Method Article

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

DOI:

10.3791/56969

⸱

August 28th, 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Purdue University

In This Article

Summary

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Gezielte Genom-Bearbeitung im Modellsystem Danio Rerio (Zebrafisch) wurde durch das Aufkommen von CRISPR-basierte Ansätze erheblich erleichtert. Hier beschreiben wir eine schlanke, robuste Protokoll für Erzeugung und Identifizierung von CRISPR-abgeleitete Unsinn Allele, die Heteroduplex Mobility Assay integriert und Identifizierung von Mutationen mit Next Generation Sequencing.

Abstract

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Charakterisierung von gruppierten, regelmäßig dazwischen, werden kurze, palindromische (CRISPR) System von Streptococcus Pyogenes ermöglichte die Entwicklung einer anpassbaren Plattform schnell gen Änderungen in einer Vielzahl von generieren Organismen, einschließlich Zebrafisch. CRISPR-basierte Genom-Bearbeitung verwendet eine einzelne Guide RNA (SgRNA) Ziel einer CRISPR-assoziierten (Cas)-Endonuklease genomische DNA (gDNA) Ziel von Interesse, wo die Cas-Endonuklease erzeugt eine Doppel-Strang-Pause (DSB). Reparatur von DSB durch fehleranfällige Mechanismen führen zu Einfügungen oder Löschungen (Indels). Dadurch können Frameshift-Mutationen, die oft ein vorzeitiges Stopcodon innerhalb der kodierenden Sequenz, wodurch ein Protein-Null-Allel einführen. CRISPR-basierte Genom Engineering erfordert nur wenige molekularen Komponenten und ist leicht durch Mikroinjektion in Zebrafisch-Embryonen eingeführt. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden CRISPR Reagenzien für Zebrafisch Mikroinjektion zu generieren und Fische ausstellenden Germline Übertragung von CRISPR-modifizierte Gene identifizieren. Diese Methoden umfassen die in Vitro Transkription von SgRNAs, Mikroinjektion CRISPR Reagenzien, Identifizierung der Indels induziert in der Ziel-Site mit einer PCR-basierten Methode ein Heteroduplex Mobility Assay (HMA) und Charakterisierung der Indels genannt mit einem niedrigen Durchsatz und eine leistungsfähige Next Generation Sequencing (NGS)-basierenden Ansatz, die mehrere PCR-Produkte von heterozygoten Fisch gesammelt analysieren können. Dieses Protokoll wird optimiert, um die Anzahl der Fische erforderlich und welche Ausrüstung benötigt, um die Analysen zu minimieren. Darüber hinaus ist dieses Protokoll so konzipiert, zugänglich für den Einsatz von Labor-Personal von allen Ebenen der Erfahrung unter anderem Studenten, ermöglicht dieses mächtige Werkzeug jede Forschungsgruppe Interesse CRISPR-basierte wirtschaftlich eingesetzt werden Genomic Änderung im Zebrafisch.

Introduction

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Die Erhaltung der molekularen Maschinerie in Eukaryoten zugrunde liegt die Macht der Verwendung Modellorganismen für die Forschung. Viele dieser Modellsysteme erleichtern die Verwendung von Reverse-gentechnische Ansätze wie gezielte gen Knockouts, den Beitrag eines gen-Produktes um einen biologischen oder Krankheit Prozess zu charakterisieren. Gen Störung Techniken in Organismen wie dem Zebrafisch haben sich historisch auf gezieltes einbringen von Frameshift-Mutationen verlassen, die durch ungenaue Reparatur von DSB1,2entstehen. Wenn ein DSB in das Genom eingebracht wird, ist die DNA-Läsion durch einen der beiden Wege, die universell in fast allen Arten von Zellen und Organismen vorhanden sind repariert: nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) und unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR)3,4 . Die Ungenauigkeit der NHEJ Maschinen produziert häufig Indels von verschiedenen Längen5,6,7,8,9. Einführung von Frameshift-Mutationen in der kodierenden Sequenz eines Gens kann ein vorzeitiges Stopcodon produzieren, die oft das Gen nicht funktionsfähig macht.

Frühen Genom engineering Strategien im Zebrafisch Förderung Indels enthalten Meganucleases, Zinkfinger-Nukleasen und Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen, die DNA-Protein Interaktionen um eine Nuclease auf einen bestimmten genomische gezielt genutzt Ziel, wo es ein DSB10,11,12,13,14,15eingeführt. Diese Technologien sind jedoch oft schwierig, gelten aufgrund der aufwändige und komplexe Technik musste eine Nuklease zu generieren, die die DNA Reihenfolge des Interesses richtet sich an. Im Gegensatz zu bisherigen Strategien verlassen CRISPR-basierte gen bearbeiten nicht auf Protein-DNA-Wechselwirkungen für die Zielgruppenadressierung. Stattdessen CRISPR-assoziierten (Cas)-Endonuklease über eine RNA-Leitfaden richtet sich das Nukleotid base pairing Interaktionen verwendet, um gezielt eine genomische Website Interesse16,17,18,19 ,20,21. Aufgrund der Einfachheit der Gestaltung einer RNS ist Guide mit der gewünschten Basis Paarung Interaktionen für die Zielgruppenadressierung es relativ einfach, die Cas-Endonuklease an den gewünschten Ort zu richten. Typ II CRISPR-System wurde vor allem weit entwickelt für Genom-editing-Anwendungen durch mehrere vorteilhafte Eigenschaften, einschließlich der Verwendung von einem einzigen multidomain Cas-Nuklease (Cas9), die Interaktion mit DNA Endonuklease Aktivität stimulieren erfordert und von einer einzigen Führer RNS (SgRNA) nutzen, um es auf den cognate DNA-Sequenz18Ziel. Voraussetzungen die Sequenz für das targeting von verwandten SgRNA sind gut verstanden19, und die gewünschte SgRNA wird leicht durch in Vitro Transkription generiert. Die Einfachheit und Robustheit der CRISPR/Cas9 Ansatz erleichtert die gezielte gentechnische Veränderung im Zebrafisch und eine Vielzahl von anderen Organismen.

Die verbesserte Fähigkeit zu übernehmen hat gezielte Genom-Bearbeitung im Zebrafisch als Folge entwickeln CRISPR-basierte Reagenzien erheblich erhöht die Möglichkeit, Prozesse Sinnbild für Wirbeltiere Organismen wie Entwicklung der das zentrale Nervensystem zu studieren System. Das Zebrafish Genom enthält Orthologe von 70 % der Protein-kodierenden Gene im menschlichen Genom sowie 84 % der Gene im Zusammenhang mit Krankheiten im Menschen22gefunden. Zebrafisch Entwicklung weist mehrere wichtige Eigenschaften, die seine Verwendung in umgekehrter genetische Studien zu verbessern: die Embryonen sind in große Gelege gelegt, nach außen zu entwickeln, von der Mutter, so dass sie offen für genetische Manipulation durch Mikroinjektion und Erwachsenen Zebrafisch geschlechtsreif mit 3 Monaten, so dass für die rasche Ausbreitung der gewünschten Linien23.

Zahlreiche Protokolle stehen zur Verfügung, die beschreiben eine Vielzahl von Ansätzen zu generieren und zu identifizieren CRISPR-abgeleitete Indels im Zebrafisch24,25,26,27,28,29 ,30,31. Aber viele dieser Verfahren sind zeitintensiv, benötigen Zugriff auf teure Ausrüstung und können schwierig sein, für Labors mit begrenzten Kompetenzen. Die hier beschriebenen Schritte bieten eine einfache, robuste und wirtschaftliche CRISPR/Cas9-Strategie zu Ingenieur Zebrafisch ko-Linien. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines hocheffizienten Kit SgRNAs mit DNA-Oligonukleotide (Oligos) zu synthetisieren, ähnlich wie andere Ansätze, die zuvor beschriebenen32. Das beschriebene Protokoll umfasst zwei Schritte insbesondere, die Analyse der CRISPR mutiert erheblich vereinfachen: Schritt für Schritt Verwendung der PCR-basierter HMA33 , leicht feststellen, das Vorhandensein von Genom-Modifikationen und Sequenzierung Analyse der heterozygot Zebrafisch, schnell und einfach die Natur mehrere Indels auf wirtschaftliche Weise zu bestimmen. Darüber hinaus sind schrittweise Anleitungen für robuste Auswahl, zuverlässige Produktion und Injektion des Guide RNAs enthalten. Die hier angegebenen Schritte veranschaulichen eine robustere, relativ kostengünstige Protokoll, die Laborpersonal mit ein Spektrum an Fachwissen zur Identifizierung des Gens Knockouts im Zebrafisch beitragen kann.

Protocol

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Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Purdue Animal Care und Use Committee (PACUC Anzahl 31.08.11) genehmigt.

1. Design der Vorlage-spezifische Oligos für Guide RNA-Produktion

  1. Wählen Sie die Zielregion des Interesses in der kodierenden Region des Gens geändert werden. Dies sollte in der Nähe von 5'-Ende des Gens zu einem verkürzten Protein erzeugen, aber nicht so nah, so dass eine spätere in-Frame Start-Codon ermöglicht die Produktion eines Proteins mit einer bescheidenen N-terminale abschneiden.
    Hinweis: Eine Möglichkeit um diese Möglichkeit auszuschließen ist die nachgelagerte kodierende Region des Gens zu scannen, für ein in Frame start Codon. Darüber hinaus kann mit einem Führer RNA, die Mitte des großen Exon abzielt, helfen, um PCR-Primer für die anschließende Bewertung der daraus resultierenden Indel zu identifizieren.
  2. Identifizieren potenzielle Reiseführer-Standorte in der genomischen Region von Interesse, die mit einem Führer RNA Auswahl programmieren (siehe Tabelle der Materialien)34,35,36. Legen Sie die Browserdaten auf Danio Rerio und die Protospacer angrenzenden Motiv (PAM) Sequenz 5'-NGG-3 ".
    Hinweis: Ideal gRNA Sequenzen enthalten einen 5′-G in der ersten Position des gRNA für effiziente T7 in Vitro Transkription. Wenn keine akzeptablen Führung mit einem G an der 5 '-Position gefunden wird, 5′ Ende einen anderen Führer jederzeit verändert werden kann ein G oder ein G auf 5 '-Ende des Leitfadens RNA hinzugefügt werden kann, aber dies kann schneiden Effizienz37reduzieren. Um die Schnittleistung zu maximieren, hat eine optimale Führer-Sequenz GC-Gehalt von 40-80 % (höher ist besser), und enthält eine G an der 20th Position, angrenzend an die PAM, aber ist nicht erforderlich-38. Ein Beispiel für eine ideale targeting-Sequenz: 5′ - G (N)18 G-3′ - NGG (NGG ist PAM). Neben der Untersuchung der Ergebnisse aus der Anleitung RNA Auswahlprogramm, optimale Guide RNAs wie oben beschrieben zu identifizieren, sollte darauf geachtet werden, um Guide RNAs mit vorhergesagten starken Ziel-Effekte zu vermeiden die nachgelagerte Analyse erheblich erschweren. Insbesondere führen Sie RNAs mit prognostizierten Auswirkungen des Ziel-Codierung Regionen fallen sollte ausgeschlossen werden, sodass die Summe aus Ziel-Sites vorhergesagt minimiert werden.
  3. Aus der Ausgabe des Guide RNA-Design-Tool, ausschließen die PAM-Sequenz (5 '-NGG-3 '); Es ist nicht für die Zielgruppenadressierung verwendet sondern umfasst die erkennungssequenz für Cas9 Dekolleté.
  4. Die verbleibenden 20 Nukleotiden (Nts) hinzufügen, die T7 promotorsequenz und die Überlappung Sequenz (Region komplementär zu einem Gerüst Oligo verwendet, um in voller Länge SgRNAs beiliegenden Empfohlene in Vitro Transkription synthetisieren) in der angegebenen Reihenfolge unten, um eine 54 nt Oligo erhalten: T7 promotorsequenz: 5 '-TTCTAATACGACTCACTATA-3 '; RNA-Sequenz 5 ' - G (N)18 G zu führen-3′; Überschneiden sich die Sequenz: 5 '-GTTTTAGAGCTAGA-3 '
  5. PCR-Primer, die die vorhergesagte geschnittenen Seite flankieren zu identifizieren (Cas9 spaltet 3 nt stromaufwärts der PAM-Sequenz) in einem Abstand von 50 – 150 Basenpaare (bp) jeder aus dem Schnitt mit Web-basierte Software (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Diese werden in einem späteren Schritt für die Messung der Schneideffizienz verwendet werden. Wenn keine geeigneten Primer verwenden diese Einschränkungen festgestellt werden, müssen möglicherweise eine andere Anleitung RNA-Website angesehen werden.
  6. Bestellen Sie 54 nt Oligonukleotide, die Anleitung zu produzieren RNA und PCR-Primer für die Analyse von der Ziel-Sites (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Als eine optionale Positivkontrolle, es kann hilfreich sein, eine SgRNA Ausrichtung auf ein Gen notwendig für die Produktion von Pigment zu überprüfen, die Leistung dieses Protokolls mit einer leicht erzielte visuelle Phänotyp erzeugen (siehe Abbildung 1 für repräsentative Ergebnisse). Ein gemeinsames Ziel ist die gen Tyrosinase, mit Hilfe der Oligo (Guide RNA-Sequenz ist unterstrichen)39: 5 '-TTCTAATACGACTCACTATAGGACTGGAGGACTTCTGGGGGTTTTAGAGCTAGA-3′

2. Vorbereitung der CRISPR-Reagenzien für Embryo Mikroinjektion

  1. Bestellen im Handel erhältlichen Cas9 Protein (siehe Tabelle der Materialien).
    Hinweis: Injektion von Cas9 mRNA kann auch verwendet werden, Indels im Zebrafisch40,41, generieren jedoch Zebrafish Embryos Mikroinjektion mit Cas9 Protein erwiesen hat, eine effizientere32,42.
    1. Aussetzen des Cas9-Proteins in den mitgelieferten Puffer, 1 mg/mL Lösung zu generieren. Speichern Sie die Lösung in Injektion einsetzbaren Aliquote in PCR-Röhrchen bei-80 ° C, die Anzahl der Frost-Tau-Zyklen zu minimieren. Zum Generieren einer 5 µL Injektionslösung, 2 µL von 1 mg/mL Cas9 Lösung verwendet wird, kann daher die Cas9 regelmäñig in 2 µL-Aliquots mit PCR-Streifen-Rohre sein.
  2. Die SgRNA mit der SgRNA in Vitro Transkription zu synthetisieren kit (siehe Tabelle der Materialien). Führen Sie die in-vitro- Transkription gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    Hinweis: Pflegen Sie RNase-freie Technik bei allen Synthese, clean-Up und Injektion Vorbereitung Lösungsschritte. Beispielsweise verwenden Sie Einweg-Handschuhe und häufig ändern, verwenden Sie Rohre und Tipps, die zertifizierte RNase-freie und saubere Oberflächen und Pipetten mit im Handel erhältlichen Lösungen, Labware zu dekontaminieren sind (siehe Tabelle der Materialien).
  3. Reinigen Sie die synthetisierte SgRNA mit einem Ammoniumacetat/Niederschlag mit RNase-freie Technik.
    Hinweis: Alternativ kann SgRNAs gereinigt werden, mit einer Vielzahl von im Handel erhältlichen spaltenbasierten RNA Aufräumen Kits für einen relativ geringen Kosten.
    1. Fügen Sie 25 µL 5 M Ammoniumacetat und Vortex, gründlich mischen.
      Hinweis: Ammonium-Acetat-Lösung ist im Handel erhältlich (siehe Tabelle der Materialien), oder eine 5 M Lösung indem 385,4 mg der molekularen Grade Ammoniumacetat zu 1 mL der RNase-freies Wasser im Haus gemacht und bei-20 ° c gelagert werden können
    2. 150 µL 200-Nachweis Nuklease-freie Ethanol zu jeder Probe hinzufügen. Legen Sie die Reaktion in einem-80 ° C Gefrierschrank für mindestens 20 Minuten.
      Hinweis: Die Proben können über Nacht bei-80 ° C gelagert werden, aber nicht erheblich die Gesamtausbeute RNA.
    3. Zentrifugieren Sie Proben mit maximaler Geschwindigkeit (> 16.000 x g) in einem Microcentrifuge 4 ° C für 20 Minuten.
    4. Entfernen Sie den überstand vorsichtig, durch pipettieren langsam die Flüssigkeit, die sicherstellen, dass die RNA-Pellet nicht gestört wird.
    5. Fügen Sie 1 mL 70 % igem Ethanol (erstellt von Nuklease-freie Ethanol in RNase-freies Wasser verdünnen) und mischen Sie vorsichtig die Röhre durch invertieren es mehrere Male, Salz aus der Tube zu waschen.
    6. Wiederholen Sie die Zentrifugationsschritt für 7 Minuten.
    7. Entfernen des Überstands durch erste pipettieren aus den meisten der Lösung mit einer Pipette P1000, dann mit einer Pipette P200 um so viel Lösung wie möglich zu entfernen, ohne das Pellet sind. Trocknen der RNA-Pellets in einem sauberen Raum, wie eine laminare Strömung Kapuze oder einen Tisch, achtgeben, RNase Kontamination zu vermeiden, für 15 Minuten oder bis keine Flüssigkeit mehr Tropfen sind sichtbar in der Röhre.
    8. Das Pellet in 30 µL RNase-freies Wasser aufschwemmen, das Produkt (zum Beispiel mit einem Spektralphotometer) und die aliquoten die Lösung für die langfristige Lagerung in einem-80 ° C Gefrierschrank zu quantifizieren.
      Hinweis: Typische Konzentrationen reichen von 800 – 2.500 ng/µL.
  4. (OPTIONAL) Stellen Sie sicher, dass Full-Length RNA mit Harnstoff/Seite generiert wurde. Alternativ verwenden Sie eine Agarosegel, um sicherzustellen, dass die RNA intakt ist.
    Hinweis: Allerdings Wenn eine Agarosegel verwenden muss eine größere Menge an gRNA ausgeführt werden, um die RNA zu visualisieren, und die Länge kann nicht genau bestimmt werden. Wenn die Effizienz der Ziel schneiden nach der Injektion der Reagenzien in den Fisch zu analysieren, wenn gibt es keine oder nur wenig schneiden vorhanden, sollte die SgRNA für den Abbau überprüft werden.
    1. Gegossen Sie eine 8 % Polyacrylamid-Gel in TBE mit 40 % Polyacrylamid (19:1) und 8 M Harnstoff mit RNAse-freie Technik für die Lösungen und Ausrüstung43.
      Hinweis: Im Handel erhältliche Materialien können verwendet werden, um Ausrüstung zu reinigen (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Nachdem das Gel (ca. 30 min) völlig erstarrt ist, das Gel equilibrate, indem man sie in TBE Puffer ausgeführt und Durchführung von Elektrophorese für 30 min bei 5 V/cm.
    3. Mix 300 – 500 ng des SgRNA mit einem gleichen Volumen 2 x RNA Gel laden färben (siehe Tabelle der Materialien). Mit einem P1000, deaktivieren Sie die Brunnen von jeglichen Schmutz durch pipettieren Puffer in jeder gut mehrere Male ausgeführt. Laden Sie die Lösung(en) und führen Sie das Gel mit 10 V/cm für 2,5 h.
      Hinweis: Eine Marker-Spur hier ist nützlich, um die Länge der RNA zu visualisieren ist jedoch nicht erforderlich; im Allgemeinen ist es leicht ersichtlich, wenn volle Länge RNA wurde synthetisiert (Abbildung 2).
    4. Visualisieren Sie die Bänder mit einer Nukleinsäure Fleck (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: SgRNA Streifen sollte als ein einzelnes Band erscheinen, während Verschmieren RNA-Abbau (Abbildung 2) zeigt.

3. die Mikroinjektion CRISPR-Komponenten in Zebrafish Embryos

  1. Richten Sie Zucht Panzer die Nacht vor der Injektion, indem man die Anzahl der gewünschten Männchen und Weibchen (in der Regel 2 Hündinnen und 1 oder 2 Männchen) in einem Zucht-Tank mit einer Trennwand in Platz44.
  2. Bereiten Sie eine Mikroinjektion-Platte mit 1,5 % Agarose in 1 x E3 Medien (siehe Tabelle der Materialien) mit 0,01 % Methylenblau (Fungizid) durch Gießen 35 mL geschmolzene Agarose in einer 10 cm Petrischale und sanft legen eine Kunststoff-Formenbau erstellen keilförmigen Tröge in der Lösung, tippen auf die Form, um Luftblasen zu beseitigen.
  3. Ermöglichen die Agarose festlegen und speichern Sie die Schale mit einer kleinen Menge von Medien und eingehüllt in Paraffin Film zu verhindern, dass die Platte Austrocknen bei 4 ° C.
    Hinweis: Injektion Platten sind wiederverwendbar für mehrere Wochen, bis der Brunnen deformiert oder trocken werden, oder die Platte zu Schimmel zu wachsen beginnt.
  4. Am Morgen des Einspritzen tauen Sie gereinigtes SgRNA und Cas9 Protein auf Eis. Denken Sie daran, alle Materialien mit Handschuhen, RNase Kontamination zu verhindern und RNase-freie Tipps und Rohre verwenden zu behandeln.
  5. Generieren Sie eine 5 µL Injektionslösung durch die Kombination von Cas9 Protein und die SgRNA in einem 2:1-Verhältnis von Cas9:sgRNA zu Endkonzentrationen von 400 Pg/nL Cas9 Protein und 200 Pg/nL SgRNA. Inkubieren Sie die Cas9/SgRNA-Lösung bei Raumtemperatur für 5 min um Cas9 und SgRNA bilden eine komplexe Ribonucleoprotein. Hinzufügen von 0,5 µL 2,5 % wt/Vol Phenol Red Lösung (siehe Tabelle der Materialien), und RNase-freies Wasser zu einem Endvolumen von 5 µL.
    Hinweis: Die Ionenstärke der Lösung nachweislich Einfluss auf die Löslichkeit der Cas9/SgRNA-Komplex, daher der Zusatz von KCl schneiden SgRNAs Effizienzsteigerung kann die niedrige Indel Bildung28aufweisen.
  6. Machen Sie eine Injektionsnadel durch Ziehen einer 1,0 mm Glas Kapillare mit einer Mikropipette Puller. Schneiden Sie die Spitze der frisch zubereitete Nadel mit einer neuen Rasierklinge oder Zange eine abgewinkelte Öffnung zu erhalten, die leicht das Chorion und Dottersack durchdringt.
  7. Legen Sie die Nadel in einem Mikromanipulator angebracht, ein Microinjector mit der Luftquelle eingeschaltet. Unter einem Lichtmikroskop mit der Vergrößerung für die Kalibrierung für den bestimmten Apparat bestimmt geeignet Anpassen des Einspritzdrucks bis die Nadel konsequent eine 1 nL-Lösung in eine Petrischale gefüllt mit Mineralöl ausgeworfen wird.
    Hinweis: Die Qualität der Nadel ist kritisch. Praxis produziert eine Nadel und Einspritzen in den Dottersack von Embryonen bis dieser Fertigkeit ist ist bevor Sie versuchen, weitere Experimente45gemeistert.
  8. Entfernen Sie den Teiler und lassen Sie die Fische für ca. 15 min zu züchten.
    Hinweis: Längere Zucht Zeiten mehr Embryonen produziert, aber die Injektion abgeschlossen sein soll, während die Embryonen im 1-Zell-Stadium, die Chance zu maximieren, dass Cas9 Schneiden sind tritt früh und damit Verringerung der genetischen Mosaikbildung. Embryonen können in einem späteren Stadium (2 – 4 Zellen Stadium) gespritzt werden, aber dies kann möglicherweise verringern die Keimbahn-Übertragungsrate von modifizierten Allel.
  9. Sammeln Sie die Eier mit einem Sieb und spülen Sie sie in einer 10 cm Petrischale mit 1 x E3 Medien mit 0,0001 % Methylenblau. Überprüfen Sie die Gesundheit der Eier unter dem Lichtmikroskop, jede unbefruchtete Eier und Schmutz zu entfernen.
  10. 10 – 15 Embryonen als ein uninjected-Steuerelement in einer separaten, beschriftete Petrischale beiseite.
  11. Line-up mit einer transferpipette, sanft die Eier auf die Injektion Platte auf Raumtemperatur erwärmt.
  12. Unter dem Mikroskop bei 2,5 X Vergrößerung Dissektion injizieren 1 nL der Lösung in der Dottersack von jedem Embryo, insgesamt 400 Pg Cas9 Protein und 200 Pg SgRNA zu injizieren.
    Hinweis: Um schneiden falls gewünscht oder erforderlich, erhöhen Sie die Endkonzentration von 800 Pg/nL-Cas9 Protein und SgRNA bis 400 Pg/nL in der Injektionslösung; jedoch kann dies auch Ziel schneiden zu erhöhen bzw. Embryo Gesundheit zu verringern. Schnittleistung kann auch erhöht werden, durch die Injektion direkt in die Zelle46. Jedoch Injektion in der Eigelb-Plünderung ist technisch weniger anspruchsvoll und gibt ausreichend schneiden, Fische mit hohen Keimbahn-Getriebe zu produzieren (> 70 % der Nachkommen mit einer modifizierten Allel).
  13. Zurück die injizierten Embryonen zu einer ordnungsgemäß beschriftete Petrischale, decken Sie sie mit 1 x E3 Medien mit Methylenblau und steckte sie in einen Embryo Inkubator legen auf 28 ° C.
  14. Bei 24 h post Düngung (hpf), überprüfen Sie die Gesundheit der injizierten Embryonen, tot oder krankhaft entwickelnde Individuen entfernen und wechseln Sie das Medium (siehe Abbildung 3). Überprüfen Sie die Rate des Überlebens gegen das uninjected-Steuerelement.
    Hinweis: Wenn auf einen unwesentlichen gen, weniger als 10 % Letalität relativ zum Steuerelement, uninjected dürfte. Wenn erhöhte Letalität in den Leitfaden injiziert Populationen im Vergleich zur uninjected Kontrolle beachtet werden, kann dies bedeuten, dass das gezielte gen unerlässlich für die Entwicklung ist oder Ziel-Effekte zu einer fehlerhaften Entwicklung führen. Verringerung der Menge des injizierten CRISPR-Reagenzien kann erforderlich sein oder Generation eine neue SgRNA mit reduzierten Ziel-Effekten kann erforderlich sein.
  15. Die Embryonen in den Inkubator zurückkehren und weiter wachsen die Embryonen bis 72 hpf, ändern die Medien täglich um Embryo Gesundheit zu erhalten.

4. Analyse der Effizienz der Indel Formation mit einem HMA

  1. Sammeln zwei Sätze von fünf Embryonen aus den injizierten Platten gewachsen auf 72 set hpf in Mikrozentrifugenröhrchen und sammle fünf Embryonen von einem uninjected-Steuerelement.
  2. Die Embryonen zu betäuben, durch Zugabe von 0,004 % MS-222 (Tricaine) und 2 min warten.
  3. Um die gDNA zu extrahieren, sanft pipette die Medien aus jedem Embryo-Satz und fügen Sie 45 µL 50 mM NaOH. Inkubieren Sie die Embryonen bei 95 ° C für 10 min.
  4. Entfernen Sie Embryonen aus der Wärmequelle und Abkühlen auf Raumtemperatur. Fügen Sie 5 µL 1 M Tris-HCl pH = 8 und Vortex Proben kräftig (5 – 10 s). Zentrifugieren Sie die Lösung bei max. Drehzahl (> 16.000 x g) in eine Raumtemperatur Microcentrifuge für 3 min. überstand auf eine saubere, beschrifteten Röhre übertragen und Speichern der gDNA bei-20 ° C DNA für bis zu 6 Monaten.
    Hinweis: DNA-Fragmente von ca. 900 bp und kleiner wird durch die Verwendung dieses Protokolls generiert werden.
  5. Ein 50 µL-PCR-Reaktion mit 2 µL der vorbereiteten gDNA von jeder Probe (einschließlich einer uninjected Steuerung) pro die Anleitung mit der Polymerase, unter Verwendung der zuvor entworfenen Zündkapseln flankieren die vorhergesagte geschnittenen Website eingerichtet.
  6. Reinigen die PCR Produkte mittels einer PCR Aufräumen kit (siehe Tabelle der Materialien), eluieren Proben in 30 µL Wasser oder Elution Puffer und die DNA mit einem Spektralphotometer zu quantifizieren.
  7. Reanneal alle 30 µL der einzelnen gereinigten PCR-Produkte durch die Platzierung der Rohre in einem schwimmfähig Rack in einem kochenden Wasserbad (ca. 150 mL in einen 500-mL-Becherglas). Schalten Sie nach 3 min die Wärmequelle und lassen Sie die Lösung Abkühlen auf Raumtemperatur, ca. 1 h.
    Hinweis: Dieser Schritt zunächst die DNA denaturiert und dann kann die Stränge, zufällig reanneal, um mögliche Heteroduplex Bands zu generieren oder nicht übereinstimmende Doppel-Strang-DNA, die Polymorphismen enthält erstellt von CRISPR-Mutagenese und haben daher eine veränderte elektrophoretische Mobilität im Vergleich zu Homoduplexes. Letzte Zyklus der PCR oder Ramp-Down-Programm in den Thermocycler kann auch verwendet werden, um Produkte47,48reanneal, aber Gebrauch von der kochenden Wanne kann verbesserte Auflösung Heteroduplex Produkte liefern.
  8. Fügen Sie 5 µL 6 x laden färben (siehe Tabelle der Materialien), zu den reannealed PCR-Lösungen.
  9. Werfen Sie eine 15 % Polyacrylamid/FSME-Gel mit 30 % Polyacrylamid (29,1). Nachdem das Gel gesetzt hat, legen Sie sie in eine Elektrophorese-Apparatur mit TBE Puffer ausgeführt. Ein P1000 verwenden, deaktivieren Sie die Brunnen von jeglichen Schmutz wie restliche Salze oder gel Fragmente, die die Brunnen durch sanft pipettieren Puffer oben und unten in die Vertiefungen mehrmals behindern können.
  10. Belastung 500 ng des reannealed PCR-Produkte und der Last eines Steuerelements (Beispiel aus uninjected Fisch) neben jeder Satz von SgRNA Proben. Führen Sie das Gel 150 V für 2,5 h oder bis die Farbstoff-Front an der Unterseite des Gels ist.
  11. Visualisieren Sie die Bänder mit einer Nukleinsäure-Fleck (z.B.Interkalation Bromid oder SYBR green (siehe Tabelle der Materialien)).
  12. Untersuchen Sie das Band-Muster für jede Kontrolle und CRISPR-injiziert Pool von Embryonen.
    Hinweis: Die Darstellung von mehreren bands, die in den injizierten langsamer laufen im Vergleich zu uninjected Gassen zeigt Bildung von Roman Heteroduplex Produkten (Abbildung 4). Das Vorhandensein von Roman Heteroduplex DNA zeigt, dass Indels CRISPR-Injektion generiert wurden. Verringerung der Homoduplex Band Intensität in den injizierten Lösungen von ca. 50 % oder mehr ist in der Regel ausreichend, um genügend Germline Übertragung führen. Darüber hinaus zusätzliche Bänder werden manchmal in den uninjected Fischen identifiziert, und sollte nicht als Heteroduplex-Bands in den injizierten Fischen beobachtet.
  13. Wählen Sie die Injektionen mit höchsten Wirkungsgraden der Schneiden relativ zum uninjected Steuerelement für jedes Ziel; Embryonen aus diesen Injektionen können verwendet werden, aufwachsen, Fisch zu suchen Indels verursacht vorzeitiges Stopp-Codon.
    Hinweis: Für hocheffiziente schneiden (Verringerung der Homoduplex Band von ca. > 50 % Intensität), sollte screening-20 – 30 ausgewachsenen Fischen Germline Übertragung erhalten ausreichen.
    Für SgRNAs, die weniger schneiden zu generieren, kann mehr Erwachsene Fische erforderlich sein, erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Identifizierung von Fisch, die Keimbahn Übertragung der geänderten Allele, enthält ein vorzeitiges Stopcodon aufweisen. Wenn Indel Bildung nicht es möglicherweise erforderlich beobachtet ist, die SgRNA in eine andere Region des Gens neu zu gestalten. Wenn keine Heteroduplex-Band-Formation beobachtet wird, kann die SgRNA beeinträchtigt haben, und die SgRNA Qualität überprüft werden, mit einem Harnstoff/Seite Gel.

5. Ermittlung und Propagierung der Knock-out-Linien

  1. Um einen potenziellen Gründer Elternteil Fisch zu identifizieren, führen Sie Tail-Clips von den Erwachsenen F0-Fisch (gewachsen auf ca. 2,5 – 3 Monate), Vorhandensein von Indels zu identifizieren. Die Fische in 0,62 mM Tricaine zu betäuben (siehe Tabelle der Materialien), verwenden Sie eine saubere, scharfe Rasierklinge um ca. 1/2-3/4 der Schwanzflosse zu entfernen.
  2. Legen Sie die Rute in 45 µL 50 mM NaOH, und zurückkehren Sie die Fische zu einem Schmutzwassertank. Führen Sie die gDNA-Extraktion als beschrieben (Schritte 4.2-4.4). Sobald die Fische normal Schwimmen Verhalten fortgesetzt wird, legen Sie den Fisch wieder auf fließende Wasser bis die Natur die Indel identifiziert ist.
    Hinweis: Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die einzelnen Fische sind erkennbar und auf die Ergebnisse der Schweif Clips entsprechend abgestimmt werden können.
  3. Wie beschrieben (Schritte 4.5-4.9), führen Sie eine HMA auf Tail Clip gDNA um festzustellen, ob die Fische durch die CRISPR-Injektion (Abbildung 5) geändert wurde. Um einen Gründer Fisch zu identifizieren, zu züchten die Erwachsenen, die Heteroduplex Bands aus Tail gDNA Wildtyp Fisch aufweisen. Die Embryonen zu sammeln und wachsen sie auf 72 hpf.
  4. Bei 72 hpf, 10 Embryonen zu sammeln und jedes Embryo in eine einzelne Röhre. Durchführen eine gDNA Extraktion wie oben (Schritte 4.2-4.4) beschrieben mit 11,25 µL 50 mM NaOH und 1,25 µL 1 M Tris pH = 8.
  5. Wiederholen Sie die PCR und die Elektrophorese zur Identifizierung Heteroduplex Bands wie oben (Schritte 4,7 – 4.13) beschrieben, um festzustellen, ob Indel Allele dieser Generation (Abbildung 6) weitergegeben werden.
  6. Basierend auf die prozentuale Übertragung in einzelnen Embryonen mit den HMA beobachtet, wachsen Sie durchschnittlich 20 – 30 Embryonen durch das Kreuz für jedes CRISPR-Linien von Interesse bis zum Erwachsenenalter erhalten.
    Hinweis: Diese Zahl kann erhöht oder verringert Abhängigkeit von der Frequenz der Keimbahn Übertragung.
  7. Führen Sie Tail-Clips der Erwachsenen F1 Fische, Anwesenheit von Indels als beschrieben (Schritte 5.1-5.2) zu identifizieren. Wie beschrieben (Schritte 4,5 – 4.11), führen Sie eine HMA auf Tail Clip gDNA um festzustellen, ob der Fisch eine Indel (Abbildung 7 trägt).
  8. Bereiten Sie für Fische, die eine Heteroduplex-Band enthalten die DNA Sequenzierung Analyse.
    1. Führen Sie PCR unter Verwendung neue Zündkapseln, um ein 300-600 bp PCR-Produkt, zentriert um die geschnittene Stelle zu verstärken.
    2. Ein PCR-Reinigung-Kit zur Sanierung der DNS und eluieren in 30 µL. Verwendung die DNA auf einem Agarosegel um sicherzustellen, dass ein einzelnes Band vorhanden ist.
      Hinweis: Einige Heteroduplex Streifenbildung kann auf das Agarosegel vorhanden sein und erscheint als kleiner Abstrich oder Doppel-Band direkt über das PCR-Produkt in der erwarteten Größe.
  9. Wenn ein bis drei Indels analysiert werden, Reihenfolge der PCR-Produkte mit Sanger-Sequenzierung und bestimmen die Reihenfolge der Indel mit einem Bioinformatik Werkzeug49. Ansonsten, die Bestimmung der Sequenz mehrerer PCR-Produkte mit NGS-Analyse (siehe Tabelle der Materialien) ist sparsamer.
  10. Festzustellen, ob ein vorzeitiges Stopcodon erteilt worden ist, durch die Analyse der Sequenz mit einem Bioinformatik-Tool (siehe Tabelle der Materialien).
  11. Legen Sie den Fisch mit gewünschten mutierten Allels in einen neuen Tank mit entsprechenden Beschriftungen.
  12. PCR-Primer für spezifische Indel Allele für zukünftige Genotypisierung Bedürfnisse zu entwerfen. Diese Primer sollte umfassen die mutierte Sequenz und die Wildtyp Sequenz nicht zu verstärken.
  13. Im Kreuz heterozygot Zebrafisch-Trennung Bevölkerung zu generieren, die 25 % Knock-out-Zeilen enthalten wird.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die experimentelle Ansätze beschrieben in diesem Protokoll ermöglichen effiziente und kostengünstige Produktion von Zebrafisch Knock-out-Linien mit CRISPR/Cas9-Technologie. Die folgenden Zahlen wurden in diesem Artikel, Interpretation und Fehlerbehebung der Ergebnisse unter Verwendung dieses Protokolls zu erleichtern. Nach erfolgreicher Produktion und Mikroinjektion CRISPR-Reagenzien können der Zebrafisch-Embryonen für offene Phänotypen und Indel Bildung mit HMA analysiert werden. Eine hilfreiche Kontrolle, den Erfolg des CRISPR-Experiments zu visualisieren ist der Einsatz von der SgRNA im Schritt 1.5 die pigmentbildenden gen Ziel beschrieben Tyrosinase. Cas9-induzierten Indel Formation an Tyrosinase führt zum Verlust der Pigmentierung und ist leicht von 48 erzielte hpf (Abbildung 1). Eine andere hilfreiche Steuerung Sicherstellung dieser Vorbereitung der CRISPR-Reagenzien für Injektion erfolgreich war, soll sichergestellt werden, in voller Länge (120 nt) SgRNA hat mit einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel (Abbildung 2, Spur 1 und 2) synthetisiert worden. Wenn die RNA degradiert worden erscheint als ein Abstrich, z. B. Bahn 3 (Abbildung 2) zeigt degradierten RNA, die für die Injektion nicht geeignet ist.

Um die Indel Bildung Häufigkeit der Gene von CRISPR-Cas9 gezielt zu analysieren, die nicht in offene Phänotypen z. B. Tyrosinase, ist HMA-Analyse eine einfache und zuverlässige Methode. SgRNA/Cas9 injiziert Embryonen mit HMA Ergebnisse bei der Bildung der Heteroduplex Bands und Verringerung der Intensität der Homoduplex Band (Abbildung 4) analysiert. Die Anwesenheit von Heteroduplex Bands ist weiter in dieses Protokoll zum Identifizieren potenzieller Gründer Fisch aus microinjected Embryonen und als Erwachsene (Abbildung 4 und Abbildung 5), analysieren die Keimbahn-Getriebe-Leistungsfähigkeit eines Gründers ( genutzt. Abbildung 6), und eine Indel in einem heterozygoten F1-Fisch (Abbildung 7) nachzuweisen. Die heterozygoten Fische, die eine Indel enthalten sind Kandidaten für NGS, die Natur der Indel zu identifizieren und zu bestimmen, ob ein vorzeitiges Stopcodon in der kodierenden Region des Zielgens vorhanden ist.

figure-results-1
Abbildung 1 : Zebrafish Embryos zeigen einen Pigment defekt, wenn mit einer SgRNA gezielt Tyrosinase im 1-Zell-Stadium eingespritzt. (A) Wildtyp-uninjected Embryo bei 48 hpf und (B) injiziert Embryo bei 48 hpf. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-2
Abbildung 2 : In-vitro- Transkription von SgRNA mit Synthese Kit. Oligos wurden mit in-vitro- Transkription Kit vorschriftsmäßig SgRNA Synthese synthetisiert. 500 ng RNA wurde auf einem Harnstoff/Seite Gel wie beschrieben ausgeführt. SgRNA geladen in Bahnen 1 und 2 zeigt eine Band, die volle Länge, intakt 120 nt RNA entspricht. Die SgRNA in Spur 3 zeigt eine degradierte RNA-Probe, die nicht zur Injektion eignet.

figure-results-3
Abbildung 3 : Vergleich der Gesundheit der 24 hpf injiziert Embryonen. Ein lebendige Embryo (A) entwickelt bis 24 hpf, ist leicht zu unterscheiden von einem Embryo, die Entwicklung (B) abgebrochen wurde. Embryonen, die ähneln (B) oder drastisch veränderte Funktionen, um (A), wie z. B. Wirbelsäulenverkrümmung oder Kopf verändert und Augenentwicklung sollte vom Gericht entfernt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-4
Abbildung 4 : Heteroduplex Mobility Assay der SgRNA-Cas9 mikroinjiziert Zebrafisch-Embryonen. Pools von 5 Embryonen pro Probe wurden bei 72 gesammelt hpf und gDNA extrahiert wurde. Heteroduplex-Analyse wurde durchgeführt wie beschrieben, wurden Proben gleich mit 500 geladen ng DNA. Bahnen: M = 100 bp Marker; 1 = uninjected Steuerung; 2 = Injektion Sample 1; 3 = Injektion Probe 2. Bandgröße erwartet = 98 bp.

figure-results-5
Abbildung 5 : Heteroduplex Mobility Assay von gDNA extrahiert vom Heck eines Erwachsenen CRISPR-injiziert Zebrafisch. Embryonen, die mit einem SgRNA und einem Cas9 Protein injiziert wurden, wurden bis zum Erwachsenenalter (3 Monate) angebaut. Fisch B und C zeigen Heteroduplex Bänder und wurden daraufhin gezüchtet, um Keimbahn übertragen Indels identifizieren; Fisch A war nicht in der nachfolgenden Analyse verwendet, da es keine positive Heteroduplex Band aufweist. Bahnen: 1 = Wildtyp Steuerung; 2 = Fisch A; 3 = Fisch B; 4 = Fisch C. erwartet Bandgröße = 98 BP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-6
Abbildung 6 : Heteroduplex Mobility Assay von einzelnen Embryonen erzeugt durch die Züchtung einer F0 CRISPR-injiziert Zebrafisch zu einem Wild-Typ Fisch Keimbahn übertragen Indels identifizieren. Zebrafisch waren gedeckt, und die F1-Embryonen für 72 h. einzelne Embryonen gezüchtet wurden gesammelt und Heteroduplex Analyse durchgeführt wie beschrieben. Bahnen: 1 = Wildtyp Steuerung; 2-10 = einen einzelnen Formel 1 Embryo pro Bahn. Dieses Gel zeigt, dass 7 von 10 Embryonen eine positive Heteroduplex-Band zeigen, eine Keimbahn-Übertragungsrate von 70 % der Indel angibt. Bandgröße erwartet = 98 BP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-7
Abbildung 7 : Heteroduplex Mobility Assay der F1 Zebrafisch Schweif erwachsenenclips. Erwachsener F1 Fische wurden von HMA Indels identifizieren erzielte. Fische, die eine positive Heteroduplex Band ausgestellt wurden PCR verstärkt und zur breiten Sequenzierung Analyse zur Bestimmung der Art der Mutation. (A) Bahnen: 1 = Wildtyp Steuerung; 2 = Fisch ein (4 bp Deletion, 1 bp Missverhältnis). (B) diese F1-Fisch aus der gleichen Gründer identifiziert wurden und doch zeigen die verschiedenen Heteroduplex Musterung, anzeigend Germline Übertragung mehrere veränderte Allele aus einem einzigen Gründer. Bahnen: 1 = Wildtyp Steuerung; 2 = Fisch B (4 bp einfügen, 7 bp Mismatch), 3 = Fisch C (4 bp löschen, 4 bp Mismatch). Jeder dieser Indels erstellt ein vorzeitiges Stopcodon in die kodierende Sequenz des Zielgens, NGS bestimmt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Gen Knockouts im Zebrafisch vertebrate Modellsystem CRISPR-Cas9-Technologie. Eine Reihe von Protokollen wurden zuvor beschrieben CRISPR-vermittelten Genom Engineering im Zebrafisch15,25,26,50,51,52durchzuführen. Dieses Protokoll baut auf bisherigen Bemühungen durch die Kombination von eine Reihe von einfachen aber reproduzierbar konsequente experimentelle Techniken, insbesondere HMA und NGS mehrerer heterozygot Fisch, erstelle ich eine einfache, wirtschaftliche, und experimentell robuste Protokoll für CRISPR-vermittelten Mutagenese im Zebrafisch, die geeignet für Labore mit Personal mit einer Reihe von Ausbildung und Erfahrung, sowie die Lehre Labors ausgestattet ist.

Empfehlungen für Design und die Synthese des Guide RNAs sind in diesem Protokoll enthalten. Eine wichtige Überlegung im Guide RNA-Design ist die Minimierung der Ziel-Effekte. Mehrere Vorhersage Algorithmen wurden entwickelt, um Benutzern CRISPR-Berechnung Werkzeuge mit benutzerfreundlichen grafischen Schnittstellen zugreifen, die Vorhersagen, sowohl die Aktivität des Handbuchs auf Ziel und die Chance des Ziel-Effekte34, 35,36. Ein besonderen Vorteil des Zebrafisch-Systems ist gesenkten Preise der Ziel-Effekte, weil die Cas9 in die Embryonen injiziert wird und daher Ausdruck flüchtig ist, die bei Mäusen nachweislich zu einer verminderten Ziel Effekte53führen. Dennoch wurden Ziel Effekte nachgewiesen, im Zebrafisch54auftreten. Eine Möglichkeit zur Steuerung für Ziel-Effekte besteht darin Phänotyp Gründer Zebrafisch, die durch zwei unabhängige Guide RNAs, die auf das gleiche gen erzeugt worden sein, da diese Führungen wäre sehr wahrscheinlich, dass verschiedene Ziel-Websites betreffen. Eine alternative Methode zum Ziel Auswirkungen zu minimieren, die nicht in diesem Protokoll beschrieben wird ist die Verwendung von einem mutierten Cas9, die Einzelstrang Pausen am Ziel DNA, erzeugt, die mit hohem Wirkungsgrad repariert werden. Paarung DNA Kerben in der Nähe von einander, die das Gegenteil ergänzen Stränge führt effektiv Indel Bildung an den gewünschten Ort und Ziel-Effekte55,56minimiert.

Zusätzlich verschiedene Sätze von Ziel-Effekte, können verschiedene SgRNAs unterschiedliche Mutagenese der gewünschte Ziel57,58,59haben. Dieses Protokoll verwendet HMA zur Analyse der Effizienz der Mutagenese von einer bestimmten SgRNA mit Heteroduplex Band Bildung33,40. Heteroduplex Bänder entstehen durch Hybridisierung des PCR-generierte DNA-Stränge, die Abweichungen enthalten, und können mit Gelelektrophorese leicht behoben werden. Im Gegensatz zu anderen üblichen Methoden, Indel Bildung zu messen wie die T7-Endonuklease Assay oder hochauflösende schmelzen Analyse25,26, HMA erfordert keine teure Enzym nicht übereinstimmende DNA schneiden, und erfordert keine komplizierte Analyse von PCR schmelzen Kurven. Wichtig ist, ermöglicht mit HMA, um hohe Raten von Indel Bildung in der injizierten Bevölkerung zu überprüfen auch die Ermittler zu minimieren die Anzahl der Fische für die nachfolgende Produktion Knock-out-Linien, das reduziert die Kosten für die Ermittlung einer Mutation mit der gewünschten Eigenschaften.

Die relative Leichtigkeit erzeugen CRISPR-basierte Indels ermöglicht die Erstellung von Multiple Allele mehrere Gene auf einmal. Web-basierte Software ist verfügbar für die Analyse der einzelnen Mutationen von heterozygoten Fische mit Sanger der PCR Produkte49sequenzieren. In dem Fall, wo drei oder mehr CRISPR-mutierten Allele analysiert werden, ist NGS, die Natur der Indel zu charakterisieren wahrscheinlich kostengünstiger, die Art der Indel als dieser Ansatz charakterisieren sein einen Pool von bis zu 50 verschiedene Allele bei o charakterisiert werden können NCE (siehe Tabelle der Materialien)60,61,62. Diese Größenvorteile wäre wahrscheinlich besonders nützlich in einer grundständigen Laborumgebung.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dieses Protokoll bietet schrittweise Anleitungen für die Erzeugung von reproduzierbar hochwertige CRISPR-Reagenzien (insbesondere SgRNA), so dass weniger Erwachsene Fische müssen erstellt und analysiert, um erfolgreich zu identifizieren, die mutierten Allele von Interesse, die auch reduziert den Zeit- und Kostenaufwand die gewünschten Linien zu erzeugen. Wichtig ist, hat dieses Protokoll so konzipiert, dass es von Labors mit begrenzten Ressourcen, mutierten Zebrafisch auf erschwingliche Weise zu produzieren angewendet werden kann. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass dieser Ansatz eignet sich für Studenten und damit die Möglichkeiten zur aus- und Weiterbildung von Studenten praktische Erfahrungen im Erbgut CRISPR-basierte Bearbeitung interessiert baut.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Institutes of Health (R21CA182197, j.o.), Ralph W. und Grace M. Showalter Research Trust, und durch die Purdue Agrarwissenschaft und Erweiterung für wirtschaftliche Entwicklung (AgSEED) Programm. Sanger-Sequenzierung-Daten wurden von der Purdue Genomics Core Facility unterstützt durch P30 CA023168 erworben. Mary Witucki wurde von der Purdue University Center für Cancer Research Sommer Undergraduate Research Program unterstützt durch die Carroll County Cancer Association unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle im Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. Wir danken Benjamin Carter, Ellen Denning und Taylor Sabato für kritische Rückmeldungen auf das Manuskript. Wir danken der Fakultät für Biochemie für die Unterstützung dieser Arbeit und dem Center for Zebrafisch-Forschung an der Purdue University für ihr Engagement in der Pflege und das Wohlergehen unserer Zebrafisch-Kolonie. Zu guter Letzt danken wir der Purdue Genomics Core Facility und Beiträge von Phillip San Miguel in Bezug auf die NGS-Dienste.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CRISPORsgRNA-Analysesoftware. http://crispor.tefor.net/
Breaking-CassgRNA-Analysesoftware. https://omictools.com/breaking-cas-tool
ChopChopsgRNA-Analysesoftware. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/
Primer 3PCR-Primer-Design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
RNASE-freie Technikhttp://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf
RNase-freiem Wasser Synthese von Guide-RNAsjeder Marke. Thermo Fisher und Qiagen führen beide geeignetes Wasser.
Rnasefreies EthanolJede MarkeEthanol in molekularbiologischer Qualität ist RNASE-frei. Fischer, VWR verkaufen geeignetes Ethanol.
Cas9 ProteinPNA BioCP01 Cas9Protein mit nukleärem Lokalisierungssignal.
Spezifische Oligos anvisierenIntegrierte DNA-Technologien (IDT)Synthetisieren Sie Guide-RNAs.
PCR-Primer, die die Führungs-RNA-Schnittstelle flankierenIntegrated DNA Technologies (IDT)Verwendung für die Heteroduplex-Analyse, 100-300 bp Produkt.
PCR-Primer flankieren Führungs-RNA-SchnittstelleIntegrated DNA Technologies (IDT)Zur Sequenzierung von CRISPR-Allelen verwenden, Produkt empfohlen 300-600 bp.
EnGen sgRNA-SynthesekitNew England BioLabsE3322In-vitro-Transkrib-Guide-RNAs.
10X TBEThermo FisherB52RNasefreier Puffer für die Elektrophorese von Nukleinsäuren.
6X Load DyeNew England BioLabsB7025SLoading DNA für die Elektropherese.
5M AmmoniumacetatThermo FisherAM9071Aufreinigungsreagenz für die Aufreinigung von Guide-RNAs.
Ethanol (200 proof, nukleasefrei)MarkeCleanup-Reagenz für die Aufreinigung von Guide-RNAs. Materialien in molekularer Qualität sind RNase-frei.
Nukleasefreies WasserJede MarkeFür die Synthese und Reinigung von Guide-RNAs.
RNase awayThermo Fisher 10328011Beseitigt RNase-Kontaminationen von Oberflächen, Geräten und Glaswaren.
DNA-Leiter, 100 bpNew England BioLabsN0467SMolekulargewichtsstandards für die Gelelektrophorese von DNA.
DNA-Leiter, 1 kbNew England BioLabsN0552SMolekulargewichtsstandards für die Gelelektrophorese von DNA.
RNA LadderNew England BioLabsN0364SEinzelstrang-RNA-Marker zur Überprüfung, ob sgRNA in voller Länge synthetisiert wurde
TEMEDThermo Fisher17919Casting Polyacrylamide Gel.
Ammoniumpersulfat (APS)Sigma-AldrichA3678Gegossenes Polyacrylamid-Gel.
40% Polyacrylamid (19:1)BioRad161-0154Gießgel aus denaturiertem Polyacrylamid.
HarnstoffSigma-AldrichU5378-100GGießen von denaturierendem Polyacrylamid-Gel.
RNA Gel Loading Dye (2x)Thermo FisherR0641Loading guide RNA auf denaturierendes Gel für die Elektrophorese.
EthidiumbromidSigma-AldrichE1510-10MLVisualisierung von Nukleinsäuren.
SYBER GreenThermo FisherS7563Alternative Methode zu Ethidiumbromid zum Nachweis von dsDNA in Agarose- oder Polyacrylamid-Gelen.
MikrozentrifugeEppendorf5424RNA Aufreinigung, PCR Aufreinigung.
MyTaq PolymeraseBiolineBIO-21105Für die Amplifikation von DNA mittels PCR.
ThermocyclerPCR-Amplifikationjeder Marke
SpektralphotometerJede Marke,NanoDrop oder verwandtes Produkt zur Quantifizierung der DNA/RNA-Menge.
E3 Embryo MediumMade in houseMedium für die Aufzucht von Embryonen und die Herstellung von Injektionsplatten. Rezept: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449
Methylene BlueSigma-AldrichM9140wird zu 1x E3-Medien hinzugefügt, um Pilzwachstum auf Embryonen zu verhindern.
PetrischaleThermo Fisher FB0875711ZLagerung von Embryonen, gegossene Injektionsplatte.
AgaroseDenvilleCA3510-8Guss-Injektionsplatte, Agarose-Gele.
Mikroinektion-FormAdaptive Science ToolsTU-1Zur Erstellung von Vertiefungen, um Embryonen während der Injektion zu halten.
PhenolrotSigma-AldrichP0290 Farbstoff zur Visualisierung der Injektion.
MineralölSigma-AldrichM5904-5MLZur Kalibrierung des Nadelinjektionsvolumens.
TransferpipettenJede MarkeBewegliche Embryonen.
RasierklingeThermo Fisher11295-10Schneidenadel für ausgewachsene Fische.
InkubatorJede MarkeEmbryonen bei 28,5 oC halten.
Verticle PipettenabzieherDavid Kopf Instruments700CGeneate Nadeln für die Injektion. Zusätzliche Anweisungen zum Ziehen der Nadel: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long
KapillarröhrchenSutter InstrumentsBF100-58-10Geneate Nadeln für die Injektion.
Microloader-SpitzenEppendorf930001007Laden Sie die Lösung in die Injektionsnadeln.
MicroinjectorWorld Precision InstrumentsPV 820Injektion von Embryonen.
PräpariermikroskopLeicaInjektion von Embryonen.
30% Polyacylamid (29:1)BioRad161-0156Heteroduplex-Gelguss.
MS-222 (Tricain)Sigma-AldrichA-5040Betäubungsmittel für Zebrafische zum Schwanzabschneiden und zur gDNA-Extraktion aus Embryonen. Rezept: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE
MikrowelleJede MarkeGießen Injektionsplatte, Agarosegele.
SkalierenJede MarkeGießen von Injektionsplatten, Agarosegelen.
HandschuheJede MarkeFür alle Aspekte des Protokolls.
N2Jede MarkeZum Ausstoßen von Flüssigkeit aus der Kapillare für die Embryoinjektion.
1.000 & Mikro; L  TippsJede MarkeFür alle Aspekte des Protokolls.
200 & Mikro; L TippsJede MarkeFür alle Aspekte des Protokolls.
10 & Mikro; L TippsJede MarkeFür alle Aspekte des Protokolls.
PCR-StreifenröhrchenJede MarkeFür alle Aspekte des Protokolls.
MikropipettenJede MarkeFür alle Aspekte des Protokolls.
NGS-Sequenzierungsplattform: WideseqWenn Ihre Institution diesen Service nicht anbietet, besuchen Sie: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (Externe Kosten: 35 USD).
Software zur SequenzanalyseFür die Sanger-Sequenzierung von heterozygoten Fischen. Besuchen Sie: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/
Software für die Sequenzanalyse, SnapGene Viewer, Sequenzscanner für die Analyse der NGS-Sequenzierung.
Jede .

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