Methodenartikel
* These authors contributed equally
In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle, um die Rolle der extrazellulären Vesikel (EVs) veröffentlicht durch Plasmodium Falciparum infizierten Erythrozyten zu untersuchen. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Wechselwirkungen von EVs mit Endothelzellen.
Malaria ist eine lebensbedrohliche Krankheit, verursacht durch Plasmodium -Parasiten, mit p. Falciparum als auf dem afrikanischen Kontinent verbreitet und verantwortlich für die meisten Malaria-Todesfälle weltweit. Mehrere Faktoren einschließlich der Parasit Sequestrierung in Geweben, vaskuläre Dysfunktion und Entzündungsreaktionen beeinflussen die Entwicklung der Krankheit bei Menschen mit Malaria infiziert. P. Falciparum-infizierten roten Blutkörperchen (iRBCs) lösen kleine extrazelluläre Vesikel (EVs), enthält verschiedene Arten von Fracht-Moleküle, die Pathogenese und zelluläre Kommunikation zwischen Parasiten und Host zu vermitteln. EVs werden effizient durch Zellen aufgenommen in denen sie ihre Funktion modulieren. Hier besprechen wir Strategien, um die Rolle der EVs in Parasit-Wirt-Interaktionen. Zunächst beschreiben wir eine einfache Methode für die Kennzeichnung und Nachverfolgung EV Internalisierung von Endothelzellen, mit einem grünen Zelle Linker Farbstoff. Zum anderen berichten wir über eine einfache Methode zur Durchlässigkeit über eine Monolage Endothelzellen messen mithilfe von Eindringmittel beschrifteten Dextran. Schließlich zeigen wir, wie die Rolle der kleine nicht-kodierende RNA-Moleküle in Endothelzellen Funktion zu untersuchen.
Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation gab es 212 Millionen neue Fälle von Malaria im Jahr 2015 weltweit und rund 429.000 Menschen starben, vor allem Kinder unter fünf Jahren Alter1. Die Mechanismen, die schwere Krankheit, die oft mit vaskuläre Dysfunktion assoziiert wird, bleiben unklar2. Plasmodium- iRBCs absondern, kleine Bi-Lipidmembran Sphären als extrazelluläre Vesikel (EVs) bekannt. Es ist bekannt, dass diese EVs den Infektionsprozess und die Host-Immunantwort auf eine Infektion potenziell relevant sind; jedoch ist wenig bekannt über die genaue Funktion von diesen kleinen Vesikeln in Malaria-Infekti....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Menschlichen Erythrozyten stammen aus dem Blut von gesunden Spendern, gemäß den Richtlinien des AGEK (swissethics.ch).
Hinweis: P. Falciparum Parasit Kulturen (3 7) und EV Produktion waren zuvor beschrieben in Mbagwu, Et Al. 11 da p. Falciparum ein menschlicher Erreger handelt, wenden Sie sich an die örtlichen Vorschriften Handhabung. Die Kulturen aufbewahrt werden sterile die gesamte Zeit.
(1) Fluoreszenz Kennzeichnung des EFD
Hinweis: Das folgende Verfahren nutzt die Kennzeichnung Technologie, einen grünen Fluoreszenzfarbstoff (PKH67) ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Hier beschreiben wir Protokolle untersuchen die Wechselwirkungen des EFD mit Wirtszellen. Die Aufnahme von Eindringmittel beschrifteten EVs wird durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 1) überwacht. Endotheliale Zellen nehmen effizient EVs, aber die Inkubationszeit mit EVs optimiert werden kann, um die Aufnahme zu verfolgen. Färben Sie für eine bessere Lokalisierung der EVs in den Zellen Actin mit Phalloidin. Als Nächstes verwenden wir eine Filtermembran, auf .......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Einige Parasiten, einschließlich Toxoplasma, Trypanosomen und Leishmanien Trichomonas auslösen die Freigabe der EVs von der infizierten Wirtszelle. Je nach Erreger können freigegebene EVs vermitteln zelluläre Kommunikation zwischen den Parasiten6bzw. der Host Immunantwort modulieren. Jedoch gibt es wenig Hinweise darauf, wie diese kleinen Bläschen zu Malaria Krankheit beitragen. Hier haben wir mehrere Möglichkeiten, um die Funktion des EFD bei Plasmodium Infektion untersuchen beschrieben........
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Diese Studie wurde von der Novartis-Stiftung für medizinische und biologische Forschung (um PYM), der Gottfried und Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (für MW und PYM) und den Forschungspool der Universität Freiburg (um PYM) teilweise finanziell unterstützt. Weitere Beihilfen gehören die Schweizer Regierung Excellence Scholarships für ausländische Wissenschaftler (zur KAB und SM). Wir danken Isabelle Fellay und Solange Kharoubi Hess für technischen Support.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| PKH67 Grün fluoreszierender Zellverlinker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Verdünnungsmittel C | Sigma-Aldrich | G8278 | |
| Poly-L-Lysin | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| PBS | ThermoFisher - Gibco | 10010023 | |
| Phalloidin CF594 | Biotium | #00045 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Gold Eindeckmittel | ThermoFisher | P36934 | |
| Rhodamin B Isothiocyanat– Dextran | ThermoFisher | R9379-250MG | |
| Einsatz mit PET-Membran transparent Falcon für Platte 24 Vertiefungen | Falcon | 353095 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | Promocell | C-22020 | |
| Puromycin-Dihydrochlorid | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| MTS Zellproliferation Kolorimetrisches Assay-Kit | Biovision | K300-500 | |
| Hexadimethrinbromid | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| MISSION Lenti microRNA, humane has-miR-451a | Sigma-Aldrich | HLMIR0583 | |
| MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negativkontrolle 1 Transduktionspartikel | Sigma-Aldrich | NCLMIR001 | |
| MISSION Lenti microRNA, Human | Sigma-Aldrich | NCLMIR0001 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| miRNeasy mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transkription Kit 1000 Reaktionen | ThermoFisher | 4366597 | |
| has-mir-451a RT/750 PCR rxns | ThermoFisher | 001141 | |
| U6 snRNA | ThermoFisher | 001973 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, mit UNG | ThermoFisher | 4440038 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4376600 |
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragen