Gemultiplexten isothermen Verstärkung basiert Diagnoseplattform zu erkennen, Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber 1

Summary

Aktuellen Multiplex Diagnostik Zika, Chikungunya und Dengue-Viren erfordern komplexe Probenvorbereitung und teure Instrumentierung, und sind in geringen Ressourcen Umgebungen geeignet zu erkennen. Wir zeigen eine Diagnose, mit denen Isotherme Verstärkung mit zielgruppenspezifischer Strang verschieblich Sonden zu erkennen und diese Viren mit hoher Sensitivität und Spezifität zu unterscheiden.

Abstract

Zika, Dengue-Fieber und Chikungunya-Fieber-Viren werden durch Mücken, übertragen Krankheiten mit ähnlichen Symptomen der Patienten verursachen. Jedoch haben andere nachgeschaltete Patient zu Patient Übertragung Potentiale, und erfordern sehr unterschiedliche Patienten Behandlungen. So Zika Ausbrüchen machen es dringend notwendig, Werkzeuge zu entwickeln, die diese Viren bei Patienten schnell zu diskriminieren und Mücken, um die richtige Behandlung von Patienten, wählen und verstehen und verwalten ihre Epidemiologie in Echtzeit gefangen.

Leider aktuellen diagnostischen Tests, einschließlich die empfangende 2016 Notfall verwenden Berechtigungen und Fast-Track-Status, virale RNA durch reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), die Instrumentierung erfordert, geschulte Benutzer, zu erkennen und beträchtliche Probenvorbereitung. So müssen sie "genehmigt" Referenzlaboratorien, die Zeit gesendet werden. In der Tat im August 2016, das Center for Disease Control (CDC) fragte schwangere Frauen gewesen, die von einer Mücke gebissen und entwickelte einen Zika-Angabe Hautausschlag, eine inakzeptable 2 bis 4 Wochen vor dem Lernen zu warten, ob sie infiziert sind. Wir brauchen sehr viel Tests, die vor Ort, mit wenigen Mitteln und durch ausgebildete, aber nicht notwendigerweise lizenzierte Personal erfolgen können.

Dieses Video zeigt einen Test, der diese Spezifikationen, arbeiten mit Urin oder Serum (für Patienten) oder zerdrückten Mücken Kadaver (für Umweltüberwachung), alles ohne viel Vorbereitung der Probe. Mosquito Schlachtkörper werden auf Papier mit quaternären Ammonium Gruppen (Q-Papier) gefolgt von Ammoniak Behandlung um Biogefährdung verwalten erfasst. Diese sind dann direkt, ohne eine RNA-Isolierung, legen in Assay-Röhrchen mit gefriergetrockneten Reagenzien, die keine Kette der Kühlung benötigen. Eine modifizierte Form der reversen Transkription Schleife-vermittelten isothermen Verstärkung mit zielgruppenspezifischer Eindringmittel tagged verschieblich Sonden produziert auslesen, in 30 min, als eine dreifarbige Fluoreszenzsignal. Dies ist mit einem handheld, batteriebetriebenes Gerät mit einen Orangefilter visualisiert. Nach vorne Kontamination wird mit versiegelten Röhren und die Verwendung von thermolabilen Uracil DNA Glycosylase (UDG) in Anwesenheit von dUTP in der Verstärkung Mischung verhindert.

Introduction

Moskitos übertragene Virus-Infektionen, einschließlich Dengue-Fieber, Chikungunya und Zika Viren sind auf den Aufstieg und Nachfrage sofortige Managementstrategien. Dengue-Fieber und Chikungunya-Fieber-Viren sind bereits in vielen tropischen Regionen denen Zika jetzt in der westlichen Hemisphäre¹verbreitet ist endemisch. Zika-Virus, wie Dengue-Fieber, ist ein Mitglied der Familie Flaviviridae und stammt aus Afrika mit einem asiatischen und zwei afrikanische genetische Linien². Obwohl die Identifizierung des Virus Zika bis 1947 zurückgeht, blieb Zika-Infektion beim Menschen sporadisch für ein halbes Jahrhundert v....

Protocol

Hinweis: Moskitos waren die einzigen Tiere, die direkt in dieser Studie verwendet. Die Verfahren, die Hühner, zu verwalten, deren Blut verwendet wurde, um die infizierten Mücken ernähren, wurden als IACUC Protokoll #201507682 durch die Universität von Florida institutionelle Tierpflege und Nutzung Committee.Virus Ausbreitung genehmigt und Moskito-Infektion Studien waren durchgeführt an der BSL-3-Anlage des Florida Medical Entomology Laboratory in Vero Beach, erfolgten FL. RT-Lampe Experimente im BSL-2 Labor geteilt durch FfAME und Firebird biomolekulare Wissenschaften LLC im Alachua, FL.

1. Aufbau von Primern und Strang verdrängen Sonden

....

Results

Zunächst wurden die Leistungen der einzelnen RT-Lampe Grundierung (Tabelle 1) mit ihren entsprechenden viralen RNA-Substrat sowie Negativkontrollen durch Gelelektrophorese bewertet. RT-Lampe Primer wurden entwickelt, um NS5 Zielregion (RNA-abhängige RNA-Polymerase) für Zika und Dengue-1 und nsP2 Region (nichttragenden Protein P2) für Chikungunya-Fieber. Vorlagen waren total RNA aus kultivierten virale Bestände in African Green Monkey Nierenzellen (Vero) extrahiert. In ein.......

Discussion

Moskitos übertragene Viren einschließlich Zika, Chikungunya und Dengue-Fieber bedrohen die Gesundheit und den letzten Höhepunkt der Zika-Ausbrüche den Bedarf an kostengünstigen Point-of-Care-Erkennung Alternativen für Patienten Diagnostik sowie für Moskito-Überwachung. Isothermen Amplifikationsverfahren wurden als erschwingliche Alternativen zu PCR-basierten Systemen entwickelt. Insbesondere wurden RT-Lampe-basierten Plattformen angewendet, um eine Vielzahl von Krankheitserregern zu erkennen. Die Verwendung von isotherme.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SafeBlue Illuminator/Elektrophorese-System, MBE-150-PLUS	Major Science	MBE-150	Gelelektrophorese
G:BOX F3	Syngene	G:BOX F3	Gel-Bildgebung
LightCycler 480 Instrument II, 96 Wells	Roche Applied Science	05 015 278 001	Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Zentrifugalfiltereinheit mit Ultracel-10-Membran	Millipore Sigma	UFC501096	Ultrafiltraton Membran für die Dialyse
Eppendorf 5417C Zentrifuge	Marshall Scientific	EP-5417C	Zentrifuge
Myblock Mini Drybath	Benchmark	Scientific BSH200	Trockenbad
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System	Labconco	7934020	Lyophilisierer
alle Priers und Sonden	IDT	custom	RT-LAMP Primer und Sonden
dNTP-Set	Bioline	BIO-39049
Desoxyuridintriphosphat (dUTP)	Promega	U1191
Bst  2.0 WarmStart  DNA-Polymerase	New England Biolabs	M0538L	Enzym
WarmStart RTx Reverse Transkriptase	New England Biolabs	M0380L	Enzym
RNase Inhibitor, Maus	New England Biolabs	M0314L	Enzym
Antarktis Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372L	Enzym
50bp DNA Step Ladder	Promega	G4521	Marker
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, weiß	Roche Applied Science	4729692001	Echtzeit-RT-LAMP-Analyse