). Nyckel: SP, sprutpumpen. (Siffror anpassad med tillstånd från referenser29,30.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Microprobe encelliga CE-MS möjliggör säker identifiering av metaboliter. (A) representant elektroferogram för Välj identifierade metaboliter. (B) identifiering av histidin baserat på en jämförelse av korrekt massa, flyttningstid och fragmentering data (kollision-inducerad dissociation) mot metaboliten som är standard. Key: 1, metyl histidin; 2, homolysine; SAM, S-adenosylmetionin; Orn, ornitin; TE, trietylamin; Bil, karnitin; AcCho, acetylkolin; AcCar, acetylcarnitine; HPX, hypoxantin; GSH, glutation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kvantitativa metabola skillnader mellan enstaka celler som bildar en dorsal härstamning i X. laevis. (A) optiska bilder av cellen stamceller D1R 8-cells embryot, och dess ättlingar, cellen D11R i 16-cells embryot och cellen D111R i 32-cell embryot. (B) Principal Komponentanalys (PCA) av metaboliter kvantifieras i dessa tre celltyper avslöja olika metaboliska profiler. Varje datapunkt betecknar en annan cell (se nummer) som mättes i tekniska replikat (anslutna punkter). Ellipser Markera 95% konfidensgrad. (C) analys av variansen (ANOVA) och post-hoc-Fishers minst signifikanta diskriminantanalys avslöjar komplexa metabola trender över cellen arrangerar. För lådagram, torget är medelvärdet, box är 1 × standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) och morrhår är 1,5 × SEM. nyckel: *p < 0,05; NS, ingen signifikant skillnad. Skala barer = 250 µm. (siffror anpassad med tillstånd från referens30.) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microprobe CE-ESI-MS kan direkt karakterisering av metaboliter i enstaka celler i live, fritt utveckla embryon. Kärnan i metoden är två tekniska delkomponenter, nämligen i situ kapillär microsampling och hög känslighet CE-ESI-MS. jämfört med hela-cell dissektion, kapillär microsampling har fördelen av snabb operation (några sekunder vs. 5 min ”/ cell genom dissektion), kompatibilitet med komplexa tredimensionella morfologi av embryon och skalbarhet till mindre celler som bildar på senare stadier av utveckling. Till skillnad från dissektion lämnar microprobe provtagning andra celler i embryot intakt för efterföljande analys. Spännande, kan microsampled celler fortsätta att dela sig och öka möjligheten för långtidsstudier av celldifferentiering. Förmågan att kontrollera microprobe tip storlek tillåter också microprobe CE-ESI-MS att fungera som ett mångsidigt verktyg för studerar roll för ämnesomsättningen i cellerna och utvecklingsprocesser med andra modellorganismer, inklusive zebrafiskar och mus. För att garantera trovärdiga resultat, är det viktigt att cellerna av intresse är exakt, korrekt och konsekvent identifieras och provtas. Experimentella parametrar för aspiration (t.ex., kapillär dimensioner, tryck och tid) kan skräddarsys för att prova en önskad del av en cell. Dessutom är det viktigt att immobilisera embryon för att öka precision rikta cellen av intresse, vilket i sin tur minimerar skador på embryot. I detta protokoll skapat vi brunnar inom agaros-belagd petriskålar att immobilisera embryon under provtagning. I vår erfarenhet säkerställa kapillärer med avfasade tips minimal skada cellen jämfört med trubbiga tips. Ytterligare förbättringar av genomströmning av provtagning och kemisk analys gör det möjligt för karakterisering av stora populationer av celler, således ge statistisk analys för att identifiera viktiga metaboliter underliggande cell- och utvecklingsprocesser.
Syftet med CE-ESI-MS är att aktivera karakterisering av bröstmjölkssammansättningen i spårningsnivå känslighet. CE erbjuder kompletterande fördelar för encelliga studier jämfört med andra populära separation tekniker, såsom nano-flow vätskekromatografi eller gaskromatografi. CE ger utsökta avskiljningsgrad för att hantera den komplexa bröstmjölkssammansättningen. De fysiska dimensionerna av CE är kompatibla med volym-begränsad prover som resulterar från enstaka celler. Dessutom finns olika anrikning tekniker i CE (t.ex., fält-förstärkta prov stapling eller dynamiska pH junction) att preconcentrate provet på kolumn, därmed öka upptäckt känslighet. För framgångsrika studier, bör instrumentet CE-ESI-MS kännetecknas och validerade dagligen. Till exempel, vi kräver en S/N på minst 3 för 60 amol av acetylkolin standard (6 nL 50 nM standard injiceras) och en reproducerbarhet av < 5% RSD i separation (migrering) tid och < 25% RSD i kvantifiering baserat på peak område-under-the-kurva i markerad-Jon elektroferogrammen för standarden. Trace-känslig detektion och dynamiska kvantifiering underlättar mätning av olika typer av metaboliter (och peptider) som spänner över ett brett spektrum av koncentrationen i enstaka celler använder CE-ESI-MS6,16,25 , 31. medan vi upptäcka rutinmässigt ~ 300 olika positivt laddade metabolit signaler, CE-MS är också kompatibel med negativ jonisering läge48, därigenom öka djupet av detekterbara portion av de encelliga bröstmjölkssammansättningen.
Även X. laevis erbjuds flera fördelar i skapandet av denna teknik för att studera utvecklingen, microprobe CE-ESI-MS kan även anpassas till andra typer av modellorganismer. I Xenopus, pigmentering och storlek gör skillnader mellan celler tillsammans med reproducerbara cell öde kartor49 det möjligt att identifiera specifika celler med kända vävnad öden. Detta, i sin tur öppnar dörren till upptäckten eller riktade metabola experiment av hela cellen härstamningar som celler stelna olika utvecklande program mot differentiering. För att eliminera skillnader som uppstår på grund av varierande cell-cykler, bör embryon tillåtas att fullt ut dela upp till nästa etapp före provtagningen, som visat någon annanstans50. Microprobe CE-ESI-MS är anpassningsbar till klassiskt embryologiska manipulationer eller molekylära verktyg (t.ex., gen knock out/ner) att testa den utvecklingsmässiga betydelsen av små molekyler med betydande dysreglering mellan Välj celler eller celltyper . Exempelvis ledde kombinationen av encelliga metabolomik med cell öde spårning via uttrycket av grönt fluorescerande protein till upptäckten av metaboliter med tidigare okänd fosterskadande effekter16.
Encelliga metabolomik studier kräver noggrann uppmärksamhet på analytisk detaljer, särskilt när det gäller kvantifiering; vår teknik är inget undantag. Varje steg i arbetsflödet prov förberedelse bör helst utvärderas noggrant för att minimera potentiella försämring eller förlust av endogena metaboliter eller förorening till proverna. Användning av hög renhet denatureringen lösningsmedel (t.ex., LC/MS grade), syror eller baser och låga temperaturer (~ 4 ° C) rekommenderas att släcka aktiviteten av enzymer och lindra/undvika metabola förändringar att proverna före instrumentell analys6 , 51. enkla organiska lösningar baserat på metanol och acetonitril tillåter effektiv utvinning av små polära metaboliter28. Naturligtvis gynnas experiment riktade till specifika klasser av metaboliter (t.ex., apolar föreningar, lipider) skräddarsy sammansättning av extraktionsmedel i förväg. Exempelvis har vi nyligen visat att användningen av flera typer av extraktionsmedel ökar täckningen av de encelliga bröstmjölkssammansättningen28. Kvantifiering av dessa metaboliter kan underlättas genom interna standarder, såsom isotopically märkta metaboliter, vilka kan vara spetsade i extrakten under metabolit extraktion. De interna standarderna är också fördelaktigt om kvalitetssäkring för utvinning och mätning steg, vilket underlättar utvärderingen av system och tekniska reproducerbarhet och återvinning av provet analyter. Senast, vi förespråkar för biologiska replikerar (olika celler aspirerade från olika embryon) med varje cell som analyseras i tekniska replikat (samma extrakt mätt flera gånger) att hjälpa statistiska makt och tolkning av resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av nationella institut för hälsa bidrag GM114854 (att P.N.) och CA211635 (att P.N.), Arnold och Mabel Beckman Foundation Beckman Young Investigator bevilja (till P.N.), DuPont ung Professor tilldelningen (till P.N.), American Society for Mass Spektrometri Research Award (att P.N.) och COSMOS Club Foundation stipendier (till R.M.O. och E.P.P.). De åsikter och slutsatser som framförs i denna publikation är enbart författarnas och representerar inte nödvändigtvis de officiella utsikt över finansiering källor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for Embryo Culture Media | |||
| Potasium chloride | Fisher Scientific | BP 366-1 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M 65-3 | |
| Calcium nitrate | Sigma Aldrich | C1396 | |
| Cysteine | MP Biomedicals | 101444 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma Aldrich | T3253 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolite Extraction Solvents | |||
| Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solvents and Standards for CE-ESI-MS | |||
| Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A11710X1-AMP | |
| Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Acetylcholine chloride | Acros Organics | 159170050 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Fabrication Setup | |||
| Micropippette puller | Sutter Instrument Co. | P-1000 | |
| Borosilicate capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel | Fine Science Tools (USA) Inc | 11252-30 | Corrosion resitant and autoclavable. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microprobe Sampling Setup | |||
| Micromanipulator | Eppendorf, Hauppauge, NY | TransferMan 4r | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | Should be vibrationally isolated. |
| Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CE-ESI-MS Setup | |||
| High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure. |
| Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
| Stereomicroscope | Amscope | SM-3BZZ | Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface. |
| XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
| XYZ translation stage | Custom-built | This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary | |
| Stainless steel sample vials | Custom-built | ||
| Stainless steel BGE vial | Custom-built | ||
| Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP040105 | |
| Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP075375 | |
| Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) | Hamilton Co. | 21031A | For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip. |
| Syringes (gas-tight): 500 - 1000 µL | Hamilton Co. | 1750TTL | |
| Digital multimeter | Fluke | Fluke 117 | |
| High-resolution Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | Maxis Impact HD | High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI |
| Tunning mixture for mass spectrometer calibration | Agilent technologies | ESI-L G1969-85000 | |
| Data Analysis ver. 4.3 software | Bruker Daltonics | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ancillary Equipment | |||
| Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C | Labconco | 7310022 | |
| Analytical microbalance (XSE105DU) | Fisher Scientific | 01911005 | |
| Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 °C) | Fisher Scientific | 88300ASP | |
| Refrigerated Incubator | Fisher Scientific | 11475126 | |
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 |
References
- Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
- Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape. Genome Biol. 16 (209), (2015).
- Tran, D. A., Bai, A. Y., Singh, P., Wu, X. W., Szabo, P. E. Characterization of the imprinting signature of mouse embryo fibroblasts by RNA deep sequencing. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1772-1783 (2014).
- Wang, D. J., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics'. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
- Svatos, A. Single-cell metabolomics comes of age: new developments in mass spectrometry profiling and imaging. Anal. Chem. 83 (13), 5037-5044 (2011).
- Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat. Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
- Bodenmiller, B., et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat. Biotechnol. 30 (9), 858-889 (2012).
- Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
- Kleparnik, K., Foret, F. Recent advances in the development of single cell analysis: A review. Anal. Chim. Acta. 800, 12-21 (2013).
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: Analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Gholipour, Y., Erra-Balsells, R., Nonami, H. In situ pressure probe sampling and UV-MALDI MS for profiling metabolites in living single cells. Mass Spectrom (Tokyo). 1 (1), A0003 (2012).
- Comi, T. J., Do, T. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Categorizing cells on the basis of their chemical profiles: progress in single-cell mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 139 (11), 3920-3929 (2017).
- Lombard-Banek, C., Portero, E. P., Onjiko, R. M., Nemes, P. New-generation mass spectrometry expands the toolbox of cell and developmental biology. Genesis. 55, e23012 (2017).
- Yang, Y. Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. Trac-Trends Anal. Chem. 90, 14-26 (2017).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (21), 6545-6550 (2015).
- Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
- Nakashima, T., et al. Single-cell metabolite profiling of stalk and glandular cells of intact trichomes with internal electrode capillary pressure probe electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 88 (6), 3049-3057 (2016).
- Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
- Guillaume-Gentil, O., et al. Single-cell mass spectrometry of metabolites extracted from live cells by fluidic force microscopy. Anal. Chem. 89 (9), 5017-5023 (2017).
- Saha-Shah, A., Green, C. M., Abraham, D. H., Baker, L. A. Segmented flow sampling with push-pull theta pipettes. Analyst. 141 (6), 1958-1965 (2016).
- Hu, J., et al. Synchronized polarization induced electrospray: Comprehensively profiling biomolecules in single cells by combining both positive-ion and negative-ion mass spectra. Anal. Chem. 88 (14), 7245-7251 (2016).
- Zhang, L. W., Vertes, A. Energy charge, redox state, and metabolite turnover in single human hepatocytes revealed by capillary microsampling mass spectrometry. Anal. Chem. 87 (20), 10397-10405 (2015).
- Zhang, L. W., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
- Lapainis, T., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Capillary electrophoresis with electrospray ionization mass spectrometric detection for single-cell metabolomics. Anal. Chem. 81 (14), 5858-5864 (2009).
- Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 83 (17), 6810-6817 (2011).
- Aerts, J. T., et al. Patch clamp electrophysiology and capillary electrophoresis mass spectrometry metabolomics for single cell characterization. Anal. Chem. 86 (6), 3203-3208 (2014).
- Onjiko, R. M., Morris, S. E., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry with multi-solvent extraction identifies metabolic differences between left and right blastomeres in the 8-cell frog (Xenopus) embryo. Analyst. 141 (12), 3648-3656 (2016).
- Onjiko, R. M., Plotnick, D. O., Moody, S. A., Nemes, P. Metabolic comparison of dorsal versus ventral cells directly in the live 8-cell frog embryo by microprobe single-cell CE-ESI-MS. Anal. Methods. , (2017).
- Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: Metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Anal. Chem. 89, 7069-7076 (2017).
- Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 8 (4), 783-799 (2013).
- Knolhoff, A. M., Nemes, P., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R., Lutz, N., Sweedler, J. V. , 119-139 (2013).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods Mol Biol. 135, 331-347 (2000).
- Bowes, J. B., et al. Xenbase: a Xenopus biology and genomics resource. Nucleic Acids Res. 36, D761-D767 (2008).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43 (D1), D756-D763 (2015).
- James-Zorn, C., et al. Xenbase: expansion and updates of the Xenopus model organism database. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D865-D870 (2013).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
- Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120 (1), 299-304 (1987).
- Rollman, C. M., Moini, M. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry of controlled substances with optical isomer separation in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 30 (18), 2070-2076 (2016).
- Moini, M., Martinez, B. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry with adjustable porous tip for a rapid analysis of protein digest in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (3), 305-310 (2014).
- Huhn, C., Ramautar, R., Wuhrer, M., Somsen, G. W. Relevance and use of capillary coatings in capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 297-314 (2010).
- Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal. Chem. 79 (8), 3105-3116 (2007).
- Zhu, Z. J., et al. Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry characterization of metabolites guided by the METLIN database. Nat. Protoc. 8 (3), 451-460 (2013).
- Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0 The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D801-D807 (2013).
- Liu, J. X., Aerts, J. T., Rubakhin, S. S., Zhang, X. X., Sweedler, J. V. Analysis of endogenous nucleotides by single cell capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analyst. 139 (22), 5835-5842 (2014).
- Hubrecht, L., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Pub. Co. (1967).
- Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development. J. Vis. Exp. (71), (2013).
- Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nat. Protoc. 6 (8), 1241-1249 (2011).
