Methodenartikel

Zellmembran Reparatur Assays mit einem zwei-Photonen-Laser-Mikroskop

DOI:

10.3791/56999

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2. Januar 2018

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1Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, 2Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Zellmembran Verwundung über zwei-Photonen-Laser ist eine weit verbreitete Methode für die Bewertung der Membran Wiederverschließen Fähigkeit und kann auf mehrere Zelltypen angewendet werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für in-vitro- live-Aufnahmen von Membran Wiederverschließen in Dysferlinopathie Patientenzellen nach zwei-Photonen-Laser-Ablation.

Zusammenfassung

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Zahlreichen pathophysiologische Beleidigungen können Zellmembranen schädigen und Verbindung mit angeborenen Defekten in Zellmembran Reparatur oder Integrität, können zu Krankheit führen. Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die umgebenden Zellmembran Reparatur ist daher ein wichtiges Ziel für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für Erkrankungen, die mit dysfunktionalen Zellmembran Dynamik. Viele in Vitro und in Vivo Studien zum Ziel zu verstehen, Zellmembran Wiederverschließen Krankheit Kontexten nutzen zwei-Photonen-Laser-Ablation als Standard für die Bestimmung der funktionellen Ergebnisse nach experimentellen Behandlungen. In diesem Assay unterliegen Zellmembranen Verwundung mit einem zwei-Photonen-Laser, wodurch die Zellmembran zu Bruch und fluoreszierenden Farbstoff in die Zelle einzudringen. Die Intensität der Fluoreszenz in der Zelle kann dann überwacht werden, um die Fähigkeit der Zelle zu verschließen sich quantifizieren. Gibt es mehrere alternative Methoden für die Beurteilung der Zellmembran als Reaktion auf Verletzungen, als auch große Unterschiede in der zwei-Photonen-Laser Verwundung Ansatz selbst, daher würde ein einheitliches Modell der Zelle Verwundung nutzbringend zu verringern dienen der Unterschiede zwischen den beiden Methoden. In diesem Artikel beschreiben wir einen einfache zwei-Photonen-Laser Verwundung Protokoll für die Beurteilung der Zellmembran Reparatur in Vitro in beide gesund und Dysferlinopathie Patienten Fibroblasten, Zellen mit oder ohne ein in voller Länge Dysferlin-Plasmid transfiziert.

Einleitung

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Die Zellmembran der eukaryotischen Zellen besteht aus einer Doppelschicht Protein besetzte Phospholipide, die definiert der Intra-/extrazellulären Umgebung der Zelle und ist unerlässlich für die Aufrechterhaltung der zelluläre Homöostase und Zelle überleben. Zellmembran Verletzungen infolge mechanischer oder chemischer Beleidigungen sind an der Tagesordnung in verschiedenen Säugetier-Zelle Arten, einschließlich Skelett- und Herzmuskulatur, Magen und Lunge Zellen1,2,3,4. Neben Verletzungen konsequente tägliche physiologische Funktion können Z....

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Protokoll

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In dieser Studie verwendete menschlichen Fibroblastenzellen wurden mit Zustimmung der menschlichen Ethik-Kommission der Fakultät für Medizin und Zahnmedizin an der Universität von Alberta eingesetzt.

1. die Transfektion von Zellen mit durchgehender DYSF plasmid

  1. Kultur-Fibroblastenzellen in einem T225 Kolben mit 40 mL Wachstumsmedien - 36 mL Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM), 4 mL des fetalen bovine Serum (FBS) und 20 µL von Penicillin/Streptomycin (P/S) - in einem CO2 Inkubator bei 37 ° C.
    Hinweis: Zellen kultiviert, ca. 70-80 % Konfluenz soll und darf nicht vollständig konfluierende geworden.
  2. Um Zell....

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Ergebnisse

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Gesunde menschliche Fibroblasten, unbehandelten Dysferlinopathie Patienten Fibroblasten und Patienten Fibroblasten transfiziert mit einem Plasmid mit die Full-length Dysferlin-Sequenz ausgesetzt waren zwei-Photonen-Laser Verwundung Membran Wiederverschließen Fähigkeit zu bewerten in Echtzeit. Gesunde menschliche Fibroblastenzellen angezeigt niedrigen Niveau von FM 4-64 Fluoreszenz Aktivierung nach Laser Verwundung und unbehandelten Patienten Fibroblasten zeigte ein hohes Maß an relativen .......

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Diskussion

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Zwei-Photonen-Laser Verwundung der Zellmembran ist eine genaue und vielseitige Technik für die Beurteilung der Dynamik der Membran Wiederverschließen in Vitro. In diesem Artikel beschriebenen wir ein Protokoll für die Bestimmung der Zellmembran Wiederverschließen Fähigkeit in Dysferlinopathie Patientenzellen mit dem zwei-Photonen-Laser Verwundung Assay. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Dysferlinopathie Patienten Zellen Defekt in Zellmembran Wiederverschließen, das steht im Einklang mit Ergebnissen von anderen Fors.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von Universität von Alberta Fakultät für Medizin und Zahnmedizin, die Freunde von Garrett Cumming Stuhl Forschungsfonds, HM Toupin neurologische Forschung Stuhl Wissenschaftsfonds, muskulöse Dystrophie Kanada, Canada Foundation für Innovation (CFI) unterstützt, Alberta erweiterte Bildung und Technologie (AET), kanadische Institute der Gesundheitsforschung (CIHR), Jesse Reise - die Grundlage für gen und Zelltherapie, die Frauen und Kinder Health Research Institute (WCHRI) und Alberta Health Solutions (AIHS erneuert ).

Wir möchten Dr. Steven Laval danken für die Bereitstellung von uns mit dem Full-length Dysferlin-Plasmid. ....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher11320033
fötales RinderserumSigma-AldrichF1051
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Thermo Fisher15140122
Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrotThermo Fisher25300062
Dulbecco' s Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma-AldrichD8537
35 mm kollagenbeschichtete GlasbodenschalenMatTekP53GCOL-1,5-14-C
SerumentzugsmedienThermo Fisher31985070
TransfektionsreagenzThermoFisher 15338100
FM 4-64 FarbstoffInvitrogenT13320
Tyrode' s Salts SolutionSigma-AldrichT2397
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopCarl ZeissNA
Chamäleon Zwei-Photonen-LaserCoherentNA

Referenzen

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  1. Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).
  2. Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77

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Schlagwörter

MembranversiegelungDysferlinopathieFM4 64 FarbstoffFluoreszenzquantifizierungKonfokalmikroskopieFibroblastenzellenPlasmidtransfektionTyrode L sung

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