Method Article

Klonale Analyse der embryonalen Hämatopoetischen Stammzellen Vorstufen mit einzelligen Index sortieren kombiniert mit Endothelzellen Nischenkultur Co

DOI:

10.3791/56973

⸱

May 8th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, University of Washington School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier präsentieren wir Methodik zur klonalen Analyse von Hämatopoetischen Stammzellen Vorläufer während der murinen embryonalen Entwicklung. Wir kombinieren Index sortieren einzelner Zellen aus der embryonalen Aorta-Gonade-Wachstum-Region mit Endothelzellen Kokulturen und Transplantation der phänotypischen Eigenschaften und Engraftment Potenzial der einzelnen hämatopoetischen Vorläufer zu charakterisieren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Fähigkeit, Hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Genesis während der Embryonalentwicklung wurde begrenzt durch die Seltenheit der HSC-Vorstufen in der frühe Embryo und das Fehlen von Assays, die funktionell das langfristige multilineage Engraftment Potenzial identifizieren einzelne vermeintliche HSC-Vorläufer. Hier beschreiben wir die Methodik, die die Isolierung und Charakterisierung von funktionell validierten HSC-Vorläufer der Ebene der einzelnen Zelle ermöglicht. Erstens verwenden wir Index Sortierung den präzise phänotypischen Parameter jeder einzeln sortierten Zelle Katalog mit einer Kombination aus phänotypische Markierungen für HSC-Vorstufen mit zusätzlichen Markern für die experimentelle Analyse zu bereichern. Zweitens ist jeder Index sortiert Zelle Co kultiviert mit vaskulären Nische Stroma aus der Aorta-Gonade-Wachstum (AGM) Region, die die Reifung der nicht Einpflanzen HSC Vorläufer des funktionalen HSC mit multilineage, langfristige Engraftment Potenzial in unterstützt Transplantation-Assays. Diese Methodik ermöglicht die Korrelation der phänotypischen Eigenschaften von klonalen Hemogenic Vorstufen mit ihrem funktionalen Engraftment oder andere Eigenschaften wie transkriptionellen Profil, was ein Mittel für die detaillierte Analyse des HSC Vorläufer Entwicklung auf der Ebene der einzelnen Zelle.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonale Untersuchungen ergaben Heterogenität in den langfristigen Engraftment Eigenschaften des Erwachsenen HSCs, neue Einblicke in HSC-Subtypen und Änderungen im HSC Verhalten während der Alterung1. Jedoch ähnliche Studien der embryonalen HSCs und deren Vorstufen schwieriger gewesen. Während der frühen Embryonalentwicklung HSCs ergeben sich aus einer Bevölkerung von Vorläuferstoffen gemäß Hemogenic Endothel in einem vorübergehenden Prozess bekannt als die endotheliale hämatopoetischen Übergang2. Die ersten HSC, definiert durch ihre Fähigkeit, stabile, langfristige multilineage Engraftment nach Transplantation in konditi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des Fred Hutchinson Cancer Research Center genehmigt.

1. Vorbereitung der AGM-EG Monolagen kokultur

  1. 24 h vor der Hauptversammlung Dissektion und Art, machen AGM-EG-Kultur, Medien und Filter zu sterilisieren.
  2. 0,1 % Gelatine in Wasser (100 µL/Well) in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min. Absaugen die Gelatine und lassen die Platte in einer Gewebekultur-Haube mit den Deckel entfernt, bis der Brunnen trocken sind.
  3. Die AGM-EG Monolagen und Platte für 96-Well....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung der Versuchsanordnung. Wenn P-Sp/AGM Gewebe seziert, gebündelt und in Kollagenase getrennt, sind sie mit Antikörpern gegen VE-Cadherin und EPCR für die Sortierung von Index gefärbt. Pre-HSC sind angereichert, in den Zellen an der VE-Cadherin+EPCRhoch (Abbildung 1 b) sortiert. Anderen Fluorochrom-konjugierten Antikörpern lassen sich nachträglich analysieren phä.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Studie der HSC Genesis während der embryonalen Entwicklung erfordert Mittel, HSC Potenzial in Hemogenic Vorläufer noch fehlt die Kompetenz zur langfristigen multilineage hämatopoetischen Rekonstitution bei transplantierten Erwachsenen Empfängern zur Verfügung stellen zu erkennen. In diesem Protokoll präsentieren wir einen klonalen Assay der embryonalen Hemogenic Vorläufer von Stromazellen kokultur auf vaskuläre Nische ECs aus der Jahreshauptversammlung, die die Reifung der Vorläufer des HSC unterstützt, mit anschließ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten danken Andrew Berger, Stacey Dozono und Brian Raden im Fred Hutchinson Flow Cytometry Kern für Hilfe mit FACS. Diese Arbeit wurde von den nationalen Instituten der Gesundheit NHLBI UO1 Grant #HL100395, unterstützt zusätzliche kollaborative Grant #HL099997 und NIDDK gewähren #RC2DK114777. Brandon Hadland wird von Alex es Lemonade Stand Foundation und Hyundai Hope auf Rädern-Stiftung unterstützt.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AGM-EC Nährmedien
Materialien für die Kultivierung von Endothelzellen
TrypLE ExpressGibco12605-028Zur Dissoziation von AGM-EC-Monoschichten
Gelatine 0,1 % in WasserStemCell Technologies7903Zur Verklebung von AGM-EC-Monoschichten auf Kunststoff
96-Well-GewebekulturplattenCorning3599Zur Co-Kultivierung von AGM-EC-Monolayern und indexsortierten Klonen
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco14190-144Zur Dissektion und FACS-Färbung
500 ml FilterflaschenFisherScientific 9741202Zur Sterilfiltration von Endothelmedien
AGM-EC Kulturmedien (500 mls)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Gibco12440-053400 mls
Hyclone Fetal Bovine SerumFisher ScientificSH30088.03100 mls
Penicillin StreptomycinGibco15140-1225 mls
HeparinSigmaH314950 mg gelöst in 10 mls Medium
L-Glutamin (200 mM)StemCell Technologies71005 mls
Endothelmitogen (EKGS)Alfa AesarJ64516 (BT-203)10 mls Medium zum Auflösen hinzufügen und hinzufügen
Materialien für AGM-Index sort
Collagenase (0,25%)StemCell Technologies7902Zur Dissoziation von embryonalem Gewebe
verwenden 3ml SpritzeBD Biosciences309657Zur Sterilfiltration von Antikörperlösungen für FACS
0,22 & Mikro; M spritzengetriebener FilterMilliporeSLGP033RSZur sterilen Filterung von Antikörperlösungen für FACS
5 ml Polystyrol-Röhrchen mit ZellsiebkappeCorning352235Zur Entfernung von Zellklumpen vor der FACS-DAPI
(hergestellt als 1 mg/ml Stamm in H2O)Millipore268298Zur Verwendung zum Ausschluss toter Zellen aus
Sorte Anti-Maus-CD16/CD32 (FcR-Block)BDBiosciences 553141Zur Blockierung der unspezifischen Färbung von Fc-Rezeptoren
Antikörper für AGM-Index sort
Anti-Maus CD144 PE-Cyanin7eBioscience25-1441-82Färbung
von Ratten-IgG1 Kappa-Isotypkontrolle, PE-Cyanin7eBioscience25-4301-81Isotypkontrolle für CD144 PE-Cyanin7
Anti-Maus CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710eBioscience46-2012-80Färbung
von Ratten-IgG2b kappa Isotypkontrolle, PerCP-eFlour710eBioscience46-4031-80Isotypkontrolle für CD201 PerCP-eFluor710
Anti-Maus CD41 PEBD Biosciences558040Färbung
von Ratte IgG1 kappa Isotypkontrolle, PEBD Biosciences553925Isotypkontrolle für CD41 PE
Anti-Maus CD45 FITCeBioscience11-0451-85Färbung
Ratten-IgG2b kappa-Isotypkontrolle, FITCeBioscience11-4031-81Isotypkontrolle für CD45 FITC
AGM-serumfreie Medien (10mls)
X-Vivo 20Lonza04-448Q10 mls
rekombinanter muriner Stammzellfaktor (SCF)Peprotech250-0310 ml (100 mg/ml Stamm) Endkonzentration 100 ng/ml
rekombinanter humaner FLT3-Ligand (FLT3L)Peprotech300-1910 ml (100 mg/ml Stamm) Endkonzentration 100 ng/ml
rekombinantes humanes Thrombopoietin (TPO)Peprotech300-182 ml (100 mg/ml Stamm) Endkonzentration 20 ng/ml
rekombinantes murines Interleukin-3 (IL3)Peprotech213-132 ml (100 mg/ml Stamm) Endkonzentration 20 ng/ml
Materialien für die Färbung von co-kultivierten Zellen
96-Well-Platte, V-BodenCorning3894Verwendung für FACS-Analysen
Antikörper für die Analyse von Index-sortierten Klonen, die mit Endothelzellen co-kultiviert wurden
Anti-Maus-CD45 PerCP-Cyanin5.5eBioscience45-0451-82
IgG2b Kappa-Isotypkontrolle für Ratten, PE-Cyanin5.5eBioscience35-4031-80Isotypkontrolle für CD45 PerCP-Cyanin5.5
Anti-Maus-CD201 (EPCR) PEeBioscience12-2012-82
für RatteeBioscience12-4031-81Isotypkontrolle für CD201 PE
Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1) APCeBioscience17-5981-83
Färbung von Ratten-IgG2a kappa Isotyp-Kontrolle, APCeBioscience17-4321-81Isotyp-Kontrolle für Ly-6A/E APC
Anti-Maus F4/80 FITCeBioscience11-4801-81Färbe-IgG2a
kappa Isotyp-Kontrolle, FITCeBioscience11-4321-41Isotyp-Kontrolle für F4/80 FITC
Anti-Maus Ly-6G/C (Gr1) FITCBD Biosciences553127Färbung
Ratten-IgG2b Kappa-Isotypkontrolle, FITCBD Biosciences556923Isotypkontrolle für Ly-6G/C und CD3 FITC
Materialien für die Schwanzveneninjektion für Transplantationen
1/2 ml Insulinspritzen mit 29G 1/2" NadelnBD Biosciences309306Verwendung für die Schwanzveneninjektion zur Transplantation
Antikörper für die Analyse des peripheren Blutes nach translant
Anti-Maus Ly-6G/C (Gr1) PerCP Biolegend108426Färbung
Ratte IgG2b kappa Isotypkontrolle, PerCPBiolegend400629Isotypkontrolle für Ly-6G/C PerCP
Anti-Maus F4/80 PEeBioscience12-4801-82Färbung
Ratte IgG2a kappa Isotypkontrolle, PEeBioscience12-4321-80Isotypkontrolle für F4/80 PE
Anti-Maus CD3 FITCBD Biosciences555274Färbung
Anti-Maus CD19 APCBD Biosciences550992Färbung
Ratte IgG2a kappa Isotypkontrolle, APCBD Biosciences553932Isotypkontrolle für CD19 APC
Anti-Maus CD45.1 (A20) PE-Cyanin7eBioscience25-0453-82
IgG2a kappa Isotypkontrolle für Ratten, PE-Cyanin7eBioscience25-4321-81Isotypkontrolle für CD45.1 PE-Cyanin7
Anti-Maus CD45.2 (104) APC-eFluor780eBioscience47-0454-82IgG2a
kappa Isotypkontrolle für Ratte, APC-eFluor780eBioscience47-4321-80Isotypkontrolle für CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD Biosciences
BD FACSCanto II mit PlattenleserBD Biosciences
HämozytometerFisher ScientificS17040Zum Zählen von Zellen
MehrkanalpipetteFisher Scientific14-559-417Für
FACS AnalysesoftwareFlowJo/BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/solutions/flowjo
der von IgG2b-Kappa-Isotypkontrolle von BD FACSAria II mit DIVA-Software für Dispensierzellen

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
  2. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hematopoietic Stem CellSingle Cell Index SortingEndothelial Cell Niche Co cultureEmbryonic HSC PrecursorsAorta gonad mesonephros AGMFlow Cytometry AnalysisClonal Hematopoietic AnalysisVascular Endothelial CadherinEndothelial Protein C ReceptorLong term Engraftment Potential

Related Articles