Interaktom-Seq: Ein Protokoll zur Domainome Bibliotheksbau, Validierung und Auswahl von Phagen-Display und Next Generation Sequencing

Summary

Die beschriebenen Protokolle ermöglichen Aufbau, Charakterisierung und Auswahl (gegen das Ziel der Wahl) einer "Domainome"-Bibliothek, die aus jeder DNA-Quelle hergestellt. Dies wird erreicht durch eine Forschungs-Pipeline, die verschiedenen Technologien kombiniert: Phagen-Display, eine klappbare Reporter und Sequenzierung der nächsten Generation mit einem Web-Tool für die Datenanalyse.

Abstract

Klappbare Reporter sind Proteine mit leicht erkennbaren Phänotypen, wie z. B. Antibiotika-Resistenz, dessen Falten und Funktion beeinträchtigt wird, wenn schlecht Faltung von Proteinen oder zufällige open Reading Frames verschmolzen. Wir haben eine Strategie entwickelt, kann mithilfe von TEM-1 β-Lactamase (das Enzym überträgt die Ampicillin-Resistenz) auf genomischer Ebene, Sammlungen von korrekt gefaltete Protein Domains wählen wir aus der Codierung Teil der DNA von jedem intronless Genom. Die PROTEINFRAGMENTE erhalten durch diesen Ansatz, der so genannte "Domainome", werden gut ausgedrückt und löslich, so dass sie für strukturelle und funktionelle Studien sein.

Von Klonen und die Anzeige "Domainome" direkt in einem Phagen-Display-System, haben wir zeigten, dass spezifisches Protein Domains mit der gewünschten Bindeeigenschaften (z. B. an andere Proteine oder Antikörper), wählen dadurch wesentlich kann experimentellen Daten für gen-Annotation oder Antigen-Identifikation.

Die Identifikation der meisten angereicherten Klone in einer ausgewählten polyklonale Population kann mithilfe von Technologien neuartige Next Generation Sequencing (NGS) erreicht werden. Aus diesen Gründen stellen wir Tiefe Sequenzierung Analyse der Bibliothek selbst und die Auswahl-Ausgänge, komplette Informationen über Vielfalt, Fülle und genaue Kartierung aller ausgewählten Fragment. Die hier vorgestellten Protokolle zeigen die wichtigsten Schritte für Bibliotheksbau, Charakterisierung und Validierung.

Introduction

Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Methode für den Bau und die Auswahl der Bibliotheken der gefalteten und lösliches Protein Domänen aus jeder genic/genomische ab Quelle. Der Ansatz kombiniert drei verschiedene Technologien: Phagen-Display, die Verwendung eines klappbaren Reporter und nächsten Generation Sequencing (NGS) mit einer speziellen Web-Tool für die Datenanalyse. Die Methoden können in vielen verschiedenen Zusammenhängen von Protein-basierten Forschung verwendet werden, für Identifikation und Kommentierung der neuen Proteine-Eiweiß-Domains, Charakterisierung von strukturellen und funktionellen Eigenschaften des bekannten Proteine sowie Definition von Pro....

Protocol

1. Aufbau der ORF-Bibliothek (Abbildung 1)

1. Vorbereitung der Einsatz DNA
   1. Vorbereitung von synthetischen oder genomische DNA-Fragmente
      1. Extrakt/DNA mit Standardmethoden²⁶zu reinigen.
      2. Fragment-DNA durch Ultraschallbehandlung. Wenn mit einem standard sonikator als allgemeine Anregung Start mit 30 s-Pulse bei 100 % Leistung.
         Hinweis: Pilot Versuche sollten mit unterschiedlicher Leistung und Beschallung Zeiten legen Sie die optimalen Bedingungen für die DNA-Vorbereitung durchgeführt werden. Bestimmen Sie nach jedem Test die Größe der DNA-Frag....

Results

Die Filterung Ansatz ist in Abbildung 1schematisiert. Jede Art von intronless DNA kann verwendet werden. In Figur 1A ist der erste Teil der Filterung Ansatz vertreten: nach dem Laden auf einem Agarosegel oder einem Bioanalyzer eine gute Fragmentierung der DNA von Interesse erscheint als ein Abstrich der Fragmente mit einer Länge in der gewünschten Größe 150-750 bp. Eine repräsentative virtuelle Gelbild der fragmentierten DNA gewo.......

Discussion

Die Schaffung einer qualitativ hochwertige unterschiedlichsten ORFs gefilterte Bibliothek ist der erste wichtige Schritt in dem gesamten Verfahren, da sie die nachfolgenden Schritte der Pipeline beeinflussen.

Ein wichtiges Merkmal der Vorteil unserer Methode ist, dass jede Quelle (intronless) DNA (cDNA, genomische DNA, PCR abgeleitet oder synthetische DNA) geeignet für Bibliotheksbau. Der erste Parameter, der berücksichtigt werden sollte ist, dass die Länge der DNA-Fragmente in der pFILTER-Vek.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sonopuls Ultraschall-Homogenisator	Bandelin	HD2070	oder gleichwertig
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0321	oder gleichwertig
GeneRuler 1 kb DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM0311	oder gleichwertig
Molecular Biology Agarose	BioRad	161-3102	oder gleichwertig
Green Gel Plus	Fisher Molecular Biology	FS-GEL01	oder gleichwertig
6x DNA Loading Dye	Thermo Fisher Scientific	R0611	oder gleichwertig
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	oder gleichwertig
Quick Blunting Kit	New England Biolabs	E1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis Spektralphotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Reverse-Transkriptionskit für cDNA mit hoher Kapazität	Thermo Fisher Scientific	4368813
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S	oder gleichwertiges
QIAquick PCR-Aufreinigungskit	Qiagen	28104	oder gleichwertig
EcoRV	New England Biolabs	R0195L
Antarktische Phosphatase	New England Biolabs	M0289S
T4 DNA-Ligase	New England Biolabs	M0202T
Natriumacetat 3M pH5,2	allgemeiner Laborlieferant
Ethanol für die Molekularbiologie	Sigma-Aldrich	E7023	oder gleichwertige
DH5aF-Bakterienzellen	Thermo Fisher Scientific
0,2 ml Röhrchen	allgemeiner Laborlieferant
1,5 ml Röhrchen	allgemeiner Laborlieferant
0,1 cm Elektroporationsküvetten	Biosigma	4905020
Elektroporator 2510	Eppendorf
2x YT medium	Sigma-Aldrich	Y1003
Ampicillin Natriumsalz	Sigma-Aldrich	A9518
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
DreamTaq DNA-Polymerase	Thermo Fisher Scientific	EP0702
Desoxynukleotid (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447S
96-Well-Thermocycler (mit beheiztem Deckel)	allgemeiner Laborlieferant
	allgemeiner Laborlieferant
100 mm Platten	allgemeiner Laborlieferant
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
BssHII	New England Biolabs	R0199L
NheI	New England Biolabs	R0131L
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	oder gleichwertig
M13KO7 Helper Phage	GE Healthcare Life Sciences	27-1524-01
Kanamycinsulfat aus Streptomyces kanamyceticus	Sigma-Aldrich	K1377
Polyethylenglykol (PEG)	Sigma-Aldrich	P5413
Natriumclorid (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014
PBS	allgemeiner Laborlieferant
Dynabeads Protein G für Immunpräzipitation	Thermo Fisher Scientific	10003D	oder gleichwertig
MagnaRack Magnetic Separation Rack	Thermo Fisher Scientific	CS15000	oder gleichwertig
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
fettfreies Trockenmilchpulver	EuroClone	EMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems, Fisher Scientific	7958935001
AMPure XP beads	Agencourt, Beckman Coulter	A63881
Nextera XT Dual Index Primers	Illumina	FC-131-2001 oder FC-131-2002 oder FC-131-2003 oder FC-131-2004
MiSeq oder Hiseq2500	Illumina
Spectrophotomer	Nanodrop
Agilent Bioanalysator oder TapeStation	Agilent
Forward PCR Primer	allgemeiner Laborlieferant		5' TACCTATTGCCTACGGCA GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3"
Reverse PCR Primer	allgemeiner Laborlieferant		5' TGGTGATGGTGAGTACTA TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3"
Forward Primer für NGS	General Lab Supplier		5' TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGGCA GCAAGCGGCGCGCGCATGC 3";
Reverse Primer für NGS	General Lab Supplier		5' GTCTCGTGGGCTCGGAGA TGTGTATAAGAGACAGG ATTGGTTTGCCGCTAGC 3';