Mitochondrien enthalten mehrere Flavin-abhängige Enzyme, die reaktive Sauerstoffspezies (ROS) produzieren kann. Überwachung von ROS ist Freigabe von einzelnen Standorten in den Mitochondrien schwierig wegen unerwünschten Nebenreaktionen. Wir präsentieren Ihnen eine einfache, kostengünstige Methode zur direkten Beurteilung der native Preise für ROS Release mit gereinigtem Flavoenzymes und Mikrotestplatte Fluorometry.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Gleichzeitige Messung von Superoxid/Wasserstoffperoxid und NADH Produktion durch Flavin-haltigen mitochondriale Dehydrogenases
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es wurde berichtet, dass Mitochondrien können bis zu 12 enzymatische Quellen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) enthalten. Ein Großteil dieser Seiten gehören Flavin-abhängige Atemwege komplexe und Dehydrogenases, die eine Mischung aus Superoxid (O2● -) und Wasserstoffperoxid (H2O2) zu produzieren. Genaue Quantifizierung der ROS-Produktion Potenzial der einzelnen Standorte in isolierten Mitochondrien kann aufgrund des Vorhandenseins von antioxidativen Verteidigungssysteme und Nebenreaktionen, die auch O2●-/ h2O2bilden schwierig sein. Verwendung von unspezifische Inhibitoren, die mitochondriale Bioenergetik stören können kann auch Messungen beeinträchtigen, durch ROS Freisetzung von anderen Websites der Produktion ändern. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode für die gleichzeitige Messung von H2O2 -Version und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide (NADH) Produktion von gereinigtem Flavin verbunden Dehydrogenases. Für unsere Zwecke hier haben wir gereinigten Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDHC) und α-Ketoglutarate Dehydrogenase Komplex (KGDHC) Schweine Herz Ursprungs als Beispiele verwendet. Diese Methode ermöglicht eine genaue Messung der native H2O2 Freisetzungsraten von einzelnen Standorten der Produktion durch den Wegfall von anderen potenziellen Quellen von ROS und antioxidativen Systeme. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode für einen direkten Vergleich des Verhältnisses zwischen H2O2 -Version und Enzym-Aktivität und die Prüfung der Wirksamkeit und Selektivität von Inhibitoren für ROS-Produktion. Alles in allem kann dieser Ansatz für die eingehende Beurteilung der native Raten von ROS Freigabe für einzelne Enzyme vor komplexere Experimente mit isolierten Mitochondrien oder permeabilized Muskelfaser ermöglichen.
Einleitung
Das ultimative Ziel der Nährstoff Stoffwechsel ist Adenosintriphosphat (ATP) zu machen. In Säugerzellen geschieht dies in den Mitochondrien, Doppel-membraned Organellen, die in Kohlenstoff in ATP gespeicherte Energie umwandeln. Die ATP-Produktion beginnt, wenn Kohlenstoff verbrannt von Mitochondrien bilden zwei Elektronen Träger, NADH und Flavin-Adenin-Dinucleotide (FADH2)1ist. NADH und FADH2 werden dann oxidiert durch Multi-Untereinheit Atemwege komplexe I und II, beziehungsweise, und die freigesetzten Elektronen werden auf das terminal Elektron Akzeptor molekularer Sauerstoff (O2) am Komplex IV
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
(1) Chemikalien und gereinigten Enzyme
- Die folgenden Materialien beziehen: PDHC und KGDHC der Schweine Herz Herkunft (oder eine andere gereinigte mitochondriale Flavoenzyme); H2O2 (30 % ige Lösung), Pyruvat, α-Ketoglutarate NAD+, NADH, CoASH, Thiamin-Pyrophosphat (TPP), Mannit, HEPES, Saccharose, EGTA, 3-Methyl-2-Oxo-Valeric-Säure (KMV), Superoxid-Dismutase (SOD), Meerrettich-Peroxidase (HRP), 10-Acetyl-3,7-Dihydroxyphenoxazine Reagenz (AUR), und CPI-613.
2. Planung der Probe und Reagenz Vorbereitung
- Richten Sie die Probe gemäß Tabelle 1 in eine 96-Well-Platte.
H....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Abbildung 3A bietet eine repräsentative Spur für das RFU während der gleichzeitigen Messung von H2O2 und NADH Produktion von gereinigten KGDHC gesammelt. Die RFU-Rohdaten für jedes Zeitintervall ist in Abbildung 3 bdargestellt. Die RFU Rohdaten werden dann zur Analyse exportiert. Durch Extrapolation aus standard Kurven in Abbildung 2dargestellt, kann die absolute Menge an NADH u.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Dieses Protokoll ist vorteilhaft da, (1) Es beseitigt alle konkurrierenden Reaktionen, die sonst mit H2O2 Nachweis (z.B., Antioxidans oder anderen Quellen von ROS), 2 stören können) bietet eine direkte Bewertung der einheimischen Rate ROS zu lösen, indem eine Flavin-haltigen mitochondriale Dehydrogenase, 3) erlaubt den Vergleich der einheimischen ROS veröffentlichen Preise von zwei oder mehr gereinigt Flavin-basierte Dehydrogenases, 4) ermöglichen einen direkten Vergleich der Rate der ROS-R.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Es gibt nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von naturwissenschaftlich-technischen Forschung Rat von Kanada (NSERC) finanziert. Video-Produktion erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Zentrum für Innovation in Lehre und lernen (CITL) an der Memorial University of Newfoundland.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex | SIGMA | P7032-10UN | gereinigtes Flavoenzym-Alpha-Ketoglutarat-Dehydrogenase-Komplex |
| SIGMA | K1502-20UN | gereinigtes Flavoenzym | |
| 30% Wasserstoffperoxid-Lösung | SIGMA | HX0640-5 | Reagenz, Standardkurven |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | Reagenz, Aktivitäts-/ROS-Freisetzungsassay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | Reagenz, Standardkurven |
| Pyruvat | SIGMA | P2256-5G | Reagenz, Aktivität/ROS Release Assay |
| Alpha-Ketoglutarat | SIGMA | 75892-25G | Reagenz, Aktivität/ROS Release Assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | Reagenz, Aktivität/ROS Release Assay |
| Thiaminpyrophosphat | SIGMA | C8754-1G | Reagenz-, Aktivitäts-/ROS-Freisetzungsassay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | Pufferkomponente |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | Pufferkomponente |
| Saccharose | SIGMA | S7903-250G | Pufferkomponente |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | Pufferkomponente |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | Reagenz, ROS Release Inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | Reagenz, ROS Release Inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | Reagenz, ROS Release Detection |
| Meerrettichperoxidase | SIGMA | P8375-1KU | Reagenz, ROS Release |
| Detection Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | Reagenz, ROS Release Detection |
| Biotech Synergy 2 Mikroplatten-Reader | BioTek Instruments | Mikroplatten-Reader für Assays | |
| Gen5-Software | BioTek Instruments | Software, die für die Entnahme von Rohdaten verwendet wird RFU | |
| Graphpad | Prism Graphpad Software-Software | , Datenanalyse | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft-Software | , Datenanalyse |
Referenzen
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
