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Methodenartikel

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

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DOI:

10.3791/56973

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8. Mai 2018

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, University of Washington School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Methodik zur klonalen Analyse von Hämatopoetischen Stammzellen Vorläufer während der murinen embryonalen Entwicklung. Wir kombinieren Index sortieren einzelner Zellen aus der embryonalen Aorta-Gonade-Wachstum-Region mit Endothelzellen Kokulturen und Transplantation der phänotypischen Eigenschaften und Engraftment Potenzial der einzelnen hämatopoetischen Vorläufer zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, Hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Genesis während der Embryonalentwicklung wurde begrenzt durch die Seltenheit der HSC-Vorstufen in der frühe Embryo und das Fehlen von Assays, die funktionell das langfristige multilineage Engraftment Potenzial identifizieren einzelne vermeintliche HSC-Vorläufer. Hier beschreiben wir die Methodik, die die Isolierung und Charakterisierung von funktionell validierten HSC-Vorläufer der Ebene der einzelnen Zelle ermöglicht. Erstens verwenden wir Index Sortierung den präzise phänotypischen Parameter jeder einzeln sortierten Zelle Katalog mit einer Kombination aus phänotypische Markierungen für HSC-Vorstufen mit zusätzlichen Markern für die experimentelle Analyse zu bereichern. Zweitens ist jeder Index sortiert Zelle Co kultiviert mit vaskulären Nische Stroma aus der Aorta-Gonade-Wachstum (AGM) Region, die die Reifung der nicht Einpflanzen HSC Vorläufer des funktionalen HSC mit multilineage, langfristige Engraftment Potenzial in unterstützt Transplantation-Assays. Diese Methodik ermöglicht die Korrelation der phänotypischen Eigenschaften von klonalen Hemogenic Vorstufen mit ihrem funktionalen Engraftment oder andere Eigenschaften wie transkriptionellen Profil, was ein Mittel für die detaillierte Analyse des HSC Vorläufer Entwicklung auf der Ebene der einzelnen Zelle.

Einleitung

Klonale Untersuchungen ergaben Heterogenität in den langfristigen Engraftment Eigenschaften des Erwachsenen HSCs, neue Einblicke in HSC-Subtypen und Änderungen im HSC Verhalten während der Alterung1. Jedoch ähnliche Studien der embryonalen HSCs und deren Vorstufen schwieriger gewesen. Während der frühen Embryonalentwicklung HSCs ergeben sich aus einer Bevölkerung von Vorläuferstoffen gemäß Hemogenic Endothel in einem vorübergehenden Prozess bekannt als die endotheliale hämatopoetischen Übergang2. Die ersten HSC, definiert durch ihre Fähigkeit, stabile, langfristige multilineage Engraftment nach Transplantation in konditionierten Erwachsenen Empfänger werden nicht erkannt, erst nach embryonalen Tag 10.5 (E10.5) in der murinen Embryo bei sehr niedrigen Frequenz3 . Während ihrer Entwicklung müssen Vorläufer des HSC (Pre-HSC) aus Hemogenic Endothel unterziehen Reifung vor dem Immobilienerwerb von Erwachsenen HSC die ermöglichen effiziente Engraftment Transplantation Assays4,5 , 6. verdeckt das Studium der seltenen HSC Herkunft, eine Vielzahl von hämatopoetischen Vorläuferzellen mit erythroiden, myeloischen und lymphatischen Potenzial werden schon vor der Entstehung des HSC von Pre-HSC7,8erkannt. Pre-HSC von anderen hämatopoetischen Vorläuferzellen zu unterscheiden erfordert daher Methoden klonal Zellen zu isolieren und Ihnen mit den Signalen ausreichend für ihre Reifung, HSC, um ihre Engraftment Eigenschaften in Transplantation Assays zu erkennen.

Eine Reihe von Ansätzen sind beschrieben worden, die für den Nachweis von Pre-HSC von ex-Vivo oder in Vivo Reifung, HSC ermöglichen. Ex-Vivo -Methoden sind angewiesen, auf die Kultur der embryonalen Gewebe, wie z. B. der AGM-Region, wo die ersten HSC in Entwicklung9erkannt werden. Aufbauend auf diese Methoden, Protokolle, die die Dissoziation zu integrieren haben sortieren und Re-Aggregation von AGM Geweben die Charakterisierung der sortierten Populationen mit HSC Vorläufer bei der Entwicklung von E9.5 zu E11.5 in der Para-aortalen zulässig Splanchnopleura (P-Sp) / AGM Regionen4,5,10; Allerdings sind diese Ansätze nicht zugänglich Hochdurchsatz-Analyse der Vorläufer der Ebene der Einzelzelle für klonale Analyse erforderlich. In ähnlicher Weise in Vivo Reifung durch Transplantation in Neugeborene Mäuse, wo der Mikroumgebung vermutlich besser geeignet für die Unterstützung der früheren Phasen des HSC Vorstufen, ermöglichten auch Studien der sortierten Bevölkerungen aus dem Dottersack und AGM / P-Sp (P-Sp ist die Vorläufer-Region zur Hauptversammlung) mit Merkmalen der Pre-HSC, aber diese Methoden auch scheitern, eine robuste Plattform für einzelne Zelle Analyse11,12.

Studien von Rafii Et Al. haben gezeigt, dass dieser Akt aktiviert Endothelzellen (EG) Stroma eine Nische Substrat für die Unterstützung von Erwachsenen HSC Selbsterneuerung in-vitro-13,14,15bieten kann. Wir entschlossen vor kurzem, dass Akt aktiviert EG abgeleitet aus der AGM-Region (AGM-EC) eine geeignete in-vitro- Nische für die Reifung der Hemogenic Vorläufer bietet, so früh wie E9 in Entwicklung, für die Erwachsenen Einpflanzen HSC sowie die anschließende isoliert Selbsterneuerung der generierten HSC16. Angesichts der Tatsache, dass dieses System eine einfache 2-dimensionale kokultur beschäftigt, ist es leicht anpassbar für klonale Potenzialanalyse der HSC einzeln isolierten Hemogenic Grundstoffe.

Vor kurzem haben wir ein Konzept für die HSC-Potenzial der klonalen Hemogenic Vorstufen assay durch die Kombination von Index Sortierung der einzelnen Hemogenic Vorstufen aus murinen Embryonen mit AGM-EG Kokulturen und anschließenden Funktionsanalyse in der Transplantation berichtet. 17Tests. Index zu sortieren ist eine Art der Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS), die Datensätze (Indizes) alle phänotypischen Parameter (d.h., forward Scatter (FSC-A), Side Scatter (SSC-A), Fluoreszenz Parameter) jeder einzeln sortierten Zelle so, dass diese Funktionen können rückwirkend mit anschließenden Funktionsanalyse nach Sortierung korreliert werden. FACS-Software zeichnet sowohl phänotypische Informationen für jede Zelle und die Position/gut von den 96-Well-Platte, in die sie gestellt wurde. Diese Technik wurde bisher elegant zur erkennen Heterogenität in Erwachsenen HSC, phänotypische Parameter, die weiter für die langfristige anwachsen Teilmenge der HSC zu bereichern, und phänotypischen Parameter des HSC mit transkriptionelle korrelieren Eigenschaften auf die einzelne Zelle Ebene18,19. Hier bieten wir detaillierte Methode dieses Ansatzes, die Identifikation der einzigartigen phänotypischen Parameter und Abstammung Beiträge von Pre-HSC in frühen Phasen der Embryonalentwicklung ermöglicht.

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Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des Fred Hutchinson Cancer Research Center genehmigt.

1. Vorbereitung der AGM-EG Monolagen kokultur

  1. 24 h vor der Hauptversammlung Dissektion und Art, machen AGM-EG-Kultur, Medien und Filter zu sterilisieren.
  2. 0,1 % Gelatine in Wasser (100 µL/Well) in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min. Absaugen die Gelatine und lassen die Platte in einer Gewebekultur-Haube mit den Deckel entfernt, bis der Brunnen trocken sind.
  3. Die AGM-EG Monolagen und Platte für 96-Well Platten zu distanzieren.
    Hinweis: Pflegen Sie die AGM-EG, als zuvor beschriebenen16in AGM-EG Kulturmedien vorbereitet. Aus Gründen der Kohärenz sollte AGM-EG-Zell-Linien eingefroren, sobald ausreichende Zahl (in der Regel Durchgang 1-3) erzielt werden und bei einer definierten Passagenanzahl (in der Regel Durchgang 5-12) für kokultur Experimente verwendet werden. AGM-EG Zelllinien stammen aus C57BL/6J (CD45.2) AGM. Sehen Sie die Tabelle der Materialien für alle Medien-Kompositionen.
    1. Aspirieren Sie die Medien aus der AGM-EG-Kultur in einem 75 cm2 Kolben und 5 mL PBS. Aspirieren PBS, und fügen Sie 3 mL Trypsin-Lösung (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Inkubation bei 37 ° C für 2-4 min bis die meisten Zellen aus der Platte heben sind. Hinzugeben Sie 7 mL AGM-EG-Kultur, Medien und pipettieren 8-10 mal mit einer 10 mL-Pipette Einzelzellen Aussetzung vorbereiten, und übertragen Sie auf eine 15 mL Tube.
    3. Drehen mit 300 X g für 5 min, Entfernen des Überstands wieder aussetzen in 10 mL AGM-EG Kulturmedien und schätzen Sie die Anzahl von Zellen mit einem Hemocytometer. Verdünnen Sie die Zellen zu einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/mL in Kulturmedien AGM-EG.
  4. Geben Sie in jedes verkleisterte 96-Well-Platte 100 µL AGM-EG Zellsuspension (1 x 10-4 -Zellen). Platz in einem 37 ° C, 5 % CO2 Gewebekultur Inkubator Übernachtung um die AGM-EG zu befestigen und bilden eine konfluierende Monolage zu ermöglichen.
    Hinweis: Gleichmäßig zu verteilen, die AGM-EG Stromazellen Zellen so gibt es begrenzte Überwucherung oder Zelle für optimale kokultur Verklumpung.
  5. Kokultur AGM AGM-EG Monolage vorbereiten.
    1. Bereiten Sie am nächsten Morgen die AGM serumfreie Medien.
    2. Mit einer 12-Well Mehrkanal-Pipette, entfernen Sie die AGM-EG Nährmedien aus der AGM-EG und 200 µL/Well AGM serumfreie Medien ohne Zytokine zum Auswaschen alle verbleibenden Serum-haltigen Medien.
    3. Entfernen Sie den Datenträger, und fügen Sie 200 µL/Well AGM serumfreie Medien mit Zytokinen. Arbeiten Sie schnell, wenn entfernen und Hinzufügen von Medien, so dass die endotheliale Schicht nicht beeinträchtigt wird; z. B.entfernen und erneut hinzufügen Medien eine Zeile zu einem Zeitpunkt. Legen Sie die 96-Well-Platten in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C, bis die embryonalen Zellen bereit sind für die Sortierung.

2. Vorbereitung des einzigen Zellsuspension aus murinen embryonalen Gewebe

  1. Die Hauptversammlung von zeitgesteuerten Paarungen zu sezieren.
    1. Zeitgesteuerte Paarungen für die Erzeugung von embryonalen Gewebe das gewünschte Alter eingerichtet.
    2. Ernte-Embryonen aus trächtige Weibchen bei 9,5 bis 11,5 Tage Post Coitum (Dpc), abhängig von der Phase der Pre-HSC analysiert werden.
      Hinweis: Embryonale Gewebe werden von Mäusen C57BL/6J (CD45.2) wie zuvor beschrieben und präzise inszenierten basierend auf Somiten Graf16geerntet. Wir haben auf Analyse der Bevölkerung von der embryonalen AGM-Region und sein Vorläufer, der P-Sp, zwischen E9.5, E11.5, basierend auf Somiten Inszenierung.
    3. Die Hauptversammlung von Embryonen20zu sezieren.
      Hinweis: Ausführliche Protokolle für die Zerlegung des AGM aus murinen Embryonen wurden von anderen20veröffentlicht. Alternativ könnte Dottersack oder anderen Geweben Pre-HSC-Aktivität haben angeblich auch mit dieser Methode analysiert werden.
  2. Die seziert embryonalen Gewebe zu distanzieren.
    1. Sammeln der seziert Gewebe in einem 15 mL konische Röhrchen mit 10 mL PBS mit 10 % FBS auf Eis. Schwerkraft Gewebe zu begleichen, Aspirieren der PBS/FBS, und dann sofort 1 mL 0,25 % Kollagenase und Platz im Wasserbad 37 ° C für 25 min.
    2. Fügen Sie 1 mL PBS/10% FBS und pipettieren ca. 20 - 30 Mal mit eine 1 mL Pipette Tipp um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Fügen Sie eine zusätzliche 8 mL PBS/10% FBS und Zentrifuge Zellen bei 300 X g für 5 min. Überstands verwerfen.

3. Antikörper Färbung der murinen embryonalen Zellen

  1. Bereiten Sie die blockierenden Puffer für Antikörper Färbung.
    1. Fügen Sie 10 µg/mL Anti-Maus CD16/CD32 (Fc-Rezeptor (FcR) Block) und 1 µg/mL DAPI (1 mg/mL Brühe in H2O) zu 1 mL PBS mit 10 % FBS.
    2. In einer 3 mL Spritze erstellt und durchlaufen einen 0,22 µm Spritze Filter zu sterilisieren. Wieder aussetzen der Zelle Pellet aus dem dissoziierten murinen embryonalen Gewebe (aus Schritt 2.2.2) in 500 µL blocking-Puffer und inkubieren Sie für 5 min auf Eis.
  2. Bereiten Sie die Antikörper-Mix-17.
    1. 1 mL PBS mit 10 % 10 µg/mL FcR Block hinzufügen FBS und 10 µL jeder Fluorochrom-konjugierten Anti-VE-Cadherin-Antikörper (CD144, siehe die Tabelle der Materialien) und Fluorochrom-konjugierten Anti-EPCR Antikörper (CD201, siehe die Tabelle der Materialien). Verwenden Sie eine 1: 100 Endverdünnung von Antikörpern, sofern nicht anders angegeben basierend auf den Empfehlungen des Herstellers oder nach Titrationen.
      Hinweis: Diese Antikörper-Kombination dient zur Definition von Toren für die Sortierung, wie unten (Schritt 4.2) beschrieben. Sortierung anhand des Co Ausdrucks der VE-Cadherin und EPCR ermöglicht deutliche Bereicherung für den Teil der AGM-abgeleitete Zellen mit HSC Vorläufer Aktivität, wie zuvor beschrieben17.
    2. Fügen Sie zusätzliche Fluorochrom-konjugierten Antikörpern zur weiteren phänotypische Analyse der einzelnen Index sortiert Vorstufen.
      Hinweis: Diese Antikörper sind nicht notwendigerweise verwendet für Tore für die Sortierung zu definieren. In diesem Beispiel Protokoll haben wir aufgenommen, PE-konjugierten Anti-CD41 Antikörper und FITC-konjugierten Anti-CD45 Antikörper zu den relativen Ausdruck dieser hämatopoetischen Marker zu analysieren, die während der Entstehung des Pre-HSC aus Hemogenic Endothel4 entwickeln ,5,16,17. Andere Marker von Interesse können wie gewünscht werden. Proben mit Fluorochrom konjugiert Isotype Antikörper Steuerelemente befleckt werden verwendet, um negative und positive Tore für die Analyse zu definieren.
    3. Zeichnen Sie den Antikörper-Mix in einer 3 mL Spritze und durchlaufen Sie einen 0,22 µm Spritze Filter zu sterilisieren. Die Zellsuspension in blocking-Puffer, Pipette zu mischen, und inkubieren Sie für mindestens 15-20 min auf Eis fügen Sie 500 µL des Antikörper-Mix hinzu.
  3. Waschen Sie die gefärbten Zellen.
    1. 8 mL PBS/10% FBS hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g für 5 min, aufziehen und wieder aussetzen der Zelle mit 1 mL PBS/10% FBS pellet.
    2. Entfernen Sie Zelle Klumpen durch pipettieren der Zellsuspension durch eine 35 μm Zelle Sieb Obergrenze für eine 5 mL-Tube. Waschen Sie die Zelle Sieb mit einem zusätzlichen 3 mL PBS/10% FBS. Die Zellen bei 300 X g für 5 min zentrifugieren, Aspirieren, erneut aussetzen in 500 µL PBS/10% FBS und auf Eis legen, bis FACS.

4. Index Sortierung der einzelnen Hemogenic Vorstufen bis 96-Brunnen mit AGM-EG Stroma für kokultur

  1. Vorbereiten der FACS-Maschine für Platte-Modus und richten Sie für die Sortierung, 96-Well-Platten nach den Anweisungen des Herstellers. Wählen Sie einzelne Zellenmodus und Index sortieren Modus in der Software für maximale Reinheit Maskeneinstellungen und Übernahme der Indexparameter für jede sortierte Zelle zu ermöglichen.
  2. Erwerben Sie eine Probe von Zellen aus der Antikörper gefärbten Proben um Tore für die Sortierung festzulegen.
    1. Die gefärbten Zellprobe auf dem FACS-Rechner zu laden und Zellen mit den niedrigsten Volumenstrom zu erwerben. Plot-FSC-A Verse SSC-A und wählen Sie ein Tor, das Zellen unterschiedlicher Größe (Abbildung 1 b) enthält (basiert auf der Beobachtung, dass Pre-HSC-Aktivität in den Zellen unterschiedlicher Größe Profile in der Hauptversammlung17erkannt wird). Plot-FSC-A Verse FSC-W und SSC-A Verse SSC-W, und wählen Sie Tore, Dubletten auszuschließen. Dann Plotten FSC-A Verse DAPI zu lebenden Zellen (negativ für DAPI) Tor (Abbildung 1 b).
    2. Plot-PECy7 (oder der relevanten Fluorochrom für den VE-Cadherin-Fleck) im Vergleich zu PerCP (oder der relevanten Fluorochrom für den EPCR Fleck). Tor-Zellen, die positiv für VE-Cadherin (beinhaltet eine gemischte Bevölkerung von Endothelzellen sowie hämatopoetischen Vorläuferzellen und Pre-HSC von der GV) und die hohe EPCR Ausdruck (die für Pre-HSC aus P-Sp/AGM17bereichert). Dies ist das letzte Tor, das zum Sortieren einzelner Zellen im Schritt 4.3 (Abbildung 1 b) index verwendet wird.
    3. Plotten Sie zusätzliche Fluorochromes zum Färben verwendet.
      Hinweis: Abhängig von der Teilgesamtheit analysiert werden, zusätzliche Tore basiert auf dem Nachweis von anderen Markern für die Färbung von Zellen enthalten einstellbar. Index Sortierung ermöglicht jedoch die Aufnahme der fluoreszierenden Parameter für die einzelnen sortierten Zellen so, dass diese Parameter im Nachhinein analysiert werden können. Somit ist keine zusätzliche Anspritzung notwendig an dieser Stelle. Für alle FACS-Setups sollten Proben befleckt mit einzelnen Antikörper verwendet werden, anpassen Entschädigung, um Spillover in der Emission von überlappenden Fluorochromes und mit Isotype Kontrolle Antikörper Hintergrundfärbung abzurechnen und bestimmen negativ/positiv-Tore.
  3. Index sortiert die AGM-Zellen.
    1. Legen Sie eine 96-Well-Platte mit der AGM-EG-Stroma in AGM serumfreie Medien mit Zytokinen (aus Schritt 1.5.3) in der Platte Block FACs-Sortiermaschine vorbereitet. Laden Sie die Probe und beginnen Sie Probe Erwerb. Wählen Sie Index sortieren/einzelne Zellenmodus und beginnen Sie Sortingsingle Zellen zu einzelnen 96 Wells. Verwenden Sie die niedrigste Durchfluss Schubspannung auf embryonale Zellen zu minimieren.
    2. Stellen Sie sicher, dass alle Ereignisse, während der Index sortieren aufgezeichnet werden. Dies ermöglicht Enumeration von der Gesamtzahl der Zellen in der sortierschleuse bezogen auf die tatsächliche Anzahl sortierten zu einzelnen 96-Brunnen, analysiert, da nicht alle Ereignisse erfasst, Brunnen in Ordnung gebracht werden.
    3. Sobald die Zellen für eine gesamte 96-Well-Platte sortiert haben, platzieren Sie die Platte in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C auf 5 % CO2festgelegt. Wiederholen Sie für zusätzliche Platten pro Experiment benötigt.
    4. Kokultur individuell sortiert Zellen in 96-Brunnen mit AGM-EG (aus Schritt 4.3) für bis zu 7 Tage (5 Tage für Zellen sortiert aus E11-11.5 Embryonen, 6 Tage ab E10-10.5 Embryonen, 7 Tage ab E9-9.5 Embryonen). Mit Ablauf der kokultur hematopoietic Kolonien in verschiedenen Größen und Morphologien mit einem inversen Mikroskop bei 100 X Vergrößerung (Abb. 2 b) zu visualisieren.
      Hinweis: Die Medien muss nicht während der kokultur Periode geändert werden. Sortiert Hemogenic Vorstufen können zunächst in die AGM-EG-Schicht mit einer EG-ähnliche Morphologie zu integrieren und nicht ursprünglich von AGM-EG Stroma (Abbildung 2A) unterschieden werden. Jedoch folgenden 24-48 h in kokultur, kleinen, runden hämatopoetische Zellen oder Gruppen von Zellen können erkannt werden. Am Ende der kokultur (5-7 Tage) können einzelne Kolonien von blutbildenden Zellen in der Teilmenge von 96 Wells visualisiert werden, die eine sortierte Zelle mit klonale hämatopoetische Potenzial erhalten. Visuell inspizierte Brunnen enthalten mehr als eine unterschiedliche Kolonie, wenn in diesem Beispiel ist ausgeschlossen von nachgelagerten Analyse Proben ausschließen, die mehr als eine Zelle pro Bohrloch sortiert erhalten zu haben.

5. Analyse der klonale hämatopoetische Nachkommen nach kokultur

  1. Klone von jeweils 96-Well für FACS Analyse zu ernten.
    1. Kräftig pipettieren hämatopoetische Zellen von endothelialen Schichten mit einer Mehrkanal-Pipette mit 200 µL Pipettenspitzen distanzieren. Versuchen Sie nicht, die endotheliale Schicht zu distanzieren. Entfernen Sie 100 µL (~ 50 % der Stichprobe) für phänotypische Analyse der hämatopoetischen Nachkommen durch FACS.
    2. Übertragen auf eine 96-Well-V-Boden-Platte und Zentrifugieren bei 300 X g für 2 min zu die Zellen zu Pellets. Entfernen Sie das Medium durch die Medien von der Platte mit einer einzigen, schnellen Bewegung zu streichen, während die Platte ist invertiert (flick Platte).
    3. Legen Sie die restlichen 100 µL Zellen in der ursprünglichen 96-Well-Platte in einem 37 ° C Incubatorfor Einsatz in den nachfolgenden Engraftment Assay (Schritt 6).
  2. Inkubieren Sie die Zellen mit den entsprechenden Antikörpern für hämatopoetische Analyse.
    1. Wieder aussetzen der Zelle Pellets in jede Vertiefung eine 96-Well V-Boden mit 50 µL PBS/2% FBS mit 10 µg/mL FcR Block und 1 µg/mL DAPI. Inkubieren Sie die Platte bei 4 ° C für 5 min.
    2. Fügen Sie 50 µL PBS/2% FBS 10 µg/mL FcR Block mit einem Antikörper-Mix für die HSC-Analyse mit PE-Cyanine7-konjugierten Anti-VE-Cadherin, PerCP-konjugierten Anti-CD45, PE-konjugierten Anti-EPCR, APC-konjugierten Anti-Sca1 und FITC-konjugierten Anti-Gr1 und Anti-F4/80 (jeder Antikörper bei 1: 100 Endverdünnung sofern nicht anders angegeben, basieren auf den Empfehlungen des Herstellers oder nach Titrationen). Inkubieren Sie die Platte bei 4 ° C für mindestens 20 min.
  3. Entfernen Sie ungebundenen Antikörper mit sequentiellen Verdünnungen und analysieren Sie die Zellen zu.
    1. Fügen Sie 200 µL/Well PBS/2% FBS und Zentrifuge bei 300 X g für 2 min zu die Zellen zu Pellets. Dann streichen Sie Platte um den überstand verwerfen und jede Zelle Pellet 200 µL PBS/2% FBS hinzu und Zentrifugieren bei 300 X g für 2 min, pellet-Zellen.
    2. Streichen Sie Platte überstand verwerfen und 50 µL/Well PBS/2% FBS zur Analyse hinzufügen. Fahren Sie mit Zellen durch FACS mit einem Durchflusszytometer, ausgestattet mit einem Teller-Lesegerät zu analysieren.
      Hinweis: Ein bestimmtes Volumen der Zellen (z.B. 35 µL der insgesamt 50 µL für Resuspension verwendet) zu erwerben, die Teilmengen der hämatopoetischen Nachkommen aufzuzählen.
  4. Analysieren Sie die FACS-Daten für jedes gut mit hämatopoetischen Nachkommen zum Bildschirm für die Kolonien, die HSC potenzielle (Abbildung 3) enthalten.
    1. Tor zunächst CD45 positiven Bevölkerung negativ für myeloischer Marker Gr1 und F480. Nicht aus Zellen, die immer noch geringe Mengen an VE-Cadherin express gate. Zellen aus der AGM-EG-Schicht, die bei der Ernte der hematopoietic Kolonien gestört werden sind VE-Cadherin Positive und negative CD45.
    2. CD45 Tor+VE-CAD-- / lowGr1–– F4/80 Zellen weiter auf die Teilmenge, die hohe EPCR und Sca1 express (Abbildung 3A -C).
      Hinweis: In früheren Studien, Kolonien, die Zellen mit CD45 fehlt+VE-CAD-- / lowGr1––F4/80 Sca1HalloEPCRHallo Phänotyp (Abbildung 3D) reproduzierbar nicht nachweisbar multilineage peripherem Blut Engraftment bestrahlten Empfänger Mäuse17 (Daten nicht gezeigt); Daher müssen diese Kolonien in der anschließenden Transplantation Analyse in Schritt 6 nicht aufgenommen werden.

6. Analyse der Engraftment Eigenschaften der einzelnen Klone und Korrelation mit phänotypischen Eigenschaften aufgeklärt durch Index sortieren

  1. Der Tag der (wenn möglich) oder am Morgen nach der phänotypische Analyse in Schritt 5, suspendiert erneut die restlichen 100 µL Zellen von jeder 96-Well mit hämatopoetischen Kolonien Kokulturen (aus Schritt 5.1), indem Sie kräftig Pipettieren mit einer PIPETTENSPITZE 200 µL.
  2. Bereiten Sie zu und Rettung Zellen aus ganze Knochenmark Congenic Sorte B6. SJL-PtprceinePepcb/BoyJ (B6 CD45.1) Erwachsenen Mäusen16,17.
    1. Kernhaltigen Knochenmarkzellen in Türken-Lösung unter einer Hemocytometer zu zählen. Verdünnte zu einer Konzentration von 5 x 105 kernhaltigen Zellen/mL in PBS mit 2 % FBS.
    2. 100 µL der Rettung Knochenmarkzellen (5 x 104) in jede Vertiefung mit hämatopoetischen Nachkommen für die Transplantation Analyse und Mischen von pipettieren.
  3. Nachkommen der einzelnen Klone zu einem einzigen letal bestrahlten Empfänger Congenic Stamm B6 zu verpflanzen. SJL-PtprceinePepcb/BoyJ (B6 CD45.1) Erwachsenen Maus.
    1. Letal bestrahlen Sie die gleiche Anzahl von B6 CD45.1 Mäuse als die Anzahl der Klone, Nachkommen von einem einzigen Klon (über 1.000 cGy aus einer Cäsium-Quelle) individuell zu injizieren.
    2. Zeichnen Sie 200 µL Gesamt Zellsuspension (Dies schließt Zellen vom Klon sowie 5 x 104 B6 CD45.1 Rettung Knochenmarkzellen) in eine ½ mL Insulin Spritze mit einer Nadel 29 G ½ Zoll.
    3. Letal bestrahlen Sie B6 CD45.1 Erwachsenen Empfänger 2-24 h vor der Injektion.
    4. Mit einem Kunststoff Maus Restrainer, der Schweif Zugang ermöglicht, über das Heck Ader 200 µL Volumen mit Zellen von jeder Klon und 5 x 104 B6 CD45.1 Erwachsenen Rettung Knochenmarkzellen Empfänger Überleben unterstützen zu injizieren.
    5. Ohr-Tag und wiegen die Empfänger Mäuse, und überprüfen Sie ihre Gewicht/Gesundheit in regelmäßigen Abständen (z.B.3-4 mal / Woche post Bestrahlung/Transplantation oder pro einzelne institutionelle Standardarbeitsanweisungen) um gute Gesundheit zu gewährleisten.
  4. Analyse des peripheren Blutes Engraftment in regelmäßigen Abständen (z. B.2, 16, 24 Wochen) folgen der Transplantation.
    1. 50-100 µL Blut über Retro-Orbital bluten oder eine andere ethisch zugelassenen Blut-Vermietung-Methode zu entfernen.
    2. Blut 3 mL Lyse Puffer (16,6 g NH4Cl, 2 g Nahco33 und 74,4 mg EDTA, 2 L H2O) hinzu und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min. aufziehen und wieder auszusetzen das Pellet mit 2 mL PBS/2% FBS. 300 X g für 5 min zentrifugieren.
    3. Das Pellet mit 150 µL PBS/2% FBS mit 10 µg/mL FcR Block und 1 µg/mL DAPI wieder anhalten und 1/3 des Volumens auf einem gut mit 50 µL Isotype Steuerelemente für Spender und Abstammung, 1/3, ein gut mit 50 µL Antikörper für Spender und Isotype Steuerelemente für Linie zu verzichten , und 1/3 zu einem Brunnen mit 50 µL Antikörper, die Spender und Linie zu erkennen.
      Hinweis: Antikörper für die Erkennung von multilineage Engraftment: APCeFluor780-konjugierten Anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-konjugierten Anti-CD45.1, FITC-konjugierten Anti-CD3, PE-konjugierten Anti-F4/80, PerCP-konjugierten Anti-Gr1 und APC-konjugierten Anti-CD19, oder relevanten Isotype Kontrollen.
    4. Klone mit langfristigen Engraftment durch die Beurteilung der peripheren Blut Beitrag durch FACS im Laufe der Zeit der CD45.2 (Spender) identifizieren-abgeleitet von blutbildenden Zellen, myeloische (Gr1 und/oder F4/80 positiv), B-Zell (CD19 positiv) und T-Zellen (CD3-positiven) (Abbildung 4A -B).
      Hinweis: Hematopoietic Engraftment kann auch durch CD45.2 (Spender) analysiert werden-Beitrag hämatopoetischen Bevölkerungen von Gewebe aus dem Knochenmark, Milz, Thymus und Bauchfell oder nach sekundären Transplantation von Knochenmarkzellen geerntet abgeleitet in B6 CD45.1 Mäuse, serielle Engraftment Eigenschaften17zu analysieren.
  5. Korrelieren Sie jeder Klon phänotypischen Eigenschaften bestimmt durch anfängliche Einzelzelle Index Sortieren mit seinen Engraftment Eigenschaften. Mit Flow-Analyse-Software, Hochladen Sie Sortierparameter für jeden Index sortiert Zelle (korreliert mit der 96-Well sortiert wurde). Funktionale Kartendaten auf Fluss Parzellen, die phänotypischen Eigenschaften einzelner Zellen zu bewerten, wie sie auf ihre funktionale Ausgabe (z. B. langfristige, multilineage Engraftment) beziehen (Abbildung 4).

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Ergebnisse

Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung der Versuchsanordnung. Wenn P-Sp/AGM Gewebe seziert, gebündelt und in Kollagenase getrennt, sind sie mit Antikörpern gegen VE-Cadherin und EPCR für die Sortierung von Index gefärbt. Pre-HSC sind angereichert, in den Zellen an der VE-Cadherin+EPCRhoch (Abbildung 1 b) sortiert. Anderen Fluorochrom-konjugierten Antikörpern lassen sich nachträglich analysieren phä...

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Diskussion

Die Studie der HSC Genesis während der embryonalen Entwicklung erfordert Mittel, HSC Potenzial in Hemogenic Vorläufer noch fehlt die Kompetenz zur langfristigen multilineage hämatopoetischen Rekonstitution bei transplantierten Erwachsenen Empfängern zur Verfügung stellen zu erkennen. In diesem Protokoll präsentieren wir einen klonalen Assay der embryonalen Hemogenic Vorläufer von Stromazellen kokultur auf vaskuläre Nische ECs aus der Jahreshauptversammlung, die die Reifung der Vorläufer des HSC unterstützt, mit anschließ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir möchten danken Andrew Berger, Stacey Dozono und Brian Raden im Fred Hutchinson Flow Cytometry Kern für Hilfe mit FACS. Diese Arbeit wurde von den nationalen Instituten der Gesundheit NHLBI UO1 Grant #HL100395, unterstützt zusätzliche kollaborative Grant #HL099997 und NIDDK gewähren #RC2DK114777. Brandon Hadland wird von Alex es Lemonade Stand Foundation und Hyundai Hope auf Rädern-Stiftung unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AGM-EC Nährmedien
Materialien für die Kultivierung von Endothelzellen
TrypLE ExpressGibco12605-028Zur Dissoziation von AGM-EC-Monoschichten
Gelatine 0,1 % in WasserStemCell Technologies7903Zur Verklebung von AGM-EC-Monoschichten auf Kunststoff
96-Well-GewebekulturplattenCorning3599Zur Co-Kultivierung von AGM-EC-Monolayern und indexsortierten Klonen
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco14190-144Zur Dissektion und FACS-Färbung
500 ml FilterflaschenFisherScientific 9741202Zur Sterilfiltration von Endothelmedien
AGM-EC Kulturmedien (500 mls)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Gibco12440-053400 mls
Hyclone Fetal Bovine SerumFisher ScientificSH30088.03100 mls
Penicillin StreptomycinGibco15140-1225 mls
HeparinSigmaH314950 mg gelöst in 10 mls Medium
L-Glutamin (200 mM)StemCell Technologies71005 mls
Endothelmitogen (EKGS)Alfa AesarJ64516 (BT-203)10 mls Medium zum Auflösen hinzufügen und hinzufügen
Materialien für AGM-Index sort
Collagenase (0,25%)StemCell Technologies7902Zur Dissoziation von embryonalem Gewebe
verwenden 3ml SpritzeBD Biosciences309657Zur Sterilfiltration von Antikörperlösungen für FACS
0,22 & Mikro; M spritzengetriebener FilterMilliporeSLGP033RSZur sterilen Filterung von Antikörperlösungen für FACS
5 ml Polystyrol-Röhrchen mit ZellsiebkappeCorning352235Zur Entfernung von Zellklumpen vor der FACS-DAPI
(hergestellt als 1 mg/ml Stamm in H2O)Millipore268298Zur Verwendung zum Ausschluss toter Zellen aus
Sorte Anti-Maus-CD16/CD32 (FcR-Block)BDBiosciences 553141Zur Blockierung der unspezifischen Färbung von Fc-Rezeptoren
Antikörper für AGM-Index sort
Anti-Maus CD144 PE-Cyanin7eBioscience25-1441-82Färbung
von Ratten-IgG1 Kappa-Isotypkontrolle, PE-Cyanin7eBioscience25-4301-81Isotypkontrolle für CD144 PE-Cyanin7
Anti-Maus CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710eBioscience46-2012-80Färbung
von Ratten-IgG2b kappa Isotypkontrolle, PerCP-eFlour710eBioscience46-4031-80Isotypkontrolle für CD201 PerCP-eFluor710
Anti-Maus CD41 PEBD Biosciences558040Färbung
von Ratte IgG1 kappa Isotypkontrolle, PEBD Biosciences553925Isotypkontrolle für CD41 PE
Anti-Maus CD45 FITCeBioscience11-0451-85Färbung
Ratten-IgG2b kappa-Isotypkontrolle, FITCeBioscience11-4031-81Isotypkontrolle für CD45 FITC
AGM-serumfreie Medien (10mls)
X-Vivo 20Lonza04-448Q10 mls
rekombinanter muriner Stammzellfaktor (SCF)Peprotech250-0310 ml (100 mg/ml Stamm) Endkonzentration 100 ng/ml
rekombinanter humaner FLT3-Ligand (FLT3L)Peprotech300-1910 ml (100 mg/ml Stamm) Endkonzentration 100 ng/ml
rekombinantes humanes Thrombopoietin (TPO)Peprotech300-182 ml (100 mg/ml Stamm) Endkonzentration 20 ng/ml
rekombinantes murines Interleukin-3 (IL3)Peprotech213-132 ml (100 mg/ml Stamm) Endkonzentration 20 ng/ml
Materialien für die Färbung von co-kultivierten Zellen
96-Well-Platte, V-BodenCorning3894Verwendung für FACS-Analysen
Antikörper für die Analyse von Index-sortierten Klonen, die mit Endothelzellen co-kultiviert wurden
Anti-Maus-CD45 PerCP-Cyanin5.5eBioscience45-0451-82
IgG2b Kappa-Isotypkontrolle für Ratten, PE-Cyanin5.5eBioscience35-4031-80Isotypkontrolle für CD45 PerCP-Cyanin5.5
Anti-Maus-CD201 (EPCR) PEeBioscience12-2012-82
für RatteeBioscience12-4031-81Isotypkontrolle für CD201 PE
Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1) APCeBioscience17-5981-83
Färbung von Ratten-IgG2a kappa Isotyp-Kontrolle, APCeBioscience17-4321-81Isotyp-Kontrolle für Ly-6A/E APC
Anti-Maus F4/80 FITCeBioscience11-4801-81Färbe-IgG2a
kappa Isotyp-Kontrolle, FITCeBioscience11-4321-41Isotyp-Kontrolle für F4/80 FITC
Anti-Maus Ly-6G/C (Gr1) FITCBD Biosciences553127Färbung
Ratten-IgG2b Kappa-Isotypkontrolle, FITCBD Biosciences556923Isotypkontrolle für Ly-6G/C und CD3 FITC
Materialien für die Schwanzveneninjektion für Transplantationen
1/2 ml Insulinspritzen mit 29G 1/2" NadelnBD Biosciences309306Verwendung für die Schwanzveneninjektion zur Transplantation
Antikörper für die Analyse des peripheren Blutes nach translant
Anti-Maus Ly-6G/C (Gr1) PerCP Biolegend108426Färbung
Ratte IgG2b kappa Isotypkontrolle, PerCPBiolegend400629Isotypkontrolle für Ly-6G/C PerCP
Anti-Maus F4/80 PEeBioscience12-4801-82Färbung
Ratte IgG2a kappa Isotypkontrolle, PEeBioscience12-4321-80Isotypkontrolle für F4/80 PE
Anti-Maus CD3 FITCBD Biosciences555274Färbung
Anti-Maus CD19 APCBD Biosciences550992Färbung
Ratte IgG2a kappa Isotypkontrolle, APCBD Biosciences553932Isotypkontrolle für CD19 APC
Anti-Maus CD45.1 (A20) PE-Cyanin7eBioscience25-0453-82
IgG2a kappa Isotypkontrolle für Ratten, PE-Cyanin7eBioscience25-4321-81Isotypkontrolle für CD45.1 PE-Cyanin7
Anti-Maus CD45.2 (104) APC-eFluor780eBioscience47-0454-82IgG2a
kappa Isotypkontrolle für Ratte, APC-eFluor780eBioscience47-4321-80Isotypkontrolle für CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD Biosciences
BD FACSCanto II mit PlattenleserBD Biosciences
HämozytometerFisher ScientificS17040Zum Zählen von Zellen
MehrkanalpipetteFisher Scientific14-559-417Für
FACS AnalysesoftwareFlowJo/BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo
der von IgG2b-Kappa-Isotypkontrolle von BD FACSAria II mit DIVA-Software für Dispensierzellen

Referenzen

  1. Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
  2. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
  3. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
  4. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  5. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
  6. Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
  7. McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
  8. Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
  9. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
  10. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  11. Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
  12. Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
  13. Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
  14. Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
  15. Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
  16. Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
  17. Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
  18. Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
  19. Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
  20. Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
  22. Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
  23. Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156(2009).
  24. Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
  25. Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
  26. Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
  27. Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
  28. Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).

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