Dieses Verfahren beschreibt eine automatisierte Batch-Bildprozessor Polysaccharid Kapsel und Körper Radien messen soll. Während ursprünglich für Cryptococcus Neoformans Kapsel Messungen entwickelt, die automatisierte Bildverarbeitung auch auf andere Grundlage Kontrasterkennung kreisförmigen Objekte angewendet werden kann.
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Methodenartikel
Automatisierte Messung von Cryptococcus Arten Polysaccharid-Kapsel und Zellkörper
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Diese Technik soll einen konsistente, präzise und überschaubaren Prozess für eine große Anzahl von Polysaccharid Kapsel Messungen zur Verfügung zu stellen.
Zunächst wird eine Schwelle Bild basierend auf Intensitätswerte eindeutig berechnet für jedes Bild generiert. Dann Kreise basierend auf Kontrast zwischen Objekt und Hintergrund mit dem etablierten Kreis Hough-Transformation (CHT)-Algorithmus erkannt. Schließlich erkannten Zelle Kapseln und Einrichtungen sind je nach Zentrum koordiniert und Radius Größe abgestimmt, und Daten werden dem Benutzer in einer überschaubaren Tabelle exportiert.
Die Vorteile dieser Technik sind einfache, aber wichtige. Erstens, weil diese Berechnungen durch einen Algorithmus anstatt ein Mensch Genauigkeit und Zuverlässigkeit erhöht. Es ist kein Rückgang der Genauigkeit oder Zuverlässigkeit unabhängig davon, wie viele Proben analysiert werden. Zweitens stellt dieser Ansatz eine potenzielle Betriebsanweisung für das Cryptococcus -Feld statt der aktuellen Situation wo Kapsel Messung variiert nach Labor je. Drittens manuelle Kapsel Messungen sind langsam und monoton, ermöglicht Automatisierung schnelle Messungen auf große Zahlen von Hefezellen, die wiederum Hochdurchsatz-Datenanalyse und immer leistungsfähigere Statistiken erleichtert.
Die wesentlichen Einschränkungen dieser Technik stammen wie die Algorithmus-Funktionen. Zuerst wird der Algorithmus nur Kreise erzeugen. Während Cryptococcus -Zellen und ihre Kapseln auf eine kreisförmige Morphologie nehmen, wäre es schwierig, diese Technik auf unrunde Objekterkennung anzuwenden. Zweitens wegen wie Kreisen erkannt werden kann der CHT-Algorithmus enorme Pseudo-Kreise, die basierend auf den äußeren Rändern der mehreren gruppierten Kreise erkennen. Jedoch kann jeder falsch Zellkörpern gefangen innerhalb des Pseudo-Kreises leicht erkannt und aus den daraus resultierenden Datensätzen entfernt.
Diese Technik dient zur Messung der kreisförmigen Polysaccharid-Kapseln Cryptococcus Arten basierend auf Tusche Hellfeld Mikroskopieren; Obwohl es auf angewendet werden könnte basiert anderen Kontrast kreisförmiges Objekt Messungen.
Einleitung
Cryptococcus Neoformans ist eine Pathogene Hefe gefunden ubiquitär rund um den Globus, der menschliche Krankheit in erster Linie bei immunsupprimierten Populationen zugeordnet ist. C. Neoformans macht vor allem eine wesentliche Ursache der Gesamtzahl der jährlichen Todesfälle im subsaharischen Afrika aufgrund von Infektionskrankheiten1. Die großen klinische Manifestation der Cryptococcus-Infektion ist Meningoenzephalitis, die Invasion des zentralen Nervensystems mit Verkehrsmitteln in infizierten Makrophagen (Trojanisches Pferd Weise) folgt oder direkte Kreuzung der Blut - Hirn-Schranke. C. Neoformans drückt verschied....
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Protokoll
1. Vorbereitung der Tusche Folie
- Pipette 10 µL Cryptococcus Probe auf eine Folie. Jede Runde Hefestamm funktioniert aber für dieses Experiment H99 war die einzige Sorte verwendet.
Hinweis: Wenn die Probe direkt aus Kultur, Medien, Verdünnung 1:2 mit PBS oder Wasser helfen Verklumpung der Tusche zu verhindern. - Pipette 2 µL Indien Tintenfleck auf die Probe und mischen, indem Sie körperlich schieben die Pipettenspitze auf die Probe und in einer kreisförmigen Bewegung verschieben, bis die Tusche gleichmäßig verteilte erscheint.
- Platzieren Sie ein Deckglas über der Probe durch Gedrückthalten der linken Kante des Deckglases gegen die Oberflä....
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Ergebnisse
Bilder werden zuerst durch Mikroskopie von Tusche Dias mit einem Hellfeld-Mikroskop gekoppelt mit einer Kamera (Abb. 1A) gewonnen. Es ist wichtig, Zellen getrennt und in ausreichend niedrigen Dichte nicht um das Blickfeld, als auch zu überwältigen, genügend Fleck zu verwenden, um Kontrast zwischen Zellen und Hintergrund zu schaffen haben. Wie im Protokoll erwähnt, variiert die genaue Anzahl der Zellen für ein optimales Bild je nach der Probe,.......
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Diskussion
Die entscheidenden Schritte dieser Technik bereiten die Tusche Folie und die Mikroskopbilder zu erwerben. Während der Algorithmus erfolgreich, mit einer Vielzahl von Folie und Bild Techniken getestet wurde wird die empfohlene Protokoll in diesem Manuskript beschrieben. Die Polysaccharid-Kapsel wird erkannt, basierend auf den Ausschluss von Indien Tintenpartikel aus der Domäne der Kapsel, da diese Teilchen zu groß sind, um das Polysaccharid Fibrille Netzwerk eindringen. Tusche Ausgrenzung führt zu einem hellen Kreis auf e.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Danksagungen
Wir würden gerne anerkennen, Anthony Bowen deren Folien als einen zweiten menschlichen Side-by-Side-Vergleich dienten als auch Sabrina Nolan deren Folien als dritte menschliche Side-by-Side und zweite Mikroskop Vergleich verwendet wurden.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Tusche | Becton, Dickinson und Co. | ||
| Fisherbrand Superfrost Objektträger | Fisher Scientific | 12-550-143 | 25x75x1 |
| Fisherfinest Premium Deckglas | Fisher Scientific | 12-548-B | 22x22-1 |
| Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nagellack | Sally Hansen | N/A | 109 unsichtbar |
| SAB Media | Sigma | S3306 | |
| Cryptotoccus neoformans | ATCC | 208821 | H99 Stamm |
| Olympus AX70 Mikroskop | Olympus | AX70TRF | Eingestellt ; Hellfeldmikroskop |
| Qimaging Retiga 1300 | Qimaging | N/A | Eingestellt ; Kamera Mikroskop Aufsatz |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Neueste Version empfohlen |
| Python Programmiersprache | Python | N/A | Version 2 notwendig ; 2.7 empfohlen |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | Neueste Version empfohlen |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P3813 |
Referenzen
- Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS. AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).
- Kwon-Chung, K. J., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
