Genetische Technik der primären Maus-Darm-Organoide mit magnetischen Nanopartikel-Transduktion virale Vektoren für gefrorene Schnitte

Lingling Xian; Lionel Chia; Dan Georgess; Li Luo; Shuai Shuai; Andrew J. Ewald; Linda M.S. Resar

doi:10.3791/57040

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Methodenartikel

Genetische Technik der primären Maus-Darm-Organoide mit magnetischen Nanopartikel-Transduktion virale Vektoren für gefrorene Schnitte

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DOI:

10.3791/57040

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10. Mai 2019

Lingling Xian¹ , Lionel Chia¹^,⁵ , Dan Georgess² , Li Luo¹ , Shuai Shuai¹ , Andrew J. Ewald³^,⁴ , Linda M.S. Resar¹^,⁴^,⁵^,⁶

¹Department of Medicine, Division of Hematology, Johns Hopkins University School of Medicine, ²Department of Natural Sciences, School of Arts & Sciences, Lebanese American University, ³Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, ⁴Department of Oncology, Johns Hopkins University School of Medicine, ⁵Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, ⁶Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben Schritt-für-Schritt-Anleitungen zu: 1) effiziente Technische Darmorganoide mit magnetischen Nanopartikeln für lenti- oder retrovirale Transduktion, und, 2) erzeugen gefrorene Abschnitte aus technischen Organoiden. Dieser Ansatz bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Genexpression in Organoiden effizient zu verändern, um nachgelagerte Effekte zu untersuchen.

Zusammenfassung

Darmorganoidkulturen bieten eine einzigartige Gelegenheit, Darmstammzell- und Kryptobiologie in vitro zu untersuchen, obwohl effiziente Ansätze zur Manipulation der Genexpression in Organoiden in dieser Arena nur begrenzte Fortschritte gemacht haben. Während die CRISPR/Cas9-Technologie eine präzise Genombearbeitung von Zellen für die Organoiderzeugung ermöglicht, erfordert diese Strategie eine umfassende Auswahl und Einsiebung durch Sequenzanalyse, was sowohl zeitaufwändig als auch kostspielig ist. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur effizienten viralen Transduktion von Darmorganoiden zur Verfügung. Dieser Ansatz ist schnell und hocheffizient, wodurch der Zeit- und Kostenaufwand für die CRISPR/Cas9-Technologie verringert wird. Wir präsentieren auch ein Protokoll zur Erzeugung gefrorener Abschnitte aus intakten Organoidkulturen zur weiteren Analyse mit immunhistochemischer oder immunfluoreszierender Färbung, die zur Bestätigung der Genexpression oder Silencing verwendet werden kann. Nach erfolgreicher Transduktion viraler Vektoren zur Genexpression oder Silencing können Darmstammzell- und Kryptofunktionen schnell beurteilt werden. Obwohl die meisten Organoidstudien In-vitro-Assays verwenden, können Organoide auch an Mäuse für in vivo-Funktionsanalysen geliefert werden. Darüber hinaus sind unsere Ansätze vorteilhaft für die Vorhersage therapeutischer Reaktionen auf Medikamente, da derzeit verfügbare Therapien in der Regel durch Modulation der Genexpression oder Proteinfunktion funktionieren, anstatt das Genom zu verändern.

Einleitung

Die Fähigkeit, Maus- oder menschliche Kryptozellen als dreidimensionale (3D) Organoide aus dem Dünndarm oder Dickdarm über längere Zeiträume zu kultitogen, lieferte einen großen Durchbruch, da diese Kulturen in vivo definierende Merkmale des Darmepithels aufweisen. ¹ ^, ² ^, ³. Organoide, die aus primären Krypten abgeleitet sind, sind in der Lage, sich selbst zu erneuern und selbst zu organisationen, und weisen zelluläre Funktionen auf, die ihren Ursprungsgeweben ähneln. Tatsächlich rekapitulieren Organoide nicht nur die strukturelle Organisation von Krypten in vivo, sondern au....