Ein semi-automatischen Workflow wird für gezielte Sequenzierung der 16 s rRNA von Muttermilch und anderen Low-Biomasse Probentypen vorgestellt.
Methodenartikel
Ein semi-automatischen Workflow wird für gezielte Sequenzierung der 16 s rRNA von Muttermilch und anderen Low-Biomasse Probentypen vorgestellt.
Studien von mikrobiellen Gemeinschaften haben sich mit der Entwicklung der relativ kostengünstig, schnell und hoher Durchsatz Sequenzierung verbreitet. Wie bei all diesen Technologien, hängen reproduzierbare Ergebnisse ein Labor-Workflow, der entsprechende Vorsichtsmaßnahmen und Kontrollen enthält. Dies ist besonders wichtig mit niedrig-Biomasse-Proben, wo verunreinigen bakteriellen DNA irreführende Ergebnisse erzeugen. Dieser Artikel beschreibt einen semi-automatischen Workflow, Mikroben aus Muttermilch Milchproben mit gezielte Sequenzierung der 16 s ribosomale RNA (rRNA) V4 Region im Low - mid throughput Maßstab zu identifizieren. Das Protokoll beschreibt Probenvorbereitung aus Vollmilch, einschließlich: lyse, Nukleinsäure-Extraktion, Verstärkung der V4 Region der 16 s rRNA-Gen und Bibliothek Vorbereitung mit Maßnahmen zur Qualitätskontrolle zu probieren. Wichtig ist, das Protokoll und die Diskussion beachten Sie Punkte, die hervorstechenden zur Vorbereitung und Analyse von Proben, niedrig-Biomasse einschließlich entsprechende positive und negative Kontrollen, PCR-Inhibitor Entfernung, Probe Kontamination durch Umwelt-, Reagenz sind oder experimentelle Quellen und experimentelle best Practices entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Während das Protokoll wie beschrieben spezifisch menschlichen Milchproben ist, ist es anpassungsfähig an zahlreichen Low - und High-Biomasse Probentypen, einschließlich Proben auf Tupfer, gefroren, pur oder in einem Erhaltung Puffer stabilisiert.
Der mikrobiellen Lebensgemeinschaften, die Menschen besiedeln sind vermutlich entscheidender Bedeutung für die menschliche Gesundheit und Krankheit beeinflussen Stoffwechsel, Immunsystem Entwicklung, Anfälligkeit für Krankheiten und Reaktionen auf Impfungen und Medikamenten Therapie1, 2. Bemühungen um den Einfluss der Mikrobiota auf die menschliche Gesundheit derzeit verstehen betonen die Identifizierung von Mikroben verbunden mit definierten anatomischen Kompartimente (d.h., Haut, Darm, Oral usw.),sowie lokalisierte Websites in Diese Fächer3,
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Für alle Protokoll-Schritte geeigneter persönliche Schutzausrüstung (PSA) muss getragen werden, und strengen Verunreinigung Präventionsansätze unternommen werden müssen. Beobachten Sie Arbeitsabläufe von Vorverstärkung Arbeitsbereichen zu Post-Verstärkung Arbeitsbereiche, Kontamination der Proben zu minimieren. Alle Lieferungen verwendet sind steril, frei von RNase, DNase, DNA und pyrogenfreie. Alle Pipettenspitzen werden gefiltert. Ein Flussdiagramm der Protokoll-Schritte steht zur Verfügung (Abbildung 1).
1. Probe lyse
Hinweis: Probe-lyse und Nukleinsäure-Extraktion erfolgt über ein ....
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Die hier vorgestellten Protokoll beinhaltet wichtige Qualitätskontrolle (QC) Schritte um sicherzustellen, dass die generierten Daten treffen für Protokoll Sensitivität, Spezifität und Verunreinigung Kontrolle benchmarks. QC zunächst das Protokoll folgt PCR Verstärkung der 16 s V4 Region (Abbildung 2). 1 µL des PCR-Produktes von jeder Probe wurde analysiert, durch Elektrophorese zu bestätigen, dass es innerhalb der erwarteten Größenbereich von 315-450 bp (
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Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation der 16 s rRNA ist eine weit verbreitete und schnelle Technik für Microbiome Charakterisierung18. Jedoch können viele Faktoren, einschließlich Batch Effekte, Umweltverschmutzung, Probe Cross-Kontamination, Sensitivität und Reproduzierbarkeit beeinträchtigen Versuchsergebnisse und verwirren ihre Auslegung7,19 , 20. um robuste 16 s Analysen am besten zu erleicht.......
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Die Autoren haben nichts preisgeben.
Wir möchten Helty Adisetiyo, PhD und Shangxin Yang, PhD für die Entwicklung des Protokolls zu danken. Umfassende Unterstützung für die internationalen mütterlichen pädiatrische Jugendlichen AIDS klinische Studien Gruppe (IMPAACT) wurde vom National Institute of Allergy und Infectious Diseases (NIAID) des National Institute of Health (NIH) unter Preis zahlen zur Verfügung gestellt. UM1AI068632 (IMPAACT LOC), UM1AI068616 (IMPAACT SDMC) und UM1AI106716 (IMPAACT-LC), mit Kofinanzierung von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) und das National Institute of Mental Health (NIMH). Der Inhalt ist ausschließlich in der....
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| AllPrep RNA/DNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | DNA/RNA-Extraktionskit |
| Eliminase | Fisher Scientific | 435532 | RNase, DNase, DNA-Dekontaminationsmittel |
| Thermomixer | Fisher Scientific | temperaturgesteuerter Vortexer-Puffer | |
| RLT plus | Qiagen | 1053393 | Guanidiniumthiocyanat-Lysepuffer/ Teil des Allprep-Kits |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 63689-25ML-F | ß-ME ist ein Reduktionsmittel, das RNasen irreversibel denaturiert, indem es Disulfidbindungen reduziert |
| LME Beads | MP Biomedicals | 116914050 | Bead |
| Tube QIAgen TissueLyzer | Qiagen | 85300 | automatisiertes Probendisruptor-Adapterset |
| QIAshreddersäule | Qiagen | 79654 | |
| QIAgen RB Röhrchenhersteller | Mikrozentrifugenröhrchen im Kit | ||
| QIAcube und zugehörige Kunststoffe | Qiagen | 9001292 | automatisiertes DNA/RNA-Aufreinigungsinstrument |
| DNA-Exitus plus | Applichem | A7089 | nicht-enzymatische Dekontaminationslösung |
| EB Puffer | Qiagen | 19086 | Elutionspuffer |
| QIAgility und verwandte Kunststoffartikel | Qiagen | 9001532 | Roboter-Liquid-Handler |
| PCR-Wasser | MO BIO | 17000-5PRIME | |
| HotMasterMix | Quantabio | 2200400 | |
| Barcode-Reverse-Primer | Eurofin | Kein Katalog #'s | entworfen und bestellt |
| 96 Well PCR-Platte | USA wissenschaftlich | 1402-9708 | |
| Tapestation 2200 und zugehörige Kunststoffartikel | Agilent | G2964AA | automatisierter DNA/RNA-Fragmentanalysator |
| D1000 Reagenzien für die Tapestation | Agilent | 5067-5585 | Probenpuffer und Leiter sind Teil dieses Kits |
| OneStep PCR Inhibitor Removal Kit | Zymo Research | 50444470 | PCR-Inhibitorentfernung erfolgt gemäß den Anweisungen des Herstellers. |
| QIAquick PCR-Aufreinigungskit | Qiagen | 28104 | DNA-Aufreinigungskit: Aufreinigung von PCR-Produkten auf Kieselsäuremembranbasis |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Dimethylsulfoxid-basierter Verdünnungspuffer und Farbstoff sind Teil dieses Kits. |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher | Mikrovolumen-Spektralphotometer | |
| MiSeq 300 V2 Kit | Illumina | 15033624/15033626 | |
| MiSeq | Illumina | No Catalog #'s | Sequenzer der nächsten Generation |
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