Summary
Мы описываем эволюции на основе сфероида, трехмерный в vitro модель, которая позволяет нам проверить текущий стандарт экспериментальной терапии схем для головы и шеи плоскоклеточный рак на клеточных линий, направленных на оценку терапии восприимчивость и сопротивления на первичной клетки от человеческих образцов в будущем.
Abstract
Текущие варианты лечения для продвинутых и рецидивирующий головы и шеи плоскоклеточный рак (HNSCC) заключить излучения и химио лучевой подходы с или без хирургического вмешательства. Хотя схемы химиотерапии на основе платины в настоящее время представляют золотой стандарт с точки зрения эффективности и даны в подавляющем большинстве случаев, новых схем химиотерапии, а именно появляются иммунотерапии. Однако трудно предсказать и остаются недостаточно понятны ответов и терапии сопротивление механизмы либо режим химиотерапии. На сегодняшний день известны широкие вариации химиотерапии и радиационной механизмов сопротивления. Это исследование описывает разработку стандартизированных, высокой пропускной способности в vitro пробирного оценить ответ HNSCC клеточной линии для различных схем терапии и, надеюсь, на первичной клетки от отдельных пациентов как инструмент будущего для персональной опухоли терапии. Assay предназначен для интеграции в стандартный алгоритм контроля качества для HNSCC пациентов в нашем центре третичной медицинской помощи; Однако это будет предметом будущих исследований. Техническая осуществимость выглядит многообещающим для начальных ячеек от биопсии опухоли от фактической пациентов. Затем образцы передаются в лабораторию. Биопсия механически отделены следуют ферментативного пищеварения. Клетки затем культивировали в ультра-низкой адгезии клеток культуры флаконов, способствующих воспроизводимость, стандартизированных и спонтанного формирования Трёхмерный, сфероид образной ячейки конгломератов. Сфероидов затем готовы быть подвержены химио лучевой протоколы и протоколы иммунотерапия при необходимости. Окончательный размер жизнеспособность и сфероида показатели восприимчивости терапии и поэтому может быть втянутыми в рассмотрение в будущем для того, чтобы оценить ответ вероятно терапии пациентов. Эта модель может быть ценным, экономически эффективным инструментом к персонализированной терапии рака головы и шеи.
Introduction
Голова и шея плоскоклеточный рак (HNSCC) является шестым наиболее распространенных рака во всем мире с ростом случаев инфицирования слизистой оболочки вируса папилломы человека (ВПЧ) инфекции связанные патогенеза, рядом с большинством случаев, вызванных чрезмерным никотина и алкоголя потребление 1,2. Хотя небольшие опухоли и неинвазивного этапов, как правило, хорошо поддается лечению с хирургическое иссечение, обычно в сочетании с шейки матки лимфодиссекции, лечение для расширенного этапа и рецидивирующий HNSCC остается сложным из-за вторжения агрессивным опухоль с Метастатические распространение и устойчивость к радиации и химиотерапии протоколы3,4,5,6,,78. Недавние исследования показывают высокую изменчивость клеточном фенотипу и суб характеристика циркулирующих и распространение раковых клеток только начался9,10. Ранее вера твердых, форма опухоли массы пришлось пересмотреть в свете последних исследований в прошлом лет11,12,13,14. Нынешние подходы для характеристики опухоли и выявление ключевых мутаций может определить несколько генов, которые, кажется, быть связаны с терапии сопротивление, но остаются дорогостоящих подход. Кроме того знание генотип не обязательно позволяют надежное прогнозирование фенотипа и его лечение реакции.
Там было несколько достижений в улучшении общей и безрецидивной выживаемости для расширенный этап и повторяющихся болезней. Никотин - а также связанные вирус карциномы текущие варианты лечения Помимо хирургии заключите агрессивной радиационной и химиотерапии на основе платины схемы. Там были последствия для различных ответов между ВПЧ отрицательных и положительных карцинома; Однако это еще не приведет к изменению в целом руководящие принципы терапии. Устойчивость к радиации и химиотерапии является широко распространенным явлением во всех стадиях опухоли и существует на основе платины химиотерапии также, как для целенаправленной терапии (анти-EGFR; рецептор эпидермального фактора роста) и недавно новые ингибирование контрольно-пропускного пункта15. Неэффективные лучевой и химиотерапии приходят высокой ценой значительных пациента заболеваемости с точки зрения дисфагии, мукозит, сухость во рту и риск снижения функции почек или сердца среди других. Прогнозирование терапии реакции предварительное решение концепции общей терапии для каждого отдельного пациента, как представляется, решающую цель, предотвращая концепции ненужных лечения, побочные эффекты и расходы.
Мы стремились создать модель для проверки конкретного пациента лечение восприимчивость к текущей стандартной химио излучения, которые могут быть интегрированы в регулярных и контролем качества онкологического лечения алгоритм с точки зрения технической стоя. Далеко целью было использовать модель без использования сильно изменены и возрасте клеточных линий, как плохо они представляют собой фактические человека опухолевых клеток без их изменчивости и неоднородности, как мы знаем теперь, при создании протокола было сделано в различных клеточных линий. Быть независимым только от коммерчески доступных клеточных линий, мы недавно успешно созданы промежуточные клетки линии, называется «Пика» от первичных клеток HNSCC от человека опухоли образцов с сохранение клеточных маркеров на его поверхности и ограниченные отрывки 16. это PiCa клеточной линии должны служить подготовка к разработке модели на дороге к позже после испытания с свежими человеческих раковых клеток с биопсий опухоли. Было показано, что клетки в трехмерной клеток культур по-разному реагируют и более в естественных условиях-как для отправления рака наркотиков, чем тех, кто растет в монослои17,18,19,20 ,21, главным образом благодаря сохранению мигрирующих и суб дифференциация свойств определенных ячеек подмножеств22,23,24. Здесь мы описываем протокол на основе сфероида, трехмерные модели из промежуточных клеточных линий и первичного человека плоскоклеточный рак ячейки и способы как интегрировать такую модель в лечение рака головы и шеи хирург, онколог ( Рисунок 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования, показано в этой рукописи, а именно использование образцов человека опухоли, защищены и в согласии с предыдущими решениями от медицины Университета Майнца/Университет Мюнхена медицинский центр по этике. Пациентов дали осознанного согласия согласно национальных правовых руководящих принципов, согласившись научного использования избыточного биологического материала, который был получен в ходе их лечения. Исследование проводилось во исполнение всех институциональных, национальные и международные руководящие принципы для благополучия человека.
1. Принимая биопсия опухоли головы и щеколда плоскоклеточный рак
- Выполнять общие (пропофолом и/или севофлуран, расслабляющий мышцы агент) или местные инфильтрат (2% ultracaine, адреналин) / поверхности (xylocaine) анестезии в операционной комнате или ЛОР кресло экспертизы. Визуализировать массы опухоли в устной полости, глотки, гортани, других частях верхнем тракта пищеварения и дыхания с стандартной операционной инструментов и, при необходимости, под микроскопом.
- Возьмите биопсии свежие опухоль от периферии раковые новообразования с тупым или режущие инструменты. Избегайте центр поражения результате обильные некроза в этой области. Поместите полученные ткани в стерильный контейнер с натрия хлорида изотонический раствор.
- После биопсии, гемостаз при необходимости выполните, например., с устройством биполярный или монополярная коагуляция, помимо использования сосудосуживающих веществ.
- Принесите биопсия опухоли, использоваться для экспериментов культуры клеток непосредственно в прилегающие Лаборатория тракта. Отправьте другой биопсий тумора pathologist как обычно, чтобы исключить рак.
- Убедитесь, что лаборант готова для обработки образца непосредственно.
2. обработка образца тумора
- Поместите образец опухоли на поверхность подходящим и стерильные и нарезать его тщательно с стерильным скальпель одноразовый как можно меньше.
Предупреждение: Убедитесь, что статус инфекционных и передаваемых через кровь заболеваний хорошо документированы и техник в внимание учреждений стандартные протоколы для предотвращения иглы stick или резки травмы с потенциально биологически опасных пациентов материала и протоколы следовать после возможной травмы. - После достаточного механического разделения основной ткани, положить ткань во флакон, содержащий коллагеназы I / II и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Сито через стрейнер клеток Сокол 70 мкм и мыть подвеска с Hanks сбалансированного солевого раствора (HBSS).
-
После успешного разъединения и последующие стирки место суспензии, содержащей 1-2 × 106 клеток в T75 колбы культуры клеток (75 см2) расти в суб confluency в 5% CO2 и температуре 37 ° C. Этот шаг может занять до 10 дней.
- Использовать специальные кератиноцитов питательной среды, состоящей из следующих: 125 мл Дульбекко модифицированная орлы среднего (DMEM), 250 мл кератиноцитов дополняет среды (дополняться среднего, состоящий из 500 мл среды SF кератиноцитов, 15 мг гипофиза крупного рогатого скота экстракт (BPE), 2,5 мл пенициллина/стрептомицина, 150 нг рекомбинантного человеческого эпителиального фактора роста (EGF), 516 мкл 300 мм CaCl2, запасов смеси должен быть подготовлен заранее), 125 мл F12 питательные смеси, 10 мг BPE (0,75 мл), 75 нг рекомбинантного человеческого EGF (2 мкл) , 3,75 мл 200 мм L-аланил-L-глютамин-дипептид (таблица материалов).
3. Заполнение ячеек в ультра-низкой адгезии клеток культуры пластин
- Подтверждают рост опухолевых клеток под микроскопом. Подсчитать ячейки в культуре (первичный или клеточные культуры) и семян 5000 первичной опухоли клетки или клетки 1,000-2,000 промежуточных клеточной линии / линия другие клетки в 200-300 мкл СМИ (шаг 3.2.) в ультра-низким сцеплением пластины с вогнутой, круглые днища (96-луночных).
-
Культура клетки на 5% CO2 при 37 ° C и в равных частях DMEM и сократимость эпителиальных клеток среднего (BEGM), плода бычьим сывороточным 10%, 1% пенициллина/стрептомицина, пируват натрия 1%, 1% несущественные аминокислот, 1% L-глютамин (шаг 2.3.). Если используются клеточные линии, средства массовой информации на основе DMEM является достаточным.
- Выполните изменения средств массовой информации каждый день. Обратите внимание не аспирационная сфероида с пипеткой во время изменения средств массовой информации. Культура сфероидов до уровня роста, как descibed в 3.3 достигается (примерно 7-10 дней).
- Подтвердите спонтанное сфероида формирования под микроскопом, ищет Трёхмерный, сфероид образной ячейки конгломератов. Исключите скважин с нерегулярными или нескольким сфероида формирования от дальнейшего расследования.
Примечание: Сфероидов должны быть видны невооруженным глазом, тоже, содействия дальнейшей обработки и средства массовой информации изменения, как описано ниже.
4. выявление сфероидов смешанных стандартных или экспериментальных опухоли терапии
- Выбор режима желаемого терапии. Дизайн достаточно большими управления группы, которые позволяют сравнения лечения для без лечения сфероидов или получения только частичное терапии лечения, напримерсфероидов. излучение в одиночку. Размер группы элементов управления зависит от конструкции экспериментальной группы и не может быть определена повсеместно.
- Обмен средств массовой информации к средствам массовой информации с добавками, смысл СМИ с химиотерапевтические или моноклональные антитела в желаемой концентрации. Добавление цисплатина в концентрациях мкм 2,5/5/10 или 5-fluoruracil (5-фу) на 30 мкм.
Примечание: Для высокой пропускной способности экспериментов или большой группы размеров/большое количество групп, один можно использовать автоматического дозирования робот, как мы далее устанавливают в экспериментах. - Кроме того излучают пластины культуры клеток с сфероидов на 2 гр, с помощью подходящего излучения.
Предупреждение: Уважение института протоколы относительно предотвращения вредного облучения работников. Работать только с назначенными и обученных техников по руководящие принципы радиационной защиты. При желании добавьте химиотерапевтические как описано до 4.2. После этого. - Инкубируйте клетки для 24 ч в условиях ранее описанных культуры (37 ° C, шаг 3.2).
- После инкубации продолжить культуры клеток для по крайней мере 6 дней с изменениями средств массовой информации каждый день.
5. Оценка сфероида размер и масштабы для считывания Assay пролиферации
- Измерьте размер сфероида по площади после цифровой фото документации на 6 день (10 день, день 16) с помощью графического программного обеспечения (параметр 1).
- После центрифугирования в 520 g x 2,5 мин пластины удалите супернатант. Мыть ячейки с достаточным количеством 1 x PBS и центрифуги, пластину снова как описано, а затем удалить супернатант (PBS).
- Добавьте 100 мкл ферментативные клеток отряд решения каждого флакона позволяют сфероидов распустить. Инкубировать пластину для 8 минут при 37 ° C.
- Проверка успешного растворения сфероида под микроскопом. 100 мкл DMEM. Центрифуга пластину на 520 x g 2,5 мин удалить супернатант и приостановить клетки в 100 мкл DMEM.
- Выполните assay коммерчески доступных колориметрические распространения, в примере WST-8 assay на каждом флаконе согласно инструкции производителя25. Зачитал assay в читалку иммуноферментного анализа (ИФА) (параметр 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы были в состоянии сформировать можно воспроизвести сфероидов от одноклеточного суспензий, сначала из различных клеточных линий, включая проприетарные PiCa клеток линии, позднее от первичных человеческих раковых клеток, производным от свежих опухоли биопсий, как описано в Хагеманн et al . 26. Мы оценивали два установленных методов для генерации сфероида; две так называемые висит падение (HD) метод и метод ультра-низкой адгезией (Ула), причем последний один более эффективным и безопасным. Мы смогли выделить преимущества метода ULA, по сравнению с HD, включая быстрый рост сфероида, меньше проблем с пластиной, обработка, последовавшей гибелью сфероидов с тяжелыми вибрации и более воспроизводимые сфероида роста с точки зрения единообразия ( Рисунок 2). Появление нескольких сфероидов на флакон был более распространенным в методе HD. Мы проверили для более четкой характеризации сфероида морфологии. Рисунок 3 показывает Иммунохимия пятная для Ki67, маркер распространения, сфероиде от пика клеток. Как описано в литературе, сфероидов состоят из менее пролиферирующих ядро с пролиферирующих наружный слой, имитируя различные регионы распространения твердых HNSCC в организме человека. В vitro как в естественных условиях, это якобы вызвано градиент питательных веществ и кислорода, поставляемых СМИ культуры клеток, вызывая снижение от периферии к центру опухоли.
Затем мы пытались показать, что assay способен обнаружить изменения в размер сфероида после инкубации с химиотерапевтических препаратов или воздействия ионизирующего излучения, здесь, представляя два общих схем стандартного лечения для HNSCC. Прежде чем возможно интеграции assay в рутинные предварительной обработки, проверки чувствительности assay будет предварительным условием. Два параметра были доступны как конечные точки анализа: размер сфероида (область; параметр 1 из шага 5.1.) и распространения (см. параметр 2 шага 5.4), будучи суррогатной маркера для жизнеспособности клеток и потенциал роста после терапии. Результаты исследований лечения с общей химиотерапии и химио лучевой протоколы показаны на рисунке 4. Экспозиции и инкубации сфероидов с цисплатином или 5-Фу привело к значительному снижению скорости роста с течением времени, по сравнению с необработанными контрольной группе (p< 0,001). Излучения с 2Gy был в состоянии уменьшить скорость роста в значительной степени (p< 0.01). Assay выживаемости (WST-8) смогла обнаружить дополнительные значительные значение химио-излучения с цисплатином, по сравнению с только излучения (p = 0,017), ранее незамеченными разница в оценке размера сфероида. Это подчеркивает ее важность для assay в целом, увеличения ее чувствительность к небольшие изменения терапии реакции.
Рисунок 1: концепция модели на пути к будущей персонализированной терапии. У больных с любой фон слизистой ВПЧ-инфекции и/или истории табака и злоупотребления алкоголем представить наш центр обслуживания третичного направления для подозреваемых диагностики рака головы и шеи. Биопсия слизистой подозрительных районов или макроскопические опухолевые массы взяты под наркозом для обеспечения диагностики. Кроме того мы принимаем биопсий опухоли для создания трехмерных сфероид образный клеточных культур в лаборатории. После достаточного роста первичной ячейки на основе сфероидов мы выставляем их текущего стандарта или экспериментальных режима лечения для проверки отдельных терапии реакции. Дальнейший анализ генетических и молекулярных вариации могут быть добавлены после анализа результатов терапии. Терапии результаты в пробирке может втягиваться в рассмотрение процесса планирования концепции терапии для пациента. Эта цифра перепечатана из Хагеманн, J. et al. 26, с разрешения авторов и журнал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: всех клеточных линий может генерировать надежный сфероидов; различия в размерах и времени считывания в соответствии с рис. 1. В предварительных экспериментов Главные ячейки не формируют воспроизводимые сфероидов в HD но Ула-плит (внизу слева). Дальнейшие исследования должны проводиться для оценки характеристик роста сфероида от первичных элементов. Количество клеток на право является начальное количество клеток, положить во флаконе сформировать сфероида. Эта цифра перепечатана из Хагеманн, J. et al. 26, с разрешения авторов и журнал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Ki67 Иммунохимия окрашивание ломтиком сфероида (PiCa). На периферии культуры показывает гораздо более высокие показатели распространения чем Центральной клетки, подражая питательных распределения твердых слизистых опухолей, которые часто показывают некротические ядер. Эта цифра перепечатана из Хагеманн, J. et al. 26, с разрешения авторов и журнал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: исследования терапии. (A) клетки пика культивировались сформировать сфероидов (n = 12 в группе) в Ула-плит. Клетки были стимулировали согласно протоколу с либо PBS, как контроль, цисплатина на 5 мкм или 5-Фу на 30 мкм. размеры сфероидов были определены на день 6, 10 и 16 согласно стандартных протоколов. Цисплатин и 5-Фу лечения привело к значительному уменьшению размера (p-внизу слева в разделе (B) одинаковые экспериментальный дизайн как (A) приведены значения (n = 12), но с дополнительным излучения 2Gy. (C) сюжет показывает мин макс. По словам p-значений, указанных в подпункте C, предыдущего облучения с 2Gy привели к значительным снижением сфероида размер в группе управления, имитируя лучевой терапии и показаны излучения чувствительность клеток PiCa. Излучения в комбинации с цисплатином лечение не привело к дальнейшей значительное уменьшение размера сфероида (p> 0,05). Диаграмма показывает мин Макс. (C) рассчитывается p-значения от 2-способ анализа ANOVA от пробирного эксперименты A и B. WST8 (D) , выполняется на день 16 в качестве альтернативы для контурной (уголок) анализа сфероидов. WST8 анализы были в состоянии обнаружить значительное снижение в живых клетках после химио излучения (2Gy излучения и цисплатин), по сравнению с цисплатином только (p = 0,017), следовательно показаны преимущества объединения планиметрических анализ и WST8 Колориметрические пробирного во время считывания assay. Диаграмма показывает мин макс. Эта цифра перепечатана из Хагеманн, J. et al. 26, с разрешения авторов и журнал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы смогли установить протокол для создания воспроизводимых сфероидов из клеточных суспензий, для обеих линий клетки и в предварительных экспериментов, клетки первичной опухоли человека. Мы сначала оценить два ранее описанных методов и определили Ула метод, где используются культуры пластин с ультра-низким уровнем сцепления поверхности, чтобы быть безопаснее и надежнее для создания единого трехмерного сфероидов. Объединив две отдельные методы для пробирного считывания (размер/области и клеток жизнеспособности), этот смешанных assay достаточно чувствительным, чтобы выявить небольшие различия между группами. Это первый шаг к доказательство технической осуществимости для более поздних интеграции assay в клинической путь в нашем центре третичной медицинской помощи. В будущем она может использоваться для (i) оценки индивидуального тумора восприимчивость к общим первого или второго и третьего эшелона терапии протоколов (химио реагенты, радиации) и экспериментальной терапии протоколы, (ii) дальнейшее характеризуют опухолевых клеток от свежих образцов и соотнести молекулярной поверхности или цитоплазматическая шаблонов для терапии реакции. Сфероидов от образцов из разных опухоли локализации, например, первичный и лимфатических узлов метастазы, можно вообразить.
В здании протокола и метода мы использовали различные известные клеточных линий, несколько, хорошо известна на протяжении десятилетий. Просто возраст клеточных линий вызывает сомнения их связи и сопоставимости для текущих фактических человека опухолевых клеток, якобы потеряв несколько свойств и hallmark молекулярных маркеров. Результаты экспериментов в vitro были трудно воспроизвести в человека или в естественных условиях испытания27. Поэтому мы сосредоточились на линии клетки, недавно созданный из клеток человека первичной опухоли в нашем объекте, который является хорошо характеризуется16. С этой линии клетки пика мы смогли провести лечение эксперименты в большем масштабе и подтверждены текущие ожидания терапии. Это поддерживает теорию, что клетки пика отражают фактические человека опухоли поведение лучше, чем другие, более возрасте и пассированный клеточных линий, которые прошли многочисленные проходы. Клетки, которые могут пройти-физиологические выделения за счет долгосрочных в vitro условий может исказить химио лучевой чувствительность. В недавние эксперименты мы подтвердили целесообразность с начальной ячейки в отношении формирования надежной сфероида; Однако дальнейшие и более крупные эксперименты должны быть выполнены прежде чем он сможет осуществить пробу в повседневной клинической практике.
Предполагается, что сфероидов и трехмерной клеточной культуры в целом реагирует по-другому по сравнению с обычными 2D-культура при воздействии излучения 28или химиотерапевтических препаратов. Архитектура сфероидов приводит к градиента кислорода и питания доставки от наружной поверхности ядра, и недавние исследования показали, что также доставки наркотиков в различных частях трехмерной клеток кластера не является единообразной29. Кроме того клетки в культуре сфероида, как представляется, сохранения некоторых картин выражения гена, которые связаны с лекарственной устойчивостью в животных моделей 30. Мы предлагаем, что также so-called радиационной стойкости, функция, которая была связана с раком головы и шеи в многочисленных больных, является результатом взаимодействия ячеек и собственный микросреды, ведущих к вариации в снабжение кислородом и метаболической активности. Это явление может быть передразнил в сфероидов благодаря увеличению в vivo функциональности. В заключение использование первичных элементов и поколения сфероидов может позволить нам для сохранения столько как возможные характеристики в естественных условиях роста опухоли в сочетании с экономически эффективных assay для изучения индивидуальной терапии реакции.
Конечно Существуют ограничения подхода. На данный момент неизвестно, как клетки из различных отдельных пациентов будет выполнять в assay, подвергаясь лечение опухоли, и как интеллектуальный assay плане корреляцию с более поздних результатов терапии. Чрезмерная исследования необходимы для просто сравнить производительность в vitro против клинического течения. Среди других, а именно два фактора способствуют этой неопределенности: опухоль неоднородность и отсутствие культуры совместно с стромы и иммунных клеток. Неоднородность опухоли – явление не совсем понятны и существует между различными подсайтов первичной, а также первичных и метастатических локализации12. Поскольку недавние исследования, существует третий сайт где очень различны и специализированных опухолевые клетки могут существовать и преобладают в нишах: состоянии дом циркулирующей крови и костного мозга и распространение опухоли клетки9,10. Отсутствие других типов клеток как стромальные клетки и Т-клетки (в качестве представителя для иммунной системы) в культуре клеток не ограничивается assay, но действительный недостаток большинства анализов в пробирке , изучение восприимчивости терапии опухолей. В свете недавних утверждений наркотиков и текущих исследований, которые влияют на Т-клеточный ответ должны проводиться будущие эксперименты для обнаружения наркотиков в сочетании различных анализов и методов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Этот проект финансировался Грант из университета Мюнхена (FöFoLe проекта no.: 789-781).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) | Biochrom, Berlin, Germany | F 0425 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies, Paisley, UK | 10500-064 | |
| penicillin/streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2212 | |
| sodium pyruvate | Biochrom, Berlin, Germany | L0473 | |
| non-essential amino acids | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| L-Glutamine | Biochrom, Berlin, Germany | K0293 | |
| Liberase | Roche Life Sciences, Basel, Switzerland | 5401127001 | |
| GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS 06-001 | |
| GravityTRAP plate | InSphero, Schlieren, Switzerland | PB-CS-01-001 | |
| Ultra-low attachment (ULA) culture plates | Corning, Corning, NY, USA | 4520 | |
| airway epithelial cell growth medium | Promocell, Heidelberg, Germany | C-21060 | |
| amphotericin B | Biochrom, Berlin, Germany | A 2612 | |
| airway epithelial cell growth medium supplement mix | Promocell, Heidelberg, Germany | C39165 | |
| WST-8 test | Promocell, Heidelberg, Germany | PC PK-CA705-CK04 | |
| Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL | Invitrogen | #17005-034 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg | Invitrogen | #37000015 | |
| Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg | Invitrogen | #37000015 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | #21068-028 | |
| Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin | Invitrogen | #15140-122 | |
| F12 Nutrient Mix | Invitrogen | #21765-029 | |
| Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl) | Invitrogen | #35050087 | |
| HBSS (Ca, Mg) | Life Technologies | #14025-092 | (no phenol red) |
| 1x TrypLE Expres Enzyme | Invitrogen | #12604-013 | (no phenol red) |
| Accutase (enzymatic cell detachment solution) | Innovative cell technologies | Cat# AT104 | |
| 70 µm Falcon cell strainer | BD Biosciences, USA | #352350 |
References
- Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. Profiling early head and neck cancer. Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).
- Jerjes, W., et al. The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication. Head Neck Oncol. 4, 6 (2012).
- Chen, H. H. W., Kuo, M. T. Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges. Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).
- Boeckx, C., et al. Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance. Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).
- Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab. Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).
- Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).
- Shirai, K., et al. Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer. Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).
- Theile, D., et al. Evaluation of drug transporters' significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma. Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).
- Slade, M. J., et al. Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment. Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).
- Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up. Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).
- Ledgerwood, L. G., et al. The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site. Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).
- Loyo, M., et al. Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer. Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).
- Morris, L. G., et al. The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform. JAMA Oncol. , (2016).
- Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential. Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).
- Mack, B., et al. Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens. PLoS One. 8 (1), e55540 (2013).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Cancer Genome Atlas, N. Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas. Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).
- Duarte, S., et al. Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect. Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).
- Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers. Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).
- Cossu, F., et al. Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic. PLoS ONE. 7 (11), e49527 (2012).
- Hagemann, J., et al. Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer. Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).
- Worp, H. B., et al. Can animal models of disease reliably inform human studies? PLoS Med. 7 (3), e1000245 (2010).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).
- Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95 (2013).
