Methodenartikel

Genetische Technik der primären Maus-Darm-Organoide mit magnetischen Nanopartikel-Transduktion virale Vektoren für gefrorene Schnitte

DOI:

10.3791/57040

⸱

10. Mai 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Natural Sciences, School of Arts & Sciences, Lebanese American University, 3Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben Schritt-für-Schritt-Anleitungen zu: 1) effiziente Technische Darmorganoide mit magnetischen Nanopartikeln für lenti- oder retrovirale Transduktion, und, 2) erzeugen gefrorene Abschnitte aus technischen Organoiden. Dieser Ansatz bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Genexpression in Organoiden effizient zu verändern, um nachgelagerte Effekte zu untersuchen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Darmorganoidkulturen bieten eine einzigartige Gelegenheit, Darmstammzell- und Kryptobiologie in vitro zu untersuchen, obwohl effiziente Ansätze zur Manipulation der Genexpression in Organoiden in dieser Arena nur begrenzte Fortschritte gemacht haben. Während die CRISPR/Cas9-Technologie eine präzise Genombearbeitung von Zellen für die Organoiderzeugung ermöglicht, erfordert diese Strategie eine umfassende Auswahl und Einsiebung durch Sequenzanalyse, was sowohl zeitaufwändig als auch kostspielig ist. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur effizienten viralen Transduktion von Darmorganoiden zur Verfügung. Dieser Ansatz ist schnell und hocheffizient, wodurch der Zeit- und Kostenaufwand für die CRISPR/Cas9-Technologie verringert wird. Wir präsentieren auch ein Protokoll zur Erzeugung gefrorener Abschnitte aus intakten Organoidkulturen zur weiteren Analyse mit immunhistochemischer oder immunfluoreszierender Färbung, die zur Bestätigung der Genexpression oder Silencing verwendet werden kann. Nach erfolgreicher Transduktion viraler Vektoren zur Genexpression oder Silencing können Darmstammzell- und Kryptofunktionen schnell beurteilt werden. Obwohl die meisten Organoidstudien In-vitro-Assays verwenden, können Organoide auch an Mäuse für in vivo-Funktionsanalysen geliefert werden. Darüber hinaus sind unsere Ansätze vorteilhaft für die Vorhersage therapeutischer Reaktionen auf Medikamente, da derzeit verfügbare Therapien in der Regel durch Modulation der Genexpression oder Proteinfunktion funktionieren, anstatt das Genom zu verändern.

Einleitung

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Die Fähigkeit, Maus- oder menschliche Kryptozellen als dreidimensionale (3D) Organoide aus dem Dünndarm oder Dickdarm über längere Zeiträume zu kultitogen, lieferte einen großen Durchbruch, da diese Kulturen in vivo definierende Merkmale des Darmepithels aufweisen. 1 , 2 , 3. Organoide, die aus primären Krypten abgeleitet sind, sind in der Lage, sich selbst zu erneuern und selbst zu organisationen, und weisen zelluläre Funktionen auf, die ihren Ursprungsgeweben ähneln. Tatsächlich rekapitulieren Organoide nicht nur die strukturelle Organisation von Krypten in vivo, sondern auch viele molekulare Merkmale, wodurch nützliche Werkzeuge zur Untersuchung normaler Biologie und Krankheitszustände zur Verfügung stehen. Zur Veranschaulichung, Organoid-Studien haben neue molekulare Wege in der Geweberegeneration beteiligt 1,2,3,4,5 sowie Medikamente, die die Funktion verbessern könnte in pathologischen Einstellungen6,7.

Die Untersuchung von Darmstammzellen ist von besonderem Interesse, da die Darmschleimhaut zu den höchst regenerativen Säugetiergeweben gehört und sich alle 3-5 Tage erneuert, um den Organismus vor Bakterien, Toxinen und anderen Krankheitserregern innerhalb der Darmlumen. Darmstammzellen (ISCs) sind für diese bemerkenswerte Regenerationsfähigkeit verantwortlich und bieten somit ein einzigartiges Paradigma für die Untersuchung der adulten Stammzellfunktion1,2. Lineage-Tracing-Experimente an Mäusen zeigten, dass isolierte Lgr5-positive Stammzellen kultiviert werden können, um 3D-Organoide oder "Mini-Guts" in vitro zu erzeugen, wo sie ihre In-vivo-Pendants genau spiegeln. Organoide Kulturen können auch aus Darmkrypta-Zellisolaten abgeleitet werden, die aus Vorläufern, ISCs und Paneth-Zellen bestehen, von denen letztere die epitheliale Nischenzellen in vivo bilden. Tatsächlich hat sich die organoide Kultur aus primären Darm-Kryptozellen zu einer relativ routinemäßigen Technik entwickelt, die in den meisten Laboratorien mit weit verbreiteten Reagenzien einfach umzusetzen ist. Dieses Modell ist auch für die quantitative Analyse der Genexpression durch RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und Proteine durch Massenspektrometrie, Immunhistochemie oder immunfluoreszierende Färbung2,4,8. Darüber hinaus kann die funktionelle Genetik mit Gain-of-Function (Genüberexpression oder Expression eines aktivierenden mutierten Gens) oder Funktionsverlust (Gen-Silencing oder Expression eines Funktionsverlustmutanten) untersucht werden2.

Wichtig ist, dass niedrige Effizienz und hohe Toxizität von Standard-Plasmid-DNA oder viralen Transduktionsprotokollen mit Polybren eine große Hürde auf dem Gebiet bleiben. Obwohl die CRISPR/Cas9-Technologie eine präzise Genombearbeitung ermöglicht, erfordert dieser Ansatz eine zeitaufwändige Auswahl, gefolgt von der Sequenzvalidierung9. Hier stellen wir ein virales Transduktionsprotokoll für primäre Darmorganoide vor, das die Abgabe viraler Partikel durch Konjugation an magnetische Nanopartikel und die Anwendung eines Magnetfeldes optimiert. Wichtige Änderungen an früheren Protokollen4,5,10,11,12,13 und Empfehlungen zur Effizienzsteigerung werden bereitgestellt. Wir beschreiben auch einen Ansatz zur Erzeugung gefrorener Abschnitte aus intakten Organoiden, die in 3D-Matrigel kultiviert sind (daher als Kellermembranmatrix oder -matrix bezeichnet) für die weitere Analyse mit Immunhistochemie oder immunfluoreszierender Färbung.

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Protokoll

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Dieses Protokoll wurde vom Johns Hopkins Medical Institutions Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Dieses Protokoll wird von den zuvor veröffentlichten Methoden10,11,12,13geändert.

1. Herstellung von Reagenzien

  1. Frisches 293T Medium mehrere Stunden im Voraus vorbereiten und vor Gebrauch mindestens 10 min warm auf 37 °C im Wasserbad erwärmen (Tabelle 1).
  2. Bereiten Sie Plasmid-DNA2,13,14 für virale Verpackungen vor. (Tabelle 2).
  3. Erwerben Sie alle anderen erforderlichen Materialien (Materialtabelle).

2. Lentivirus oder Retrovirus Partikelproduktion

  1. Menschliche Embryoniere (HEK) 293T Zellsaat (Tag 1)
    1. Bereiten Sie eine 150 mm Kulturschale vor, indem Sie sie mit 50 g/ml Poly-D-Lysin in Phosphatgepufferter Saline (PBS; 10 ml/Schale) für 1 h bei Raumtemperatur (RT) beschichten.
    2. Entfernen Sie die Phosphatgepufferte Saline (PBS)/Poly-D-Lysin und waschen Sie die beschichtete Schale zweimal mit 5 ml PBS.
    3. Samen 293T-Zellen (8-u201210 x 106) in 293T medium (Tabelle 1) bis zu einem Gesamtvolumen von 15 ml.
    4. Kultur 293T Zellen über Nacht in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5%CO2).
  2. HEK 293T Zelltransfektion (Tag 2)
    1. Transfektion durchführen, sobald Zellen 70-80% Zusammenfluss erreicht haben (in der Regel etwa 24 h nach der Aussaat 8-u201210 x 106 Zellen).
    2. Vorbereiten sie Transfektionsmischung mit einem effizienten Ansatz wie einer kommerziellen kationischen Liposomenformulierung (Tabellen 1-u20122, Tabelle der Materialien)2.
      1. Verdünntes Lentivirus-DNA-Konstrukte12 (insgesamt 24 g Plasmid-DNA, Tabelle 2) in 1,2 ml Transfektionsmedium und inkubieren für 5 min bei RT in 1,5 ml-Röhrchen (Materialtabelle).
      2. Verdünnung des Transfektionsregenten (36 l) in 1,2 ml Transfektionsmedium (Materialtabelle) und in 5-ml-Rohren für 5 min nach den Anweisungen des Herstellers inkubieren.
      3. Fügen Sie das Lentivirus-Reagenz (Schritt 2.2.2.1) in das Transfektionsreagenz (Schritt 2.2.2.2) und mischen Sie vorsichtig durch langsames Pipetieren nach oben und unten mit einer 5 ml Pipette.
      4. Inkubieren Sie die Mischung für 20 min bei RT.
    3. 293T-Zellen mit 5 ml Transfektionsmedium vorsichtig waschen und durch 10 ml Transfektionsmedium ersetzen.
    4. Fügen Sie die DNA-Lipid-Komplexe (ab Schritt 2.2.2.3) tropfenweise zum Medium von 293T-Zellen hinzu und mischen Sie die Medien in den Kulturgerichten sorgfältig, indem Sie sich in horizontale und vertikale Richtungen bewegen, um eine gleichmäßige Verteilung der DNA-Lipid-Komplexe in jeder Schale zu gewährleisten.
    5. Inkubieren Sie für 6 h in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5%CO2).
    6. Ersetzen Sie nach der Inkubation das Medium durch 20 ml frisches Virussammelmedium (Tabelle 1).
  3. Virussammlung (Tage 3-20125)
    1. Virusmedien in 50 ml-Röhrchen sammeln und zur weiteren Konzentration in einem 4 °C-Kühlschrank aufbewahren.
    2. Ersetzen Sie 20 ml frisches Virus sammelmedium alle 24 h und Kultur über Nacht (ca. 24 h). Wiederholen Sie die Mediensammlung in den nächsten 2 Tagen (Tage 4-20125).
    3. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen des nach Tag 5 gesammelten Mediums 60 ml (20 ml/Tag x 3 Tage) beträgt.
  4. Viruskonzentration (Tag 5)
    1. Zentrifugieren Sie die gesammelten Medien (60 ml) für 5 min bei 400 x g. Dann passieren Sie den Überstand durch einen Filter (0,45 m Poren), um zelluläre Ablagerungen zu entfernen.
  5. Konzentrieren Sie das Virus, indem Sie 15 ml gefilterte Virusmedien in eine Zentrifugalfiltereinheit (Materialtabelle) einfügen. Zentrifuge bei 2.500 x g für 15 min bei 4 °C. Da das Virus diesen Filter nicht passieren kann, wird es in der oberen Kammer des Filters konzentriert.
    1. Aspirieren Sie den Durchfluss aus dem Rohr (untere Kammer) und fügen Sie weitere 15 ml des verbleibenden viralen Sammelmedienüberstandes zur gleichen Zentrifugalfiltereinheit hinzu. Zentrifuge wie oben (2.500 x g für 15 min bei 4 °C), um zusätzliche Siviren aus dem Überstand zu konzentrieren.
    2. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem gleichen Filter für 60 ml Medien von einer einzigen transduced Platte, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist (ca. 100-fach).
      Hinweis: In der Regel konzentrieren wir 60 ml Virussammlungsmedien auf 600 l.
    3. Entfernen Sie das konzentrierte Virus aus der oberen Kammer des Filters mit einer 1 ml Pipette, dann aliquot und lagern Sie in 1,5 ml Rohre (50,u201260 l/Rohr) bei -80 °C für die spätere Verwendung. Konzentrierte Partikel für bis zu 6 bis 201212 Monate lagern.

3. Isolieren von Krypten

  1. Euthanisieren Sie Mäuse, die CO2 gemäß den lokalen IACUC-Richtlinien verwenden.
  2. Legen Sie das eingeschläferte Tier auf den Rücken und waschen Sie den Bauch, indem Sie mit 70% Ethanol besprühen.
  3. Führen Sie einen Längsmittelschnitt vom Brustbein bis zur Leistengegend durch, zuerst die Haut und dann das Unterhautgewebe einschneiden.
  4. Entfernen Sie den Dünndarm aus dem Magen zum Cecum.
  5. Identifizieren Sie Regionen von Interesse innerhalb des Dünndarms; Krypten können aus dem Zwölffingerdarm, Jejunum und Ileum isoliert werden.
  6. Mit einer 10 ml Spritze den isolierten Dünndarm mit einem Krypta-Dissoziationspuffer (vorgekühlte PBS mit 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1% Penicillin/Streptomycin (keine Ca2+ und Mg2+)) in einer 10 cm Gewebekulturschale (Tabelle) 1)
  7. Peripheres Fettgewebe entfernen und das Darmgewebe längs auf einer sterilen Glasplatte (15 cm x 15 cm) öffnen oder "filetieren".
  8. Die Darmepithelzotten vorsichtig mit einem Zellschaber abkratzen.
  9. Schneiden Sie den Dünndarm in 2-u20123 cm Länge-weise Abschnitte.
  10. Übertragen Sie das Gewebe mit flachen Zangen (116 mm) in ein 15 ml-Rohr mit vorgekühltem PBS. Waschen Sie die Gewebefragmente, indem Sie kräftig von Hand für 30 s schütteln (bewegen Sie das Rohr in entgegengesetzte Richtungen 60 Mal).
  11. Aktualisieren Sie die PBS und wiederholen Sie die Wäsche, bis die PBS klar wird.
    Hinweis: In der Regel waschen wir die Fragmente 2-u20123 mal.
  12. Inkubieren Sie das Gewebe in einem 15 ml konischen Rohr, das 10 ml Kryptadissoziationspuffer enthält (Tabelle 1) 10 min bei 4 °C auf einem Orbitalshaker bei mittlerer Geschwindigkeit, sobald die PBS klar ist.
  13. Schütteln Sie das Rohr kräftig von Hand für 30 s (gegensätzliche Richtungen 60 mal) und übertragen Sie das Gewebe mit flachen Zangen auf ein weiteres 15 ml konisches Rohr, das 10 ml Kryptadissoziationspuffer enthält. Diesen Bruch auf Eis inkubieren. Verwenden Sie nicht die erste Fraktion für organoide Kultur, weil es in erster Linie zotten enthält.
  14. Wiederholen Sie die Schritte 3.11-u20123.13 für 3-u20124-mal, sammeln Sie jede Fraktion und legen Sie sie auf Eis.
  15. Wählen Sie den Anteil aus, der mit dem höchsten Prozentsatz an Darmkrypten angereichert ist, indem Sie 200 L-Proben aus jedem Bruchteil unter einem invertierten Mikroskop (4x) scannen. Identifizieren Sie Krypten anhand der typischen Morphologie, wie zuvor beschrieben (Abbildung 1A)10.
    HINWEIS: Sie erscheinen rund oder oval und enthalten granulierte Paneth-Zellen. Im Gegensatz dazu sind Zotten fingerartige Strukturen, die nicht die körnigen Paneth-Zellen enthalten (Abbildung 1B).
  16. Übergeben Sie den ausgewählten Bruch durch ein 40-m-Zellsieb, um bei Bedarf Krypten ähnlicher Größe zu erhalten. Alternativ können Sie Lgr5+-Stammzellen auf Basis der Durchflusszytometrie für grünes fluoreszierendes Protein (GFP) isolieren, wenn Mäuse auf den EGFP-Lgr5+-Hintergrund oder ein anderes geeignetes Modell gekreuzt werden, das die Identifizierung von Lgr5+-Zellenermöglicht 2.
  17. Zählen Sie die Gesamtzahl der Krypta im ausgewählten Bruch wie folgt.
    1. Pipette 50 l der ausgewählten Fraktion in ein Hämozytometer und zählen Sie die Anzahl der Krypten mit einem invertierten Lichtmikroskop (4x). Platzieren Sie 100 Krypten pro Bohrstein, wenn Sie eine 48-Well-Platte verwenden, um die Transduktionsexperimente zu ermöglichen, bei denen 3-u20126-Bohrungen pro experimentellem Zustand für Gen-Silencing oder Überexpression transduziert werden.
    2. Berechnen Sie auf der Grundlage der Anzahl der Krypten pro 50 L das benötigte Volumen des Kryptodissoziationspuffers und übertragen Sie dieses Volumen in ein 1,5 ml-Rohr.
      Hinweis: Zum Beispiel werden 10 Gp0 pro 50 l gezählt, für 300 Gpis werden 6 x 50 l oder 300 l benötigt.
  18. Zentrifugieren Sie die Krypten in den 1,5-ml-Rohren bei 300 x g für 5 min.
  19. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, indem Sie die obere Flüssigkeitsschicht vorsichtig abpfeifen und das Pellet in 100 l Wachstumsfaktor reduzierte Kellermembranmatrix auf Eis (Tabelleder Materialien) wieder aufhängen.
  20. Säen Sie die matrixhaltigen Krypten in eine 37 °C vorgewärmte 48-Well-Platte (30 l/well, 100 Krypten/Well). Inkubieren Sie die Platte in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator für 5-u201215 min, umeine Matrix-Gelation (37 °C, 5% CO 2) zu ermöglichen.
  21. Überlagern Sie jedes Gel mit 250 L Organoidkultur (ENR) Medium (Tabelle 1) und legen Sie die 48-Well-Platten wieder in einen Standard-Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5% CO2). Überprüfen Sie die Kulturen für Krypto-Organisation in kleine, runde, zystische Formen nach 24 h; Knospen bilden sich nach 2-u20125 Tagen.
  22. Ersetzen Sie ENR-Medien alle 3 Tage. Entfernen Sie alte ENR-Medien mit sanfter Absaugung, wobei Darauf geachtet wird, die Matrix beim Austausch von Medien nicht zu berühren.
  23. Passage Organoidkulturen alle 4-u20127 Tage wie zuvor beschrieben11.

4. Organoide Fragmentvorbereitung

  1. Transduce Organoide, sobald sie sich bilden (innerhalb von 1-u20122 Wochen) oder nach der Passage. Für ein einzelnes Transduktionsexperiment bereiten Sie 2-u20123 Brunnen von kultivierten Organoiden in einer 48-Well-Platte pro Zustand mit 100-u2012200-Organoiden/Well oder 200-2012600-Organoiden pro experimenteller Transduktionsbedingung vor.
  2. Tauschen Sie ENR mit 250 L-Transduktionsmedien (Tabelle 1) und Kultur in den Transduktionsmedien für 3 oder mehr Tage oder bis die Organoide eine zystische Morphologie anwenden. Sowohl Wnt3a als auch ROCK-Hemmer (Y27632) in das Transduktionsmedium einbeziehen, um die Anzahl der Stamm- und Paneth-Zellen zu erhöhen; Nicotinamid (Nic) verbessert die Kultureffizienz (siehe Transduktionsmedium in Tabelle 1).
  3. Mechanisch brechen Die kuppelartige Kellermembranmatrixstruktur mit Medien und einer Pipettenspitze mit einer 1 ml Pipette.
  4. Die Organoide und Medien in ein steriles 1,5 ml-Rohr übertragen.
  5. Mechanisch stören Sie die Matrix weiter, indem Sie mit einer 200-L-Pipetten-Pipetten-Pipette 10-u201215-mal pipetieren.
  6. Zentrifugieren Sie die Organoidfragmente bei RT bei 500 x g für 5 min.
  7. Entsorgen Sie den Überstand sorgfältig mit einer Pipette und setzen Sie das Pellet in 1 ml DMEM/F12 medium wieder auf (Tabelle 1).
  8. Fügen Sie Dispase I (6 l bei 10 mg/ml) und DNase I (2,5 l bei 10 mg/ml) hinzu. Gut mischen, indem Sie sanft mit einer 1 ml Pipette pipetieren.
  9. Organoide bei 37 °C für 20 min in der 1,5 ml-Röhre inkubieren.
  10. Fügen Sie 500 L ENR-Medien hinzu, um die Dissoziationsreaktion zu beenden; das Serum im ENR beendet die Reaktion.
  11. Übergeben Sie die organoiden Zellen durch ein 20-m-Zellsieb und zentrieren Sie die Organoidfragmente bei 400 x g für 5 min.
  12. Organoidfragmente mit 150 L-Transduktionsmedium (Tabelle1) wieder aufsetzen

5. Gentechnik von Organoiden oder Kryptazellen durch virale Transduktion

HINWEIS: Siehe Abbildung 2.

  1. Saatorganoidzellcluster mit 200 L Transduktionsmedium/Well in einer 48-Well-Platte und inkubieren in einemStandard-Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5% CO2 ). Alternativ können Sie frisch isolierte Kryptazellen (ca. 1.000 Glypts) in 200 L Transduktionsmedium/Well in eine 48-Well-Platte legen und in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5% CO2)inkubieren.
  2. Taudurchstiche von Virus zur Transduktion, die eine Konzentration von 50 L für die Transduktion jedes Brunnens in 48-Well-Platten oder 100 l des konzentrierten Virus pro Brunnen in 24-Well-Platten ermöglichen.
  3. Inkubatvirus mit 12 l magnetischer Nanopartikellösung für 15 min bei RT in einer 1,5 ml-Röhre (Tabelle 3).
  4. Fügen Sie die magnetische Nanopartikellösung/Virusmischung zu den zu transduzierenden Zellen hinzu.
  5. Legen Sie die Zellkulturplatte auf eine Magnetplatte und brüten Sie mindestens 2 h (und bis zu 6 h) ineinem Standard-Gewebekultur-Inkubator (37 °C, 5% CO2 ).

6. Aussaat infizierter organoider Fragmente

  1. Übertragen Sie die infizierten organoiden Zellhaufen und Transduktionsmedien von jedem Brunnen in ein 1,5 ml-Rohr.
  2. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min.
  3. Entsorgen Sie den Überstand mit sanfter Absaugung und kühlen Sie das Rohr, das das Pellet enthält, 5 min auf Eis.
  4. Fügen Sie 120 l Kellermembranmatrix hinzu und setzen Sie das Pellet wieder auf, indem Sie langsam nach oben und unten pfeifen.
  5. Samen 30 l Tropfen der Matrix-Zell-Mischung in eine neue 48-Well-Platte.
  6. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 5-u201215 min, bis die Matrix erstarrt.
  7. Fügen Sie jedem Brunnen Transduktionsmedium hinzu und inkubieren Sie in einem Standard-Gewebekultur-Inkubatorfür 3-u20124 Tage (37 °C, 5% CO2 ).
  8. Nach 3-u20124 Tagen, inspizieren Sie Kulturen unter einem Lichtmikroskop (10x), um die Organisation von Zellclustern in organoiden Strukturen zu gewährleisten. Ersetzen Sie dann vorsichtig die Transduktionsmedien durch ein 250-L-ENR-Medium.
  9. Ersetzen Sie die Medien alle 3-u20124 Tage.

7. Auswahl (falls zutreffend)

  1. Fügen Sie dem Transduktionsmedium nach 2-u20123 Tagen gegebenenfalls relevante Antibiotika oder Hormone zur Selektion hinzu.
    HINWEIS: Wir verwendeten Puromycin (2 g/ml) für die Auswahl der lentivrialen Transduktion, da Plasmide ein Puromycin-Resistenzgen2,14.

8. Bestätigung der erfolgreichen Transduktion und Genexpression oder Silencing

  1. Bei Verwendung des FUGW lentivirus2,14, schätzen Sie die Transduktionseffizienz durch Messung von GFP-Signalen mittels Fluoreszenzmikroskop oder Durchflusszytometrie.
  2. Validieren Sie die Genüberexpression oder Silencing mit quantitativer Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) für den quantitativen Vergleich von mRNA in den Kontroll- und experimentellen Organoidkulturen.
  3. Bestätigen Sie den Proteingehalt für die Protein-kodierende Genexpression oder Silencing durch Western Blot oder Immunostaining2.

9. Organoide Kryosektion in Basement Membrane Matrix

HINWEIS: Siehe Abbildung 3.

  1. Entfernen Sie enDenR-Medium durch sanfte Absaugung, achten Sie darauf, die Kellermembranmatrix nicht zu stören und sanft einmal mit 500 l PBS zu waschen.
  2. Fix-Organoide mit 1,0 ml von 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung (Tabelle der Materialien) bei RT für 30 min.
  3. PfA durch Absaugen entfernen und zweimal mit 1 ml PBS waschen.
  4. Entfernen Sie PBS durch Absaugen und fügen Sie 1,0 ml 30% Saccharosepuffer zu jeder Probe hinzu. Feste Organoide in Saccharose für 1 h bei 4 °C in einem kalten Raum, Kühlschrank oder auf Eis inkubieren, um Proben zu dehydrieren.
  5. Entfernen Sie den Saccharosepuffer durch Absaugen und fügen Sie gerade genug Einbettungsmasse (Materialtabelle) hinzu, um die Matrixschicht (ca. 300 l/well) in jedem Brunnen abzudecken.
  6. Inkubieren Bei RT für 5 min.
  7. Legen Sie die Proben 10 min lang in einen -80 °C-Gefrierschrank, oder bis die Einbettungsmasse fest und weiß wird.
  8. Legen Sie die Schale mit gefrorener Einbettungsmasse bei RT, um ein minimales Schmelzen der Verbindung entlang der Ränder zu ermöglichen. Verwenden Sie ein Skalpell, um den Block von den Wänden des Brunnens zu trennen.
  9. Entfernen Sie den Matrix-Einbettungs-Verbindungsblock mit Zangen und legen Sie ihn in einen Probenblock (z. B. Kryomold), wodurch schnell das Schmelzen verhindert wird.
  10. Füllen Sie die Form vollständig mit Einbettungsmasse und einfrieren bei -80 °C für 30 min.
  11. Verwenden Sie den Block ist für das Schnitten oder Lagern in -80 °C Gefrierschrank für die weitere Verwendung.

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Ergebnisse

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Hier beschreiben wir eine schnelle und hocheffiziente Transduktionstechnik, die magnetische Nanopartikel nutzt, die einem Magnetfeld ausgesetzt sind, um Lentivirus an gefährdete Zellen zu liefern. Mit leicht verfügbaren Werkzeugen haben wir diesen Ansatz nicht nur zur Transduce frisch isolierter Kryptozellen (Abbildung 1A), sondern auch für Organoide (Abbildung 2) und andere Zellen, die feuerfest zu routinemäßigeren Transduktions...

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Diskussion

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Primäre Kultur des adulten Darmepithels als Organoide bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die an der Stammzellfunktion, der intestinalen epitheliale Homöostase und der Pathologie1,2,3, 4. Obwohl die CRISPR/Cas9-Technologie zur Genentwicklung von Organoiden9eingesetzt werden kann, wird sie durch die Notwendigkeit eines umfassen...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Institute of Health (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), des Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), der American Lung Association, des Allegheny Health Network - Johns unterstützt. Hopkins Research Fund und das Hopkins Digestive Diseases Basic Research Core Center.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMThermo Fisher Scientific11965092Basismedium für 293T-Zellen
DMEM/F12+Thermo Fisher Scientific12634010Basismedium für Organoid-Kulturmedium und Organoid-Verdauungspuffer
OPTI-MEMThermo Fisher Scientific11058021Transfektionsmedium für Virusplasmide
Fötales RinderserumCorning35-011-CVBestandteil des Virussammelmediums und des 293T-Mediums
Pen/StrepThermo Fisher Scientific15140122Bestandteil des Organoid-Kulturmediums und des Kryptendissoziationspuffers
PBS (ohne Ca2+, Mg2+)Thermo Fisher Scientific10010049A Waschpuffer und Bestandteil des Kryptendissoziationspuffers
Mem-NEAAThermo Fisher Scientific11140050Bestandteil des Organoid-Nährmediums
GlutamaxIIThermo Fisher Scientific35050061Bestandteil des Organoid-Nährmediums
HEPESThermo Fisher Scientific15630080Bestandteil des Organoid-Nährmediums
EGFMillipore SigmaE9644Bestandteil des Organoid-Nährmediums
NogginPeprotech250-38 BBestandteil des Organoid-Kulturmediums
R-spondinR& D7150-RS-025/CFBestandteil des Organoid-Kulturmediums
Humanes rekombinantes InsulinMillipore SigmaI9278-5mlBestandteil des Organoid-Kulturmediums
NicotinamidMillipore SigmaN3376-100GBestandteil des Transduktionsmediums
Wnt3AR& D5036-WN-010Bestandteil des Transduktionsmediums
Y27632Millipore SigmaY0503-1MGBestandteil des Transduktionsmediums
0,5 M EDTAThermo Fisher Scientific15575020Bestandteil des Crypts-Dissoziationspuffers
DTT (Dithiothreitol)Thermo Fisher ScientificR0861Bestandteil des Crypts-Dissoziationspuffers
Dispase IMillipore SigmaD4818-2MGBestandteil des Organoid-Verdauungspuffers
DNase IMillipore Sigma11284932001Bestandteil des Organoid-Verdauungspuffers
Matrigel (Wachstumsfaktor reduziert)Corning356231Wird als Matrix zur Einbettung von Organoiden verwendet
Opti-MEMThermo Fisher Scientific 31985070Medium für die Transfektion in der Virusproduktion
ViralMag R/LOz BiosiencesRL40200Magnetische Partikel der Virustransduktion
MagnetplatteOz BiosiencesMF10000Magnetplatte zur Erleichterung der Virustransduktion
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Transfektionsmittel in der Virusproduktion
Poly-D-LysinMillipore SigmaA-003-EBeschichtung für Platten vor der Aussaat von 293T-Zellen
4% Formaldehyd-LösungBosterAR1068Lösung zur Fixierung von Organoiden
O.C.T. EinbettverbindungThermo Fisher Scientific4583SZum Einbetten der Organoide
5 mL Falcon Polystyrol-RöhrchenCorning352054
50 mL Falcon RöhrchenSarstedt62.547.100
Orbitron Rotator II Rocker ShakerBoekel Scientific260250
Olympus Inverse Mikroskopie CK30OlympusCK30zum Scannen und Zählen von Krypten
Zeiss Axiovert 200 invertierte FluoreszenzNikonAxiovert 200zur Betrachtung der Fluoreszenz in den Krypten
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit mit Ultracel-100 MembranMilipore SigmaUFC910024Zur Konzentration von Viren
pluriSsieb 20 µ m (Cell Strainer)pluriSelectSKU 43-50020Zur Aufbereitung von Organoid-Fragmenten
Falcon CellStrainer Fisher Scientific352340Zur Aufbereitung von Cyrpten ähnlicher Größe nach der Kryptenisolierung
Greiner CELLSTAR  Multiwell-Kulturplatten 48 Wells (TC-behandelt mit Deckel)Millipore SigmaM8937-100EAForD2:D37+D16:D37g Organoid-Fragmente
Tierischer Stamm: C57BL/6JJackson Lab#000664Für die Organoid-Kultur

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
  2. Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
  5. Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
  6. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  7. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
  8. Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent '+4' cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
  9. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
  10. Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765(2014).
  11. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
  12. Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
  13. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
  14. Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
  15. Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
  16. Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210(2013).

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