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Methodenartikel

Primären Zellkulturen aus das retinale Pigmentepithel Maus

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DOI:

10.3791/56997

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16. März 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Wilmer Eye Institute, The Johns Hopkins University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine multifunktionale Epithel des Auges. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären Zellkulturen, abgeleitet von der murinen RPE zu etablieren.

Zusammenfassung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine stark polarisierten multifunktionale Epithel, das liegt zwischen der neuronale Netzhaut und der Aderhaut des Auges. Es ist ein einzelnes Blatt der pigmentierten Zellen, die hexagonal verpackt und durch tight Junctions verbunden sind. Die Hauptfunktionen des RPE beinhalten Absorption von Licht, Phagozytose der Schuppen Photorezeptor äußeren Segmente, räumliche Pufferung von Ionen, Transport von Nährstoffen, Ionen und Wasser sowie aktive Beteiligung in der visuellen Zyklus. Mit solchen wichtigen und vielfältigen Funktionen ist es von entscheidender Bedeutung für die Biologie des RPE-Zellen zu studieren. Eine Reihe von RPE Zelllinien gegründet wurden; Allerdings sind Zellen passagiert und verewigt, einige der morphologischen und physiologischen Eigenschaften der natürlichen RPE-Zellen verlieren schnell bekannt. Primärzellen eignen sich daher eher für das Studium der verschiedenen Aspekte der RPE-Zellen-Biologie und Funktion. Maus RPE Zellen Primärkultur ist sehr nützlich, um Forscher da Mausmodellen in biologische Studien weit verbreitet sind, jedoch sammeln RPE Zellen von Maus auch aufgrund ihrer geringen Größe sehr anspruchsvoll. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die primäre Maustaste RPE Zellkulturen Einrichtung umfasst Enukleation und Dissektion der Augen und der Isolation der RPE Blätter um die Zellen für die Kultivierung zu erzielen. Diese Methode ermöglicht effiziente Zelle. Die RPE Zellen aus zwei Mäuse erreichen Konfluenz auf einer 12 mm Polyester Membran einfügen vorinstalliert in Kultur Platte nach einer Woche der Kultur und der Anzeige einige der ursprünglichen Eigenschaften von bona-fide RPE Zellen wie sechseckige Form und Pigmentierung nach zwei Wochen der Kultur.

Einleitung

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine einlagige polarisierten epithelialen Zellen, die sich zwischen der neuronale Netzhaut und der Aderhaut des Auges befindet. Die Funktionalität der RPE-Zellen und die Integrität des RPE Monolayer sind entscheidend für Vision, weil die RPE spielt eine wichtige Rolle in mehreren Prozessen wie Erhaltung der äußeren Blut-Retina-Schranke, Transport von Wasser und Ionen zwischen der Netzhaut und die Aderhaut, Licht-Absorption, Schutz vor oxidativem Stress, Kontrolle der Retinoid Stoffwechsel und Phagozytose der äußeren Segmente der Photorezeptoren1,2. Die Lage des RPE auf der Rückseite des Auges, sowie seine Barrierefunktion aus vorbei aus dem Blut zu den Glaskörper systemisch verabreichten Medikamente zu verhindern erschweren es, die Komplexität des RPE Funktion in Vivozu untersuchen. So gibt es ein großes Bedürfnis für die Einrichtung von RPE Zellkulturen, die RPE-Zellen in einem flexiblen, kontrollierten Umgebung3,4zu studieren.

Es gibt eine Reihe von etablierten Zelllinien RPE, bietet eine einfache und bequeme Möglichkeit der Gewinnung und Lagerung der Zellen; passagiert Zellen haben jedoch einige Nachteile im Vergleich zu Primärzellen2,3,4. Erstens sind sie oft durch Veränderungen der Zellmorphologie gekennzeichnet. Keiner der existierenden Zelllinien fanden sich beispielsweise für eine zuverlässige Studie über die RPE-Barriere-Eigenschaften durch den Verlust der Zelle Polarität Phänotyp und teilweise verschwinden der tight Junctions4geeignet. Neben dem Verlust der Polarität und korrekte Zell-Zell-Verbindungen verlieren die RPE-Zell-Linien schnell ihre Pigmentierung aufgrund des Fehlens der wichtigsten Melanogenese Enzyme in den Erwachsenen RPE-5. Die Pigmentierung kann wiederhergestellt werden, aber die umfassende Analyse des Mechanismus der Re-Pigmentierung, also auch für eine Kombination von Transmissions-Elektronenmikroskopie, gen Ausdruck Analyse und chemische Tests bestätigen das Vorhandensein von Melanin hat nie Sie waren bereits im durchgeführten6. Eine weitere Einschränkung ist, dass die RPE-Zelllinien verlängerte Zelllebensdauer (manchmal - Unsterblichkeit) und unter bestimmten Bedingungen können selbst erneuernde multipotente Stammzellen, die aus dem Substrat und schwimmende Kolonien7, Form lösen verwandeln 8. diese Einschränkung macht es unmöglich, die Zelllinien für Transplantation3Experimente zu verwenden.

In Anbetracht der Nachteile der etablierten Zelllinien RPE vielleicht RPE Zellen Primärkulturen aus frischem Gewebe gewonnen mehr biologisch relevante RPE studieren Modellcharakter. Primäre RPE-Zellen werden nicht nur RPE-spezifische Funktionen zu studieren, wie z. B. Vitamin A-Stoffwechsel-9, Phagozytose der Photorezeptor Außensegmenten10 und Ionen-transport11, sondern auch grundlegende Zelle Biologie zu studieren, wie epithelialen Zelle Polarität2 , lysosomale Homöostase und Autophagie12,13.

In den letzten Jahren gab es eine Reihe von Publikationen über die Einrichtung von Primärkulturen RPE, zeigt ein wachsendes Interesse an diesem Bereich der Forschung3,14,15. Zahlreiche Protokolle für RPE-Zellen menschlichen und nichtmenschlichen RPE-Zellen wie Rinder und Schweine RPE-Zellen wurden veröffentlicht16,17,18,19. Es ist jedoch schwieriger zu handhaben Maus RPE-Zellen aufgrund ihrer viel kleineren Größe. Obwohl eine ganze Reihe von Publikationen Protokolle zu isolieren, RPE-Zellen von der Maus14,20,21beschrieben haben, gibt es noch viele Forscher, die kämpfen, um zu isolieren, RPE-Zellen ohne Kontamination der Aderhaut Zellen oder Zellen aus neuronale Netzhaut Schutt. Hier stellen wir das Protokoll für die Gründung der primäre Maustaste RPE Zellkultur, einschließlich des Erhalts der Augen von der Maus, Dissektion der Augen und der Isolation der RPE Blätter um die Zellen für die Kultivierung zu erzielen. Dieses video Protokoll wäre besonders nützlich für Forscher, die anfangen zu arbeiten mit Maus Primärkulturen RPE und brauchen Führung über die Präparation Techniken.

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Protokoll

Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Themen wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an Universität von Pittsburgh genehmigt

1. bereiten Sie Lösungen

  1. Bereiten Sie Wachstumsmedium von ergänzenden Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM), hoher Blutzucker mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin, 2,5 mM L-Glutamin und 1 X MEM nichtessentiellen Aminosäuren. Vorwärmen der Medien in 37 ° C Inkubator vor Gebrauch.
  2. Bereiten Sie 2 % (wt/Vol) Dispase II funktionierende Lösung:
    1. Bereiten Sie eine Stammlösung von 100 mg/mL Dispase II durch Auflösen von 30 mg von Dispase II in 300 µL HEPES gepufferten Kochsalzlösung (50 mM HEPES/KOH pH 7.4, 150 mM NaCl). Dieser Band ist für 3 bis 4 Mäuse, skaliert oder unten basierend auf der Anzahl von Mäusen für das Experiment werden kann). Dieser Bestand kann für mindestens 1 Woche bei 4 ° c gelagert werden
    2. Bereiten Sie die Arbeitslösung des 2 % Dispase durch Zugabe von 300 µL von 100 mg/mL Dispase II bestand bis 1,2 mL sterile DMEM, hoher Blutzucker und die Lösung durch einen 0,22 µm-Filter filtern. Dieser Schritt sollte in die laminare Strömung Kabinett unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Vorwärmen der vorbereiteten Dispase II in 37 ° C Inkubator vor Gebrauch.

2. erhalten die Maus-Augen

  1. Einschläfern Sie die Maus mit einer anerkannten Methode und legen Sie es auf einer saugfähigen Unterlage.
  2. Tragen von Handschuhen, legen Sie Daumen und Zeigefinger um das Auge herum und schieben Sie die Haut, Proptose des Augapfels.
  3. Legen Sie die Spitze des abgewinkelten Schere zwischen der Haut und den Augapfel und schneiden Sie vorsichtig aus dem Auge. Um Kontaminationen zu vermeiden, kurz Tauchen Sie das Auge in 70 % igem Ethanol.
  4. Sofort setzen Sie das Auge in der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einer Petrischale.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.4, das zweite Auge zu entfernen.

3. Auge Dissektion

  1. Entfernen Sie vorsichtig Bindegewebe aus dem Auge unter dem sezierenden Mikroskop. Dies kann entweder mit PBS-Puffer oder auf dem trockenen Petrischale erfolgen.
    1. Verwenden Sie näht Zange zu heben das Bindegewebe aus dem Augapfel und schneiden sie Sie mit einer Schere Vannas. Geschnitten Sie die Lederhaut nicht, weil es praktisch unmöglich, die intakten hinteren Augenmuscheln zu erhalten, wenn der Sklera geschnitten wird.
    2. Nach der Reinigung des Bindegewebes, halten die resultierende Augäpfel mit PBS-Puffer für den nächsten Schritt waschen.
      Hinweis: Die folgenden Schritte sollten in die laminare Strömung Kabinett unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
  2. Waschen Sie die Augen zweimal in vorgewärmten 37 ° C DMEM (hoher Blutzucker). Die Augäpfel in die vorgewärmte 37 ° C DMEM (hohe Glukose) mit Pinzette sorgfältig zu übertragen. Aspirieren Sie das Medium und Transfer Augäpfel, frisches Medium in ein neues Gericht.
  3. Aspirieren Sie DMEM (hohe Glukose) Medium und inkubieren Sie die Augen in die vorgewärmte 2 % (wt/Vol) Dispase II funktionierende Lösung für 45 min im Inkubator 37 ° C.
    Hinweis: In den folgenden Schritten legen und Augen oder Augenmuscheln in das Wachstumsmedium, die schützt des Gewebes und bieten ein gutes Medium für die Dissektion zu manipulieren.
  4. Entfernen Sie die Dispase II Lösung und waschen Sie die Augen zweimal in Wachstumsmedium, indem das alte Medium Absaugen und das neue vorgewärmte 37 ° C Wachstumsmedium (Abbildung 1a).
    Hinweis: Nach der Dissoziation von Dispase II, die Augäpfel weich werden.
  5. Halten Sie das Auge mit Zange und einen Einschnitt in die Ora Serrata jedes Auges mit Vannas Schere unter dem sezierenden Mikroskop in die laminare Strömung Schrank gelegt.
    1. Halten den Augapfel in der Lösung, vorsichtig entfernen der vorderen Hornhaut durch den Schnitt um die Ora Serrata Umfang erweitert und die vordere Hornhaut wegziehen, nachdem der Schnitt abgeschlossen wurde.
    2. Entfernen Sie die Linsenkapsel und damit verbundenen Iris pigmentiert Epithel durch leichtes Ziehen sie aus der Augenmuschel mit umgezahnten Zangen (Abbildung 1 b, 1 c).
  6. Inkubieren Sie die daraus resultierenden posterioren Augenmuscheln in das Wachstumsmedium für 20 min bei 37 ° C, Trennung der neuronale Netzhaut von RPE zu erleichtern.
  7. Schneiden Sie die hinteren Augenmuscheln in 4 Blütenblätter unter dem sezierenden Mikroskop platziert in die laminare Strömung Kabinett. Die Kürzungen sollten lang genug zu glätten die Augenmuschel, aber kurz genug, um die Blütenblätter verbunden (Abbildung 1-d) zu halten sein.
    1. Die Augenmuschel glätten und entfernen die neuronale Netzhaut sehr vorsichtig mit der Pinzette herausziehen halten die restlichen RPE-Aderhaut-Lederhaut-Komplex mit einem anderen Zangen (Abbildung 1e). Starten Sie ziehen an den Kanten und nicht von der Mitte.
  8. Übertragen Sie die geviertelten Gewebe in eine neue sterile Kulturschale mit vorgewärmten 37 ° C Wachstumsmedium gefüllt.

4. Isolierung der primären RPE-Zellen

  1. Holding ein Blütenblatt der geviertelten RPE-Aderhaut-Sklera Anlage mit super feine Pinzette, vorsichtig abziehen die intakte Blätter des RPE aus der zugrunde liegenden Basalmembran (Bruch Membran) mit einem mikrochirurgischen sichelförmigen Messer unter dem sezierenden Mikroskop in der Laminar-Flow Kabinett (Abb. 1f) gelegt.
    1. Übertragen Sie die RPE-Blätter in der neuen sterilen Kulturschale mit Wachstumsmedium mithilfe einer Mikropipette P200. Bei der Übertragung von RPE Blätter nass Pipettenspitzen mit Wachstumsmedium durch Pipettieren mehrmals zu verhindern, dass Gewebe innerhalb der Spitze festhalten. RPE werden deutlich unterscheidbar von der Aderhaut: RPE sieht mehr bräunlich, während Aderhaut dunkler ist und klebrig und flauschig sieht.
    2. Alternativ verwenden Sie, enzymatischen Verdauung und sanfte Dissoziation ohne Zange um die RPE aus der Aderhaut14lösen.
  2. Die RPE Blätter 2-3 Mal mit vorgewärmten 37 ° C zu waschen Wachstumsmedium in der sterilen Kulturschale. Nach jedem Waschen sammeln Sie sorgfältig die RPE-Blätter unter Vermeidung andere Gewebe wie Schutt der Netzhaut oder Aderhaut. Am Ende der letzten Wäsche sammeln Sie die RPE-Blätter mit einer Mikropipette P200 und legen Sie sie in einen neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
    Hinweis: Es gibt keine Notwendigkeit, die RPE Blätter Zentrifuge: sie werden Sediment durch die Schwerkraft innerhalb von 1 min.
  3. Entfernen Sie das zusätzliche Wachstum-Medium mit einer Mikropipette P200. Zellen im frischen vorgewärmten Wachstumsmedium Aufschwemmen und sanft genannte mit einer Mikropipette P200. Vermeidung von Blasenbildung. Eine einzelne Zelle Suspension ist ideal, aber auch vermeiden, zuviel Verreibung, ansonsten RPE-Zellen sind nicht in der Lage zu überleben. Wir empfehlen sehr sanft Verreibung für 40 - 50 Mal.

5. Kultivierung RPE-Zellen

  1. Die Zellen in einer Kultur-Platte-Platte.
    1. Downstream-Anwendungen der RPE Zellen benötigen Beibehaltung ihrer Polarität, Zellen Platte RPE von 2 Mäuse in einem 12 mm Polyester Membran einfügen vorinstalliert in Kultur 12-Well-Platten. Die Zellen in hoher Dichte Beschichtung ist erwünscht, denn in diesem Fall RPE-Zellen in der Lage, die ursprünglichen Eigenschaften, wie z. B. sechseckige Form und Pigmentierung zu halten.
  2. Nicht verschieben Sie die Platte zu oder ändern Sie das Wachstumsmedium für die ersten 72 h der Kultivierung. Ersetzen Sie nach 3 Tagen das alte Medium durch das frisch vorgewärmte Wachstumsmedium. Danach ändern Sie das Kulturmedium jeden zweiten Tag. Sobald RPE-Zellen confluency erhalten, reduzieren Sie die FBS im Wachstumsmedium um 2 %.
    Hinweis: Die Zellen können mit 0,25 % Trypsin gespalten werden. Jedoch nach der Trennung können die Zellen verlieren ihre sechseckige Form und Pigmentierung in den folgenden Passagen. Wir empfehlen nicht, die Zellen teilen, aber wenn es, durch die downstream-Anwendungen der Kultur erforderlich ist, beachte bitte, dass auf unbestimmte Zeit die primäre Zellen passagiert werden kann nicht: sie sind dafür bekannt, de-nach ca. 5-7 Passagen zu unterscheiden.

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Ergebnisse

Die Maus RPE Primärkultur 12 mm Polyester Membran einfügen erreicht 90-95 % Konfluenz nach 1 Woche in der Kultur von 2 Mäusen gegründet. Nach 2 Wochen der Kultur die Zellen erreicht 100 % Konfluenz und fing an, ein Mosaik aus sechseckigen, pigmentierte und Bi-kernhaltige Zellen bilden. Nach 3 Wochen der Kultur, die Zellen weiterhin die Form und Pigmentierung, bilden aber kam nach 4 Wochen ein Teil der Zellen hyperpigmentiert (Abbildung 2).

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Diskussion

Die vorgestellte ausführliche Protokoll ermöglicht zuverlässige Einrichtung des Maus RPE Primärkulturen, die Konfluenz nach 1 Woche zu erreichen und die Hauptmerkmale der RPE wie sechseckige Form und Pigmentierung nach 2 Wochen. Die gewonnenen RPE-Zellen für eine Anzahl von downstream-Anwendungen wie z. B. Vitamin A Stoffwechsel9, Phagozytose der Photorezeptor Außensegmenten10 und Ionen-Transport11, Epithelzelle Polarität2, ly...

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Offenlegungen

DS hat Forschungsförderung von F. Hoffmann-La Roche, Bayer HealthCare, Deutschland und der Schweiz erhalten. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen. Diese Arbeit stützt sich auf Forschung, um zu verhindern, dass Blindheit (uneingeschränkte Zuschüsse an die Wilmer Eye Institute und der University of Pittsburgh).  Diese Arbeit wird auch von Startkapital für DS von Augenheilkunde, University of Pittsburgh unterstützt.

Danksagungen

Diese Studie wurde teilweise durch die BrightFocus Foundation (für DS) finanziert.

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Materialien

Laminar-Flow-Schrank
Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
animals
2~3 Wochen alte Wildtyp-Mäuse
NameCompanyKatalognummerComments
reagents
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM),GIBCO11965092
Dispase IISigmaD4693
Fetales Rinderserum (FBS)SigmaF4135
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)GIBCO15140122
MEM Lösung nicht-essentielle Aminosäuren (100X)GIBCO11140050
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1X, pH 7,4GIBCO10010023
HEPESCellgro61-034
KOHSigma-Aldrich1310-58-3
NaClAmbionAM9759
L-Glutamin (200 mM)GIBCO25030-081
EthylalkoholFisher Scientific111000200
RPE65 AntikörperEin Geschenk von Dr. Michael Redmond
Fluorescein Phalloidin                                                                                                                     InvitrogenF432
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L), Alexa Mehl 568                                       InvitrogenA11011                       
ZiegenserumSigma-AldrichG9023
DAPIInvitrogenD1306
Paraformaldehyd (PFA)Polysciences, Inc00380
ZO-1 Polyklonaler AntikörperThermoFisher Scientific40-2200
NameCompanyKatalog Anzahl<strong>Kommentare
Instrumente und Ausrüstungen
BakerSterilGARD SG403A
Präpariermikroskop (Zoom-Stereomikroskop)NikonSMZ1500 CO2-Inkubator
mit HeißluftsterilisationBinderC150
ZentrifugeEppendorf5702
PetrischalenFisher Scientific0875712
12 mm Polyester-Membraneinsätze vorgeladen in 12-Well-Kulturplatten, Porengröße: 0,4 & Mikro; m, SterileCorning IncorporatedCOR-3460
Westcott Tenotomieschere, std-Klingen, scharfeSTEPHENS InstrumenteS7-1320
Castroviejo Nahtzange 0,12 mmStroz Ophthalmic InstrumentsE1796
Crescent geradesMesser Beaver-Visitec International373808
Dumont Pinzette #5, 11 cm, gerade, 0,1x0,06 mm Spitzen, DumostarWorld Precision Instruments500233
Vannas Schere, 8 cm, 45°; Winkel, StandardWorld Precision Instruments500260
Millex-GS Spritzenfiltereinheit, 0,22 & Mikro; mMilliporeSLGL0250S
Spritze, 5 mLBD309632
Inverses Labormikroskop  Leica DM IL LED  Leica 
PipetteGilson
Barrier und ungefilterte PipettenspitzenThermo Scientific

Referenzen

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