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Automatisierte Messung von Cryptococcus Arten Polysaccharid-Kapsel und Zellkörper

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DOI:

10.3791/56957

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11. Januar 2018

 , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Verfahren beschreibt eine automatisierte Batch-Bildprozessor Polysaccharid Kapsel und Körper Radien messen soll. Während ursprünglich für Cryptococcus Neoformans Kapsel Messungen entwickelt, die automatisierte Bildverarbeitung auch auf andere Grundlage Kontrasterkennung kreisförmigen Objekte angewendet werden kann.

Zusammenfassung

Diese Technik soll einen konsistente, präzise und überschaubaren Prozess für eine große Anzahl von Polysaccharid Kapsel Messungen zur Verfügung zu stellen.

Zunächst wird eine Schwelle Bild basierend auf Intensitätswerte eindeutig berechnet für jedes Bild generiert. Dann Kreise basierend auf Kontrast zwischen Objekt und Hintergrund mit dem etablierten Kreis Hough-Transformation (CHT)-Algorithmus erkannt. Schließlich erkannten Zelle Kapseln und Einrichtungen sind je nach Zentrum koordiniert und Radius Größe abgestimmt, und Daten werden dem Benutzer in einer überschaubaren Tabelle exportiert.

Die Vorteile dieser Technik sind einfache, aber wichtige. Erstens, weil diese Berechnungen durch einen Algorithmus anstatt ein Mensch Genauigkeit und Zuverlässigkeit erhöht. Es ist kein Rückgang der Genauigkeit oder Zuverlässigkeit unabhängig davon, wie viele Proben analysiert werden. Zweitens stellt dieser Ansatz eine potenzielle Betriebsanweisung für das Cryptococcus -Feld statt der aktuellen Situation wo Kapsel Messung variiert nach Labor je. Drittens manuelle Kapsel Messungen sind langsam und monoton, ermöglicht Automatisierung schnelle Messungen auf große Zahlen von Hefezellen, die wiederum Hochdurchsatz-Datenanalyse und immer leistungsfähigere Statistiken erleichtert.

Die wesentlichen Einschränkungen dieser Technik stammen wie die Algorithmus-Funktionen. Zuerst wird der Algorithmus nur Kreise erzeugen. Während Cryptococcus -Zellen und ihre Kapseln auf eine kreisförmige Morphologie nehmen, wäre es schwierig, diese Technik auf unrunde Objekterkennung anzuwenden. Zweitens wegen wie Kreisen erkannt werden kann der CHT-Algorithmus enorme Pseudo-Kreise, die basierend auf den äußeren Rändern der mehreren gruppierten Kreise erkennen. Jedoch kann jeder falsch Zellkörpern gefangen innerhalb des Pseudo-Kreises leicht erkannt und aus den daraus resultierenden Datensätzen entfernt.

Diese Technik dient zur Messung der kreisförmigen Polysaccharid-Kapseln Cryptococcus Arten basierend auf Tusche Hellfeld Mikroskopieren; Obwohl es auf angewendet werden könnte basiert anderen Kontrast kreisförmiges Objekt Messungen.

Einleitung

Cryptococcus Neoformans ist eine Pathogene Hefe gefunden ubiquitär rund um den Globus, der menschliche Krankheit in erster Linie bei immunsupprimierten Populationen zugeordnet ist. C. Neoformans macht vor allem eine wesentliche Ursache der Gesamtzahl der jährlichen Todesfälle im subsaharischen Afrika aufgrund von Infektionskrankheiten1. Die großen klinische Manifestation der Cryptococcus-Infektion ist Meningoenzephalitis, die Invasion des zentralen Nervensystems mit Verkehrsmitteln in infizierten Makrophagen (Trojanisches Pferd Weise) folgt oder direkte Kreuzung der Blut - Hirn-Schranke. C. Neoformans drückt verschiedene Virulenzfaktoren, einschließlich der Fähigkeit, an der Temperatur des menschlichen Körpers, Urease-Aktivität, Melanization und Bildung eines Polysaccharid Kapsel2zu replizieren. Die Polysaccharid-Kapsel besteht aus Glucuronoxylomannan und Glucoronoxylomannangalactan Polymeren und Funktionen als Schutzbarriere gegen Faktoren wie Umweltbelastung und Host Immunantworten2zu wiederholen.

Obwohl die Größe der Cryptococcus Polysaccharid Kapsel nicht konsequent Virulenz zugeordnet wurde, gibt es Hinweise darauf, dass es ein Faktor bei der Pathogenese2,3,4,5, 6,7. Kapsel Größe Meningitis Pathologie6zugeordnet ist, kann Makrophagen Möglichkeit Cryptococcus -Infektion5Steuern beeinflussen und wenn abwesend8Verlust der Virulenz führen kann. Folglich, Kapsel Größenmessungen sind häufig in der Cryptococcus Forschung jedoch gibt es keine Fieldwide für eine Kapsel Messmethode.

Derzeit, C. Neoformans Polysaccharid Kapsel Messung basiert auf manuelle Messungen von Mikroskopie-Bildern, und die genauen Methoden der Übernahmen von Bild und Messung unterschiedlich Labors9,10, 11. Ein unmittelbares Anliegen dieser Methode ist, dass einige Studien den Erwerb von Tausenden von Einzelmessungen, der was die Genauigkeit und Zuverlässigkeit erschwert. Außerdem, auch wenn die Ergebnisse veröffentlicht werden, gibt es oft unzureichende Beschreibung des Messverfahrens. Viele Publikationen nicht erklären, wie ihre Messungen gewonnen wurden, welche Brennebene verwendet wurde, wie sie den Schwellenwert für die Kapsel Identifikation bestimmt, ob sie Radius oder Durchmesser, verwendet, ob sie eine Messung oder im Durchschnitt mehrere oder andere Details. Einige Publikationen einzige Staat ihre Methode als welches Programm verwendet wurde, z. B. "Adobe Photoshop CS3 diente, die Zellen zu messen"11. Dieser Mangel an Standardisierung und reporting-Detail kann Reproduzierbarkeit schwierig wenn nicht gar unmöglich machen. Unterschiede in der menschlichen Sehvermögen, Computer Helligkeit, Mikroskop-Einstellungen, schieben Sie Beleuchtung und andere Faktoren können variieren zwischen Einzelpersonen, aber auch zwischen Proben, während Berechnungen anhand der Kennzahlen der Pixelwerte Intensität konstant bleibt und zwischen Proben anwendbar. Diese Technik wurde im Zusammenhang mit der Bereitstellung einer standardisierten, genauen, schnelle und einfachen Technik um Kapseln Größen für ein Feld zu messen, in denen gab es vorher keine, generiert.

Wie bereits erwähnt der CHT-Algorithmus ist seit langem etablierte und Skripts zur automatischen Erkennung Kreise vor geschrieben worden. Diese Methode verbessert in zwei Bereichen, wo andere Skripte kurz fallen würde. Erstens ist einfach Kreise erkennen nicht genug, da zwei verschiedene Kreise mit Cryptococcus Zellen zueinander erkannt werden müssen. Diese Methode speziell erkennt Zellkörper in Kapseln, unterscheidet zwischen den beiden und Berechnungen nur auf die entsprechenden Körper-Kapsel-Paare. Zweitens erworben auch als Anschluss an das gleiche Protokoll, verschiedenen Forschern mit verschiedenen landet Bilder. Dadurch, dass die Ermittler Kontrolle über jeden Algorithmus-Parameter, kann dieses Tool auf verschiedenste Akquisemethoden angepasst werden. Es gibt keine Notwendigkeit für eine standardisierte Umfang, Zielsetzung, Filter und So weiter.

Diese Technik kann leicht auf jede Situation angewendet werden, in denen der Prüfer Kreise innerhalb eines Bildes, dass Kontrast mit ihrer Herkunft zu erkennen muss. Beide Kreise heller und dunkler als ihre Hintergrund erkannt werden kann, gezählt und gemessen, mit dieser Technik.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Tusche Folie

  1. Pipette 10 µL Cryptococcus Probe auf eine Folie. Jede Runde Hefestamm funktioniert aber für dieses Experiment H99 war die einzige Sorte verwendet.
    Hinweis: Wenn die Probe direkt aus Kultur, Medien, Verdünnung 1:2 mit PBS oder Wasser helfen Verklumpung der Tusche zu verhindern.
  2. Pipette 2 µL Indien Tintenfleck auf die Probe und mischen, indem Sie körperlich schieben die Pipettenspitze auf die Probe und in einer kreisförmigen Bewegung verschieben, bis die Tusche gleichmäßig verteilte erscheint.
  3. Platzieren Sie ein Deckglas über der Probe durch Gedrückthalten der linken Kante des Deckglases gegen die Oberfläche der Folie, dann sanft und gleichmäßig Absenken der Gegenseite das Deckglas über die Probe.
  4. Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen für 5 min.
  5. Wenden Sie eine dünne Schicht des Nagellacks sanft auf Deckgläschen Grenze bilden eine Dichtung und bewahren die Tuschefleck an

(2) Imaging-Folie

  1. Platzieren Sie Folien in einem Hellfeld-Mikroskop mit einer Kamera Aufsatz und bekannten Pixel-µm-Konvertierung. Einstellen Sie Filter, Ziele und Kontrast so, dass Zelle Kapseln klar sind und Zellkörper konzentriert, dunkle Bänder sind.
    Hinweis: Verschiedene Filter, Ziele und Kontrasteinstellungen funktioniert, aber ein 20 x Ziel, Ph1 Filter und 2 x 2 binning wird empfohlen.
  2. Sicherstellen Sie, dass das Sichtfeld ist dicht aber nicht überbevölkerten mit Cryptococcus Zellen mit deutlichen Kontrast zwischen Zelle Kapsel und Hintergrund, und richtig fokussiert mit den Zellkörper als ein dunkles Band visualisiert.
    Hinweis: Die genaue Anzahl der Zellen für ein optimales Bild variiert je nach Probe und Ziel verwendet wird. Wichtige Aspekte sind, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht gruppierten oder überlappende sind, dass die Zelle fokale Flugzeuge nicht signifikant unterscheiden, und dass es bedeutende Tusche Flecken deutlich sichtbar im Hintergrund (mindestens 25 % des Feldes).
  3. Speichern Sie Bilder in einem einzelnen Verzeichnis mit klaren Titel, wie die Messung-Algorithmus auf Bilder in einem einzigen Verzeichnis ausgeführt werden wird und die Ausgabe von Daten nach dem Namen der Image-Dateien organisiert werden.

(3) Algorithmus Setup

  1. Installieren Sie Python Version 2.7 von
  2. Weitere Python-Bibliotheken durch Ausführen der Befehle "Pip installieren Kissen" und "Pip installieren Openpyxl".
  3. MATLAB zu installieren, indem Sie die Anweisungen auf
  4. Build die MATLAB-Python-Bibliothek anhand der Anweisungen auf https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html zur Verfügung gestellt.
  5. Laden Sie die drei benötigten Dateien in dieser Handschrift Zusatzmaterialien ("QCA.py", "Analysis2.m" und "TestRun.m") enthalten.
    Hinweis: Diese Dateien können an einem beliebigen Speicherort extrahiert werden, aber alle drei müssen im selben Verzeichnis sein.

4. Verwendung des Algorithmus

  1. Führen Sie die Anwendung durch einen Doppelklick auf QCA.py.
    Hinweis: Die Anwendung kann mehrere Minuten zum starten dauern. Die "QCA.py"-Datei enthält die Programmstruktur, die die "m-" Dateien zum Ausführen des eigentlichen Algorithmus aufruft.
  2. Führen Sie die Schritte im Programm.
    1. Eingabe der Erweiterungstyp Bilddateien zeitlich vorangestellt und durch Semikolons getrennt (ex. ". TIF;. JPEG") dann klicken Sie auf die Enter -Taste.
    2. Wählen Sie das Verzeichnis, in dem die Bilddateien befinden, durch Klicken der Schaltfläche " Verzeichnis auswählen " und wählen Sie den Ordner, der die Bilder enthält.
    3. Erstellen Sie die Liste der Image-Dateien im Verzeichnis durch Anklicken des Buttons Generieren Bildliste . Die Bilder werden in das Textfeld auf der rechten Seite aufgelistet. Zu überprüfen Sie und sicherzustellen Sie, dass die Liste korrekt und vollständig sind.
    4. Wählen Sie ein zufälliges Bild aus der Liste als Vorschau klickst du Zufällige Bild auswählen .
      Achtung: Wenn das Bild nicht in der Lage, durch ein "falsches Bild Modus Fehler" zu öffnen, wird der Algorithmus noch richtig funktionieren trotz das Bild nicht angezeigt. Nach Schritt 4.2.7 zeigt noch das Testbild.
    5. Geben Sie Mikroskopobjektiv und binning Einstellungen ein. Wenn die Standardeinstellungen nicht übereinstimmen das Mikroskop verwendet, wählen Sie "Custom Pixel Konvertierung" und geben Sie die Pixel-auf-um Konvertierung für die Image-Dateien. Einmal ausgewählt, klicken Sie auf Berechnen, Konvertierung und sicherzustellen Sie, dass die Konvertierung richtig laut das Textfeld auf der rechten Seite ist.
      Hinweis: Repräsentative in Abbildung 1 gezeigten Bilder wurden mit 40 x Vergrößerung und 2 x 2 binning ausgewählt berechnet.
    6. Eingabeparameter für die Kreis-Erkennung Algorithmus.
      1. Geben Sie den minimalen und maximalen Radius nachweisbar für die äußeren Kapsel Erkennung als Min und Max Kapsel Radius Einträge. Eine geringere Reichweite ermöglicht genauere Ergebnisse.
      2. Geben Sie den minimalen und maximalen Radius nachweisbar für die Zellkörper Erkennung als Min und Max Zellkörper Radius Einträge.
        Hinweis: Alle vier dieser Einträge sollte zahlen für ihre jeweiligen Werte in Pixel, nach der Quellbilder.
      3. Bewegen Sie die Kapsel und Zellkörper Empfindlichkeit Schieberegler die Sensibilitätsschwelle des Algorithmus anpassen. Eine geringe Empfindlichkeit wird streng sein und falsche positive Kreis Erkennung reduzieren, sondern auch weniger echte Kreise erkennen kann. Im Gegensatz dazu eine hohe Empfindlichkeit erhöht die Erkennungsrate aber auch unter Umständen falsche positive Kreise.
        Hinweis: Repräsentative Ergebnisse wurden mit einer Kapsel Mindestradius von 7, Kapsel Maximalradius von 45, minimale Körper Radius von 4, maximale Körper Radius von 30, Kapsel Empfindlichkeit von 87 und Körper Empfindlichkeit von 87.
    7. Prüfparameter auf zufällig ausgewählten Bild durch Anklicken der Schaltfläche Testen . Das Ergebnis erscheint oben in der Mitte des Programms, das ursprüngliche Bild zu ersetzen. Wenn die Ergebnisse genauer betrachten, empfiehlt es sich, wählen ein zusätzliche zufällige Bild, als auch zu versuchen, um sicherzustellen, dass die ausgewählten Parameter werden alle ausgewählten Bilder passen.
      1. Maximieren Sie die Anzahl der Körper und Kapseln erkannt und visuell zu kontrollieren, ob die Kreise scheinen richtig passen. Die Anzahl der Körper in Kapseln erkannt wird in das Textfeld auf der rechten Seite angezeigt. Anderweitig, die Algorithmus-Parameter zu bearbeiten, bis die Ergebnisse genau sind.
        Hinweis: Die dicken farbigen Kreise sollen nur mit Visualisierung helfen. Die tatsächliche Kreise erzeugt für die Messung ist eine mathematische Kurve, die durch die HCT-Algorithmus berechnet.
    8. Führen Sie des Erkennungsalgorithmus auf das gesamte Verzeichnis von Image-Dateien durch Klicken auf die Schaltfläche Beginnen Analyse . Jedes Bild analysiert werden und das Programm zeigt "fertig" in das Textfeld auf der rechten Seite wenn alle Bilder analysiert wurden.
    9. Klicken Sie auf Spiel und Bereinigung . Dies wird entsprechen erkannten Zellkörper, die erkannten Kapseln, die, denen Sie Ihren Wohnsitz, und den wahre Kapsel Radius durch Subtraktion Körper von Kapsel zu berechnen.
      Hinweis: Wenn der Algorithmus verwendet wird, um Fluoreszenz erkennen oder eine andere Situation, in denen nur ein Kreis ist, dieser Schritt erkannt ist unnötig. Stattdessen klicken Sie Nur ziehen Körper oder die Schaltfläche " Nur ziehen Kapseln " zum Sammeln der Daten für nur blau oder nur die grüne Kreise, beziehungsweise. Es ist wichtig zu beachten, dass wenn nur die Kapsel Daten abgerufen werden der Radius der Gesamtradius des der Zelle wird als Referenz der Radius der Zellkörper nicht abgezogen werden könnte.
    10. Suchen Sie die fertigen Daten in der Datei "CleanedOuput.csv" im Bildverzeichnis. Wenn nur ein Datenelement ausgewählt wurde, wird die Datei "CleanedBodies.csv" oder "CleanedCapsules.csv" beschriftet.

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Ergebnisse

Bilder werden zuerst durch Mikroskopie von Tusche Dias mit einem Hellfeld-Mikroskop gekoppelt mit einer Kamera (Abb. 1A) gewonnen. Es ist wichtig, Zellen getrennt und in ausreichend niedrigen Dichte nicht um das Blickfeld, als auch zu überwältigen, genügend Fleck zu verwenden, um Kontrast zwischen Zellen und Hintergrund zu schaffen haben. Wie im Protokoll erwähnt, variiert die genaue Anzahl der Zellen für ein optimales Bild je nach der Probe,...

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Diskussion

Die entscheidenden Schritte dieser Technik bereiten die Tusche Folie und die Mikroskopbilder zu erwerben. Während der Algorithmus erfolgreich, mit einer Vielzahl von Folie und Bild Techniken getestet wurde wird die empfohlene Protokoll in diesem Manuskript beschrieben. Die Polysaccharid-Kapsel wird erkannt, basierend auf den Ausschluss von Indien Tintenpartikel aus der Domäne der Kapsel, da diese Teilchen zu groß sind, um das Polysaccharid Fibrille Netzwerk eindringen. Tusche Ausgrenzung führt zu einem hellen Kreis auf e...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Danksagungen

Wir würden gerne anerkennen, Anthony Bowen deren Folien als einen zweiten menschlichen Side-by-Side-Vergleich dienten als auch Sabrina Nolan deren Folien als dritte menschliche Side-by-Side und zweite Mikroskop Vergleich verwendet wurden.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
TuscheBecton, Dickinson und Co.
Fisherbrand Superfrost ObjektträgerFisher Scientific12-550-14325x75x1
Fisherfinest Premium DeckglasFisher Scientific12-548-B22x22-1
Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear NagellackSally HansenN/A109 unsichtbar
SAB MediaSigmaS3306
Cryptotoccus neoformansATCC208821H99 Stamm
Olympus AX70 MikroskopOlympusAX70TRFEingestellt ; Hellfeldmikroskop
Qimaging Retiga 1300QimagingN/AEingestellt ; Kamera Mikroskop Aufsatz
MATLABMathWorksN/ANeueste Version empfohlen
Python ProgrammiersprachePythonN/AVersion 2 notwendig ; 2.7 empfohlen
Microsoft ExcelMicrosoftN/ANeueste Version empfohlen
Phosphate Buffered Saline (PBS)SigmaP3813
261194

Referenzen

  1. Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
  2. Kwon-Chung, K. J., et al. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis. Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760(2014).
  3. Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide. J Clin Invest. 76 (2), 508(1985).
  4. Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis. Neurology. 80 (7), Supplement (P04.007) 007(2013).
  5. Bojarczuk, A., et al. Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection. Sci Rep. 6, (2016).
  6. Robertson, E. J., et al. Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis. J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).
  7. Araujo, G. deS., et al. Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells. PLoS One. 7 (1), 29561(2012).
  8. García-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan. Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).
  9. Guimarães, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule. Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).
  10. Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2. Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).
  11. Rossi, S. A., et al. Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates. Front Microbiol. 7, (2016).

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Schlagwörter

Messung der Cryptococcus Kapselautomatisierte KapselanalyseCircle Hough TransformationIndientintenschenkungZellk rperdetektionPolysaccharid KapselanalyseHellfeldmikroskopieBild ThresholdingAbgleich von Kapsel und Zellk rperHochdurchsatzmessung

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