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Methodenartikel

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

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DOI:

10.3791/57069

⸱

9. April 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry, Faculty of Life Sciences, University of Leipzig

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.

Zusammenfassung

Die genetische Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) über Bernstein Stopp-Codon Unterdrückung ist eine leistungsstarke Technik, künstliche Sonden und reaktive Moieties auf Proteine direkt in der live Zelle zu installieren. Jede ncAA ist durch eine spezielle orthogonale Suppressor-tRNA/amino-Acyl-tRNA-synthestase (AARS) Paar aufgenommen, die in den Wirtsorganismus importiert wird. Die Einbeziehung Effizienz der verschiedenen NcAAs kann stark unterschiedlich und in einigen Fällen unbefriedigend sein. Orthogonale Paare können verbessert werden durch die Manipulation der AARS oder der tRNA. Gerichtete Evolution von tRNA oder AARS mit großen Bibliotheken und tot/lebendig Auswahlmethoden sind jedoch nicht machbar in Säugetierzellen. Hier ist eine einfache und robuste Fluoreszenz basierende Assays, die Effizienz der orthogonalen Paare in Säugetierzellen zu bewerten präsentiert. Der Test ermöglicht screening Dutzende bis Hunderte von AARS/tRNA-Varianten mit mäßigem Aufwand und innerhalb eines angemessenen Zeitraums. Verwendung des Assays neue tRNAs generieren, die deutlich die Effizienz der Pyrrolysin orthogonalen System beschrieben ist, zusammen mit der Anwendung von NcAAs zur Erforschung der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), die Objekte eine für ncAA Herausforderung sind Mutagenese. Erstens werden durch die systematische Integration eine Foto-Vernetzung ncAA in der extrazellulären Oberfläche eines Rezeptors, Bindungsstellen der verschiedenen Liganden auf den intakten Rezeptor direkt in der live Zelle zugeordnet. Zweite, durch den Einbau von NcAAs der letzten Generation in einem GPCR, ultraschnelle Katalysator-freie Rezeptor Kennzeichnung mit einem fluoreszierenden Farbstoff ist gezeigt hat, nutzt die Bioorthogonal Belastung gefördert inverse Diels Alder Cycloaddition (SPIEDAC) auf die live-Zelle. Wie NcAAs in der Regel auf jedem Protein unabhängig von dessen Größe angewendet werden kann, ist die Methode von allgemeinem Interesse für eine Reihe von Anwendungen. Darüber hinaus ncAA Einarbeitung erfordert keine spezielle Ausrüstung und erfolgt im standard Biochemie Labor.

Einleitung

Die genetische Einbeziehung der chemischen Sonden in Proteinen ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung der strukturellen und dynamischen Aspekte der Proteinfunktion direkt im heimischen Kontext der live Zelle zu erleichtern. Heute können Hunderte von nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs), ausgestattet mit den verschiedensten chemischen Gruppen ortspezifisch Proteine durch Biosynthese1,2,3,4integriert werden. Dazwischen findet man lichtempfindliche NcAAs wie Foto-Vernetzer5, Foto-Käfig6,7,8,9 und Foto-schaltbare Aminosäuren10, 11, Aminosäuren mit angespannten Alkenen und Alkinen für Katalysator-freie Bioorthogonal Chemie2,12,13,14,15,16 ,17, Aminosäuren tragen Dansyl18, Cumarin9,19und21 Fluorophore prodan20,und Aminosäuren ausgestattet mit anderen biophysikalischen Sonden als sowie mit den Post translationale Modifikationen1,2,3,4,22,23,24,25.

Die genetische Codierung eine ncAA wird ermöglicht durch eine dedizierte amino-Acyl-tRNA-synthestase (AARS) gekoppelt an ein cognate Suppressor-tRNA, die der ncAA in Reaktion auf eine bernsteinfarbene Stopcodon während der regelmäßige ribosomale Synthese enthält. NcAARS/tRNA-Paare sind so konstruiert, um im Wirtsorganismus, d. h. nicht mit den endogenen paar Übersprechen orthogonal sein. Die Technik ist gut etabliert, sowohl in prokaryotischen und eukaryotischen Gastgeber und leicht anwendbare, Säugetier-Zellen. Paare zum ncAA Einbau in Säugerzellen basieren auf drei orthogonalen Hauptsysteme: das Tyrosyl-System, das die TyrRS von E. Coli26 mit einem Tyrosyl Bernstein-Schalldämpfer von B. Stearothermophilus27 (EG kombiniert TyrRS /BstYam Paar), die E. Coli Leucyl System (EGLeuRS/tRNALeuCUA Paar)6,18,28 und die Archaeen Pyrrolysyl-System (PylRS/tRNA Pyl Paar)3, wobei die tRNAPyl ist ein natürlicher Bernstein Suppressor. Im Allgemeinen ist eine spezialisierte NcAARS jedes ncAA anerkannt. Abhängig von der Struktur der ncAA erhält man die NcAARS durch gerichtete Evolution von TyrRS, LeuRS oder PylRS, obwohl einige synthetasen mehrere ncAA akzeptieren können.

Das orthogonale Paar wird in die Zellen importiert, indem Sie einfach ein Plasmid-Vektor. Am meisten common und effiziente Plasmide sind Bicistronic und sowohl für die synthestase und die tRNA bilden die orthogonale Paar29zu kodieren. Eine zweite Plasmid-Codierung für das Protein des Interesses trägt eine gelbe Codon am Standort für die Änderung ist Co transfizierten. Die ncAA ist einfach das Wachstumsmedium Zelle hinzugefügt. Jedoch verwenden verschiedene Fachgruppen oft verschiedene Varianten von Plasmid Konstrukte auch für die Aufnahme der gleichen ncAA. Konstrukte unterscheiden sich in der Anordnung der Gene in den Vektor, der synthestase, Codon Usage synthestase gen, Projektträger Nutzung, Variante der tRNA und Anzahl der tRNA Expressionskassetten. Darüber hinaus kann die Einbeziehung Effizienz der verschiedenen NcAAs drastisch aufgrund der verschiedenen katalytische Effizienz der verschiedenen synthetasen, die Qualität der tRNA und anderen Faktoren30variieren. Daher ist es wichtig, eine schnelle und zuverlässige Methode zur Bewertung der Effizienz eines orthogonalen Pairs, die am besten geeignete System für eine gewünschte Anwendung auswählen und einige Optimierungsschritte durchführen, die Verbesserung der Gesamt-Protein-Expression zur hand zu haben Renditen.

Wir haben eine einfache und robuste Fluoreszenz basierende Assays zur Bewertung der Effizienz der orthogonalen Paare29 (Abbildung 1) etabliert. Zellen sind in der Probe Co transfected mit der Plasmid-Codierung für das orthogonale Paar, zusammen mit einem Bicistronic Reporter Plasmid Codierung sowohl für das grün fluoreszierende Protein trägt eine gelbe Stopcodon an einer freizügigen Position (EGFP-TAG) und die mCherry gen. Rote und grüne Fluoreszenz der gesamten Zelle Lysates werden in getrennten Kanälen auf einem Teller-Leser in einer 96-Well-Platte gelesen. Die Intensität der grünen Fluoreszenz korreliert direkt mit der Effizienz der Bernstein Unterdrückung, während die Intensität der rote Fluoreszenz eine direkte Schätzung der Größe der gemessenen Probe und die Transfektion Effizienz gibt. In Bezug auf ähnliche Tests basierend auf Fluoreszenz assistierten Zelle Sortieren (FACS) ausgelesen31,32, Assays gibt eine sofortige und umfassende Bewertung der Proteinexpression in der gesamten Zellpopulation, die mehr Vertreter der üblichen experimentellen Bedingungen, und bietet eine einfachere Datenerfassung und Verarbeitung mit standard-Software. Insgesamt ist der Hauptvorteil des Tests, dass ein Medium, um eine große Anzahl von Proben parallel analysiert werden kann. Mit Hilfe dieses Tests, haben wir eine rational konzipierte Bibliothek von Suppressor-tRNAs zur Verbesserung der Effizienz der Pyl orthogonalen System30gezeigt. Diese Arbeit beschreibt das experimentelle Protokoll zum Durchführen dieser Assay und zeigen Beispiele für seine Anwendung, einschließlich der Optimierung des orthogonalen Paares für die Einbeziehung von der Foto-Vernetzung ncAA p-Azido-L-Phenylalanin (Azi) und den Vergleich der Einbindung Wirkungsgrade verschiedener Aminosäuren (Abbildung 2).

In den letzten Jahren ncAA Werkzeuge sind sehr mächtig, um strukturelle Untersuchung nachgewiesen worden und funktionalen Aspekte des G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs)33,34,35,36,37 , 38. beim Menschen GPCRs bilden eine große Familie von Membranrezeptoren (800 Mitglieder) und Hauptziele für therapeutische Drogen darstellen. Direkte strukturelle Charakterisierung von GPCRs ist immer noch anspruchsvoll und ergänzende biochemische Methoden sind hoch für ihre Untersuchung erforderlich. Wir sind Pionier im Einsatz von Foto-Vernetzung NcAAs GPCR Oberflächen abbilden und Ligand verbindliche Taschen34zu entdecken. Mit unserem optimierten System Azi Aufnahme haben wir systematisch Azi in der ganzen Juxtamembrane Domäne von GPCR direkt in lebenden Säugetier-Zellen aufgenommen. Bei UV-Bestrahlung bildet Azi eine hochreaktive Nitrene Spezies, die benachbarten Moleküle kovalent erfasst. Wenn die Liganden zum System hinzugefügt wird, dient Azi als ein Näherungssensor zu offenbaren, welche Positionen des Rezeptors in der Nähe der gebundenen Liganden kommen. Auf diese Weise wurde der Bindungsmodus des Hormons Neuropeptid Urocortin ich (Ucn1) auf die Klasse B GPCR Corticotropin-freigeben-Faktor-Rezeptor Typ 1 (CRF1R)33 erstmals vorgestellt. In letzter Zeit, haben wir unterschiedliche verbindliche Muster von Agonisten und Antagonisten auf die gleichen Rezeptor38offengelegt. Ein ähnlicher Ansatz wurde von anderen Orthosteric und allosterische Bindungsstellen anderer Peptide und niedermolekularen Liganden auf andere GPCRs39,40,41,42offenbaren angewendet. Dieses Manuskript beschreibt das experimentelle Protokoll in unserem Labor für Foto-Vernetzung Zuordnung von GPCR Oberflächen angewendet. Die Methode ist relativ schnell, unkompliziert und erfordert keine spezielle Ausrüstung, so dass es im standard Biochemie Labor anwendbar ist. Wichtig ist, der Ansatz bietet ein wertvolles Instrument, nicht nur um Ligand verbindliche Aufstellungsorte zu identifizieren, wo 3D Strukturdaten sind knapp, sondern auch zur Ergänzung der vorhandenen in-vitro- Daten mit Informationen aus voll posttranslational modifizierte Rezeptoren in der physiologische Umgebung der Zelle Leben.

Die jüngste Entwicklung von neuartigen NcAAs Lager auf der Seite Kette chemischen Gruppen geeignet für ultraschnelle Katalysator-freie Bioorthogonal-Chemie hat eröffnet die Möglichkeit, letzte Generation Fluorophore für super-Resolution Imaging in Proteine zu installieren direkt auf die Zellen2,43. Diese chemische Dübel sind gespannte Cyclooctyne in SCOK14, Bicyclo [6.1.0] Nonyne BCNK12,17und Trans-Cyclooctenes TCO * K13,15,17 unter anderen NcAAs beherbergen eine Norbornen16,17,44 oder Cyclopropen45,46 Glyko-. Sperrige NcAAs für Bioorthogonal Chemie fließen durch eine Variante des PylRS, die in der Regel als PylRSAF bezeichnet (Angabe Mutation Y271A und Y349F in M. Barkeri PylRS), sowie durch andere ad-hoc- entwickelt NcAARSs17 , 44. Bioorthogonal Anker mit kurz Reagenzien47 über inverse Elektron-Nachfrage Diels-Alder Cycloaddition Kennzeichnung ertragreich innerhalb von wenigen Minuten43,48zu reagieren. Anwendung dieses leistungsstarken Konzepts Label GPCRs hat jedoch durch einen niedrigen Gesamtwirkungsgrad des orthogonalen ncAA Einbeziehung Systems streitig gemacht. Mit unserem erweiterten Pyl-System haben wir vor kurzem hochverzinsliche Berücksichtigung solcher Aminosäuren GPCRs und ultraschnelle GPCR Kennzeichnung auf der Oberfläche des lebenden Säugetier-Zellen30gezeigt. Beschriftete Rezeptoren waren noch funktionsfähig, da sie physiologisch, beim Aktivieren des Agonist-Rezeptors verinnerlicht. Das experimentelle Protokoll für die Einbeziehung von Bioorthogonal in GPCRs Anker und die folgende Kennzeichnung Schritte werden hier beschrieben. GPCRs mit kleinen hellen Fluorophore auszustatten, ist der erste grundlegende Schritt zur Studie von GPCR Strukturdynamik in der live-Zelle über erweiterte mikroskopiertechniken.

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Protokoll

(1) Fluoreszenz-basierten Screening der Einbeziehung Wirkungsgrade (Abbildung 1)

  1. HEK293 Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium zu erhalten (DMEM; hohe Glukose, 4 mM Glutamin, Pyruvat) mit 10 % (V/V) fetalen bovine Serum (FBS), 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin bei 37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO2ergänzt.
  2. Samen der Zellen am Vortag Transfektion.
    1. Lösen Sie die Zellen für 5 min bei 37 ° C in 0,05 % Trypsin/PBS mit 0,5 mM EDTA ergänzt. Verwenden Sie 1 mL Trypsin/EDTA für ein 10-cm-Schüssel. Ablöschen mit 10 Bände komplette Medium und Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren. Die Anzahl der Zellen in der Suspension mit einem Hemocytometer49.
    2. Samen 6.0 x 105 HEK293 Zellen pro Bohrloch des 6-Well-Platten in 2 mL komplette Wachstumsmedium. Bereiten Sie so viele Brunnen als die Anzahl der Proben, und zwei weitere Brunnen bzw. für Wildtyp EGFP und eine Mock-transfizierten Probe.
  3. Steuern Sie Confluence (Bereich von Zellen besetzt) unter dem Mikroskop. Transfizieren Sie Zellen bei ~ 70 % Zusammenfluss mit Polyethyleneimine (PEI) Reagenz.
    1. 1h vor Transfektion, die entsprechende Menge an frisch zubereiteten ncAA-Stammlösung hinzufügen alle Brunnen für eine ncAA-Endkonzentration von 0,25-0,5 mM. Hinzu kommt der ncAA alle Brunnen, einschließlich der Wildtyp Positivkontrolle und Mock-transfizierten Zellen, um Unterschiede in der Fluoreszenz-Signale zu verhindern, die durch Beeinflussung der ncAA Zellwachstum verursacht werden können.
      Hinweis: Zur Vorbereitung auf lagerlösungen Auflösen der ncAA 0,1-0,5 M mit 0,2-0,5 M NaOH. Jedoch erfordern einige NcAAs ersten Solubilisierung in DMSO und/oder Neutralisierung von vier Bänden von 1 M HEPES (pH 7,4) vor dem Gebrauch. Im Allgemeinen empfiehlt der Hersteller ein Protokoll eine Stammlösung vorbereiten.
    2. Mischen Sie in einem Microcentrifuge Schlauch 1 µg Plasmid DNA-Codierung für das NcAARS/tRNA-Paar mit 1 µg der Reporter Plasmid DNA (pcDNA3.0-EGFP183TAG- mCherry) getestet werden. Bereiten Sie in getrennten Röhren eine identische Transfektion mit EGFP Wildtyp Referenz und ein mock Transfektion.
      Hinweis: Anzahl der Kopien der tRNA-Kassette, eingebettet in das Plasmid Codierung für das NcAARS/tRNA-paar von der Anwendung abhängt. Zur Erleichterung der Klonen 1 tRNA-Kopie wird empfohlen, wenn verschiedene tRNAs screening während 4 Kopien (wenn auch nicht unbedingt notwendig) empfohlen werden beim Test verschiedener NcAARS oder die Einbeziehung der verschiedenen NcAAs von der gleichen orthogonalen Paar.
    3. Jede Röhre enthält die DNA hinzufügen 100 µL Laktat gepufferter Kochsalzlösung (LBS) mit 20 mM Natrium Laktat bei pH 4.0 und 150 mM NaCl. Kurz mixen.
    4. Jedes Rohr mit der DNA in LBS hinzufügen 6 µL von 1 µg/µL PEI in LBS (Verhältnis PEI/DNA = 3/1 w/w) und Vortex sofort. 10-15 min bei RT inkubieren.
    5. Jedes gut entnehmen Sie 400 µL Zelle Medium und fügen Sie es in der DNA-PEI Mischung, den pH-Wert zu neutralisieren. Dribbeln Sie die DNA-Mischung auf die Zellen.
      Hinweis: DMEM enthält in der Regel Phenol rot als pH-Indikator. Während der Neutralisation Schritt ändert sich die Farbe der Mischung hinzugefügt in der Röhre von gelb (sauer) bis rot (neutral). Zwar bilden die DNA-komplexe in LBS bei sauren pH-Wert den höchsten Transfektion Erträge50gibt, können DNA-PEI komplexe alternativ direkt bei pH 7.4 (z. B. in serumfreien DMEM) gebildet. Wenn DMEM, DNA-komplexe Form verwenden, überspringen Sie die Neutralisation 1.3.5. In jedem Fall ist es wichtig, dass kein Serum in der Mischung vorhanden ist, wenn die komplexe zu bilden.
  4. Ernten Sie Zellen 48 h nach Transfektion.
    1. Aspirieren Sie das Medium und spülen Sie die Zellen einmal mit 2 mL vorgewärmten PBS (37 ° C). Fügen Sie 800 µL PBS ergänzt mit 0,5 mM EDTA und 20 min bei 37 ° c inkubieren Lösen und Aussetzen der Zellen durch pipettieren rauf und runter.
    2. Übertragen Sie die Zellsuspension in 1,5 mL Röhrchen mit 200 µL PBS mit 5 mM MgCl2ergänzt.
    3. Für 2 min bei 800 X g zentrifugieren und den überstand verwerfen.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. In diesem Fall Schockfrosten die Pellets in Flüssigkeit N2 und bei-80 ° C bis zu einem Monat lagern. Tragen Sie immer Auge Schutzbrillen.
  5. 100 µL Tris Lyse Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 % Triton x-100, 1 mM EDTA und frisch hinzugefügten PMSF) um die Zelle Pellets und inkubieren Sie für 30 min auf Eis. Lyse, Wirbel alle 5 min zu erleichtern.
  6. Spin-down zellenrückstand für 10 min bei 4 ° C und 14.000 x g und 90 µL des Überstands in schwarz 96-Well-Platten übertragen. Messen Sie EGFP und mCherry Fluoreszenz mit einem Teller-Reader mit einem Fluoreszenz-Modul ausgestattet.
    Hinweis: Verwenden Sie entsprechende Anregung und Emission Filter für EGFP (λabs: 488 nm; λEm: 509 nm) und mCherry (λabs: 588 nm; λEm: 611 nm). EGFP Messwerte umfassen einen Bereich zwischen den Mindestwert Mock-transfizierten Zellen entnommen und ein Maximalwert, der in der Regel von Wildtyp EGFP vorliegt. Kümmern uns um die korrekte Messung Fenster im Gerät einrichten.
  7. Die Effizienz der ncAA Aufnahme errechnet sich das Verhältnis zwischen der Fluoreszenz der Probe und die Fluoreszenz von Ausdruck der Wildtyp EGFP erhalten. Alle Werte sind auf mCherry Fluoreszenz normalisiert.
    figure-protocol-1

2. genetische Einbindung der NcAAs in GPCRs für Foto-Vernetzung Mapping der Liganden-GPCR Interaktionen (Abbildung 3)

  1. Pflegen Sie HEK293T Zellen in DMEM mit 10 % (V/V) FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin bei 37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO2ergänzt.
  2. Am Vortag Transfektion Samenzellen.
    1. Lösen Sie die Zellen für 5 min bei 37 ° C in 0,05 % Trypsin/PBS mit 0,5 mM EDTA ergänzt. Verwenden Sie 1 mL Trypsin/EDTA für ein 10-cm-Schüssel. Ablöschen mit 10 Bände komplette Medium und Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren rauf und runter. Die Anzahl der Zellen in der Suspension mit einem Hemocytometer49.
    2. 5.0 x 105 293T Samenzellen pro Bohrloch in 2 mL komplette Wachstumsmedium in 6-Well Platten. Bereiten Sie für jede Position zu siebenden 1 gut pro Ligand plus einen Brunnen für die verbindliche Kontrolle33,38. Ein zusätzliche Brunnen mit dem Wildtyp (wt) Rezeptor transfiziert werden kann Ausdruck des mutierten zu überprüfen, das enthalten.
  3. Steuern Sie am nächsten Tag, Zusammenfluss (Bereich von Zellen besetzt) unter dem Mikroskop. Transfizieren Sie Zellen bei ~ 70 % Zusammenfluss mit PEI.
    1. 1h vor Transfektion, hinzufügen Azi alle Brunnen, eine Endkonzentration von 0,5 mM.
      1. Bereiten Sie eine 0,5 M-Stammlösung der Azi. Pro 6-Well-Platte, wiegen 1,2 mg Azi in ein Rohr und lösen Sie es in 15 µL 0,5 M NaOH. Verdünnen Sie der Stammlösung in 1,2 mL komplette Medium und jedes gut fügen Sie 200 µL der Mischung hinzu.
        Hinweis: Bereiten Sie eine frische Stammlösung der Azi für jedes Experiment. Natriumazid Glyko-hat eine kurze Halbwertszeit in wässrigen Lösungen, vor allem bei grundlegenden pH, und die AziRS beinhaltet die intakt, sondern auch die degradierten Form.
    2. Transfizieren einen Gesamtbetrag von 2 µg DNA pro Bohrloch: 1 µg Plasmid Codierung für die Flagge markiert GPCR, wobei ein TAG Codon an die gewünschte Position und 1 µg der Plasmid-Codierung für das orthogonale paar Azi (E2AziRS51 und 4 Kopien von den Cognate gewidmet Suppressor-tRNA BstYam)33,38.
      Hinweis: Wenn Sie einen wt-Vergleich, um Ausdruck zu kontrollieren, transfizieren Sie Plasmid DNA für den wt-Rezeptor in geringerem Umfang. Je nach GPCR, 0,2-0,5 µg Plasmid Codierung der wt-Rezeptor ähnliche Erträge als 1,0 µg des mutierten Plasmids. Transfizieren Sie die gleiche Menge an DNA in alle Wells, füllt sich die fehlenden DNA mit einem Mock (z. B. ein leerer Vektor).
    3. Gehen Sie wie in 1.3.3-1.3.5 beschrieben.
    4. 48 h nach Transfektion, fahren Sie fort mit Schritt 2.4 für Foto-Vernetzung der Liganden oder gehen Sie zu Schritt 2.5 für direkte Ernte und Analyse für die Überprüfung-Rezeptor-Expression.
  4. Foto-Vernetzung des Liganden.
    1. Bereiten Sie eine 1.000 X-Liganden-Stammlösung. Die Peptid-Liganden bei einer Konzentration von 100 µM in DMSO auflösen.
      Hinweis: Die Liganden-Konzentration hängt die Dissoziationskonstante KD der Liganden-GPCR-Interaktion. Eine Endkonzentration von 100 X KD ist empfehlenswert. Wenn der Peptid-Liganden ist ein Salz von Trifluoroacetic Säure (TFA), das Gewicht von TFA bei der Berechnung des Molekulargewichts berücksichtigen (1 X TFA pro grundlegenden Aminosäure in das Peptid). Überlegen Sie auch, dass Peptide im allgemeinen hygroskopisch sind. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren von Peptid-Pulver und öffnen Sie niemals einen Peptid-Container, bis es Raumtemperatur nicht erreicht hat.
    2. Verdünnen Sie die Liganden-Stammlösung 1:1,000 in Bindung Puffer bestehend aus 0,1 % BSA, 0,01 % Triton X 100, 5 mM MgCl2 in HEPES Dissoziation Puffer (HDB), 12,5 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES)-HCl pH 7.4, 140 mM NaCl und 5 mM KCl. Prepare 1 mL pro Azi-GPCR Mutant. Ersetzen Sie die Zelle Medium mit 1 mL der Lösung Liganden. 10 min bei RT inkubieren
      Hinweis: Passen Sie die Inkubationszeit, die spezifische GPCR, Bilanzierung von Liganden Kinetik und Rezeptor Internalisierung an. Verlängerung der Inkubationszeit verbessert nicht die Vernetzung Erträge.
    3. Bestrahlen die Proben für 20 min in einem UV-Vernetzer bei 365 nm mit 5 x 8 W-Röhren und ~ 5 cm Abstand zu den Zellen. Lösen Sie die Zellen, indem pipettieren und in einem 1,5 mL Reaktionsgefäß überführen. Pellet-Zellen für 3 min bei 800 X g und den überstand verwerfen.
    4. Lösen Sie eine Tablette der Protease-Inhibitor (PI) cocktail in 1 mL 25 mM EDTA/H2O, 50 X-Stammlösung zu machen. Aliquoten die PI Lösung auf Lager und bei-20 ° c Lagern Verdünnen Sie die Aktie 50 X 01:25 in HDB und Aufschwemmen der Zelle Pellets in 50 µL 2 x PI im HDB. Schockfrosten Sie Zellen in Flüssigkeit N2.
      Hinweis: Auge Schutzbrillen zu tragen. An dieser Stelle können die Proben bei-80 ° C bis zu einem Monat aufbewahrt werden. Fahren Sie fort mit Schritt 2.6.
  5. Direkte Zellernte.
    1. Aspirieren Sie das Medium. Fügen Sie 800 µL 0,5 mM EDTA in HDB. Inkubieren Sie für 10 min bei RT oder auf Eis.
    2. Lösen Sie die Zellen, indem pipettieren rauf und runter und in ein 1,5 mL Reaktionsgefäß überführen. Fügen Sie 200 µL 5 mM MgCl2 in HDB. Pellet-Zellen für 3 min bei 800 X g und den überstand verwerfen.
    3. Aufschwemmen der Zelle Pellets in 50 µL 2 x PI in HDB und Flash-Einfrieren Flüssigkeit N2. Auge Schutzbrillen zu tragen.
      Hinweis: An dieser Stelle können die Proben bei-80 ° C bis zu 1 Monat aufbewahrt werden.
  6. Zell-Lyse.
    1. Die Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30-45 s und Wirbel kurz Auftauen. Von nun an halten Sie Proben kühl. Pellet-Membranen bei 2.500 x g und 4 ° C für 10 min. verwerfen den überstand, der den Großteil der cytosolischen Proteine enthält.
    2. Aufzuwirbeln Sie die Pellets in 50 µL HEPES Lyse Puffer mit 50 mM HEPES-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 % Glyzerin, 1 % Triton x-100, 1, 5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT und frisch hinzugefügt 2 x PI Cocktail. Mischen Sie gründlich. Lösen Sie die Zellen 30 min auf Eis und Wirbel alle 5 Minuten.
    3. Spin-down zellenrückstand für 10 min bei 14.000 x g und 4 ° C. Sofort übertragen Sie den überstand auf eine frische Reaktionsgefäß.
      Hinweis: Fahren Sie sofort mit der Analyse fort. Die Lysates können bei-20 ° C gelagert werden, jedoch jedem Frost-Tau-Zyklus beeinträchtigt die Qualität der Ergebnisse.
  7. Western-Blot Analyse.
    1. Die Probe vorbereiten, nehmen 3 bis 5 µL lysate und füllen ihn bis zu blau 7 µL mit H2O. Add 2 µL 1 M DVB-t und 4 X 3 µL Probenpuffer mit 63 mM Tris-HCl pH 6,8, 2 % SDS, 10 % Glycerin und 0,04 % Bromphenol. 30 min bei 37 ° c inkubieren
    2. Wenn die GPCR glykosylierten und blass oder verschmierten Bands ist, sind ein Problem, Deglycosylate Proben mit PNGase F Signalintensität zu erhöhen und die Bands zu schärfen. Verwenden Sie 3-5 µL lysate und Deglycosylate in einem Gesamtvolumen von 10 µL nach der Lieferant Protokoll. 3 µL 4 x Probenpuffer hinzufügen.
      Hinweis: Membranproteine sind oft glykosylierten in mehreren Standorten und Staaten, die die Qualität der Auflösung in SDS-PAGE-Analyse beeinträchtigt. Allerdings tun nicht Deglycosylate der Proben für die Analyse der die Expression der Azi-GPCR Mutanten mit Anti-FLAG Antikörper, weil es für die Portion voll glykosylierten, Reife Rezeptor an der Zelloberfläche zu bewerten ist.
    3. Beheben Sie Proben über standard-SDS-PAGE zu und tupfen Sie Transfer-Proteine zu einer PVDF-Membran.
      Vorsicht: Acrylamid ist neurotoxisch. Tragen Sie Handschuhe und Augenschutz.
    4. Blockieren die Membran für 1 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C in 5 % Magermilch in TBS-T mit 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 0,15 M NaCl und 0,1 % Tween 20.
    5. Prüfen Sie die Membran mit einem Anti-Liganden-Antikörper, gefolgt von der HRP-konjugierten Sekundärantikörper. Waschen Sie zwischendurch mit TBS-T. Um die Expression von Azi-GPCR erkennen, untersuchen die Membran mit einem kommerziellen HRP Antikörper (siehe Tabelle der Materialien).
    6. Führen Sie verstärkte Chemilumineszenz (ECL) Reaktion mit hausgemachten ECL-Reagenz und erkennen Sie Signale für 5 min in der Dunkelheit zu.

(3) ultraschnelle Bioorthogonal Kennzeichnung von GPCRs auf Live Säugerzellen

Hinweis: Das Protokoll ist optimiert für 4-Well gekammerten Deckgläsern (gut Bereich = 2,2 cm2). Für Größen gut muss das Protokoll entsprechend skaliert werden.

  1. Oberflächenbeschichtung der Objektträger. Führen Sie die ganze Prozedur unter einer sterilen Kapuze.
    1. Bereiten Sie eine Poly-D-Lysin-Hydrobromide (MW = 500-550 kDa) Stammlösung (PDL) in einer Konzentration von 1 mg/mL in 50 mM Borat Puffer (pH 8,5). Lagerung bei 4 ° C für bis zu 6 Monaten. Nicht einfrieren.
    2. Verdünnen der PDL Stammlösung 01:40 in sterilen Ultrareines Wasser, eine Endkonzentration von 25 µg/mL (Arbeitslösung), dann die Lösung durch einen Sterilfilter 0,22 µm filtern.
      Hinweis: Die Arbeitslösung kann bis zu 3 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden.
    3. Bedecken Sie vollständig den Boden des jede Vertiefung der Mikroskopie Folie mit 500 µL Arbeitslösung PDL. 20 min bei RT inkubieren und Aspirieren der PDL funktionierende Lösung.
      Hinweis: Die PDL-Arbeitslösung kann bis zu dreimal verwendet werden. Wenn die Lösung werden wiederverwendet muss, die verwendete Lösung von beschichteten Folien auf ein frisches steriles Röhrchen übertragen und das Rohr entsprechend zu kennzeichnen. Mischen Sie niemals die recycelte Lösung mit frischer Lösung.
    4. Spülen Sie je gut 3 X mit ~ 700 µl steriler Ultrareines Wasser und mindestens 1 Stunde trocknen lassen.
      Hinweis: Es ist sehr wichtig, die Brunnen genau, zu spülen, da Rückstände von der PDL-Lösung, die Zellen giftig sind. Die beschichteten Folien kann bis zu einer Woche bei 4 ° c gelagert oder sofort für die Mikroskopie verwendet werden
  2. Pflegen Sie HEK293T Zellen in DMEM mit 10 % (V/V) FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin bei 37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO2ergänzt.
  3. Am Vortag Transfektion Samenzellen.
    1. Lösen Sie die Zellen für 5 min bei 37 ° C in 0,05 % Trypsin/PBS mit 0,5 mM EDTA ergänzt. Verwenden Sie 1 mL Trypsin/EDTA für ein 10-cm-Schüssel. Ablöschen mit 10 Bände komplette Medium und Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren. Die Anzahl der Zellen in der Suspension mit einem Hemocytometer49.
    2. 1.0 x 105 HEK293T Samenzellen pro Bohrloch (Bereich 2,2 cm ²) in 600 µL Farbstoff frei komplette DMEM.
      Hinweis: Für imaging-Zwecke, ist es sehr bequem, von Anfang an in einem Medium zu arbeiten, die keiner Farbstoff enthält. Farbstoff freie DMEM Formulierungen sind im Handel erhältlich.
  4. Steuern Sie Zusammenfluss (Bereich von Zellen besetzt) unter dem Mikroskop und transfizieren Sie die Zellen bei ~ 70 % Zusammenfluss mit einem Lipid-basierte Transfection Reagens.
    1. 1 h vor Transfektion, bereiten Sie eine frische 100 mM Stammlösung von TCO * K in 0,2 M NaOH und 15 % (V/V) DMSO.
    2. Pro Well, mix 3 µl der TCO * K-Stammlösung mit 12 µL 1 M HEPES pH 7.4. Sanft fügen Sie die Lösung in die Vertiefungen für eine endgültige TCO * K-Konzentration von 0,5 mM.
    3. Bereiten Sie einen Gesamtbetrag von 500 ng DNA pro Bohrloch. In einem Microcentrifuge Schlauch verdünnen 200 ng des PcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP, 200 ng des Plasmids Codierung für die MbPylRSAF/tRNAPyl orthogonal Paar (vier Kassetten der tRNAM15) und 100 ng PcDNA3.1_Arrestin3 Plasmid in 50 µL Medium (Farbstoff frei, Serum-frei, Antibiotikum frei).
      Hinweis: Im Allgemeinen ist Co-Transfektion von Arrestin nicht GPCR Verinnerlichung zu beachten. Jedoch beschleunigt Co transfecting Arrestin3 Internalisierung von CRF1R, das ist sehr praktisch bei der Analyse der Internalisierung von vielen Mutanten.
    4. Verdünnen Sie 1,25 µL des Lipid-basierte Transfection Reagens (2,5 µL pro 1 µg DNA) in 50 µL Medium (Farbstoff frei, Serum-frei, Antibiotikum frei) und fügen Sie die Lösung auf die DNA-Mischung. Vortex sofort und inkubieren Sie 5-10 min bei RT. Add DNA-Lipid-komplexe zu den Zellen.
      Hinweis: Nach unserer Erfahrung transfiziert die Morphologie der Zellen mit Lipid-basierte Transfektion Blicke mehr physiologische gegenüber, die von Zellen transfiziert mit PEI. Da PEI höhere Transfection Leistungsfähigkeit gibt, sollte PEI für downstream-Anwendungen wie Western-Blot, bevorzugt sein, während Lipid-basierte Transfektion eine bessere Wahl ist zu transfizieren Zellen für imaging-Experimente.
  5. 24 h nach Transfektion Label den Rezeptor mit Fluoreszenz-Farbstoffen.
    1. Bereiten Sie eine 0,5 mM Farbstoff-kurz Stammlösung in DMSO und eine 10 mg/mL DNA-Färbung Farbstoff Stammlösung in ultra-reinen H2O.
    2. Übertragen Sie 100 µL Medium aus jedem Brunnen in einem 1,5 mL Reaktionsgefäß. Fügen Sie 1,8 µL der Stammlösung Farbstoff-kurz und 0,3 µL der Stammlösung Farbstoff Färbung DNA. Die Farbstoffe zurück zum Brunnen-haltigem Medium übertragen und 5 min bei 37 ° c inkubieren
      Hinweis: Kurz-Orange-fluoreszierenden Farbstoff hat eine Endkonzentration von 1,5 µM.
    3. Aspirieren Sie das Medium und spülen Sie sanft die Zellen zweimal mit PBS, überschüssige Farbe zu entfernen. Fügen Sie 600 µL kompletten Farbstoff frei Wachstumsmedium vorgewärmt auf 37 ° C.
  6. Fluoreszenz-Mikroskopie und Rezeptor Internalisierung.
    1. Visualisieren der beschrifteten Rezeptoren unter 63 x (oder ähnlich) Vergrößerung mit Hilfe von Filtern für GFP (λabs: 488 nm; λEm: 509 nm), Orange-fluoreszierenden Farbstoff (λabs: 550 nm; λEm: 570 nm) und DNA-Farbstoff (λ Färbung ABS: 350 nm; Λ-Em: 461 nm). Nehmen Sie ein Bild mit jeder Filter vor der Aktivierung des Rezeptors.
    2. Förderung der Rezeptor Internalisierung mit 200 nM Ucn1.
      1. Bereiten Sie eine 1.000 x Ucn1-Stammlösung von 200 µM in DMSO.
        Hinweis: Abhängig von der Löslichkeit des Peptids möglicherweise Sie den Bestand in reinem Wasser oder Puffer vorzubereiten.
      2. Übertragen Sie 100 µL Medium aus einem Brunnen in einem 1,5 mL Reaktionsgefäß und fügen Sie 0,6 µL der Stammlösung der Peptid-Agonist. Übertragen Sie den mittleren Rücken in den Brunnen.
      3. Die Internalisierung unter dem Mikroskop zu beobachten. Nehmen Sie Bilder nach dem eindeutig nachweisbar auftreten der Internalisierung (10-15 Minuten bis Stunden, je nach Rezeptor und Überexpression des Arrestins) mit den zuvor genannten filtern.

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Ergebnisse

Die Umrisse der Fluoreszenz-Test ist in Abbildung 1dargestellt. Der Test ist in drei Anwendungen eingesetzt. An erster Stelle werden eine Reihe von tRNA-Varianten für den Einbau des Lys(Boc) durch die Pyl orthogonal paar gezeigt. Lys(BOC) ist eine Aminosäure Pyl sterisch ähnlich. Pyl nicht kommerziell verfügbar ist, wird Lys(Boc) häufig als standard Substrat für die PylRS verwendet. Die abgeschirmten tRNAs basieren auf der tRNAPyl. Jede tRNA-Varian...

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Diskussion

Das Protokoll beschreibt eine einfache und zuverlässige Assays zur Bewertung der Effizienz der orthogonalen Paare für die Einbindung der NcAAs in Proteine in Säugetierzellen. Der Hauptvorteil dieser Methode in Bezug auf weit verbreiteten Tests basierend auf FACS ist, dass es die gleichzeitige Zubereitung und Messung einer größeren Anzahl von Proben ermöglicht und liefert Daten, die leicht mit einem normalen Software analysiert werden. Die Verfügbarkeit einer Medium-Durchsatz-Methode zur orthogonalen Paare in Säugetierzel...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Konflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) unter Stipendien CO822/2-1 (Emmy-Noether-Programm) und CO822/3-1 bis I.C gegründet

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Materialien

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Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamid 30% (37,5:1)Carl Roth3029.1
Ammoniumpersulfat (APS)Carl Roth9592.2
p-Azidophenylalanin (Azi)BachemF-3075.0001
BorsäureSigma AldrichB6768
BromphenolblauSigma-AldrichB0126-25G
Rinderserumalbumin (BSA)Carl Roth8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysin (Lys(Z))NovaBiochem8540430100
Cyclooctin-L-lysin (SCOK)SichemSC-8000
DMEMLife Technologies41966052
DMSOCarl RothA994.2
DTTCarl Roth6908.1
Reagenz (ECL) mit erhöhter Chemilumineszenzhausgemachtes10 mg/l Luminol in 0,1 M Tris-HCl pH 8,6 ; 1100 mg/l  p-Cumarsäure in DMSO ; 30 % H2O2 (1.000 : 100 : 0,3)
EDTACarl Roth8043.1
EGTACarl Roth3054.1
Endo-Bicyclo[6.1.0]nonyn-L-lysin (BCNK)SichemSC-8014
FBSThermo Fisher ( Gibco)10270106
FluoroBrite DMEMThermo Fisher (Gibco)A1896701
GlycerinCarl Roth7533.1
GlycinCarl Roth3908.3
HEPESCarl Roth9105.3
Hoechst 33342Sigma AldrichB2261
KClCarl Roth6781.3
Lipofectamin 2000 Thermo Fisher11668019
LuminolApplichemA2185,0005
MethanolCarl Roth0082,3
MgCl2Carl Roth2189,2
NaClCarl RothHN00.2
Na-LactatSigma-Aldrich71718-10G
NaOHGrü ssing121551000
PBSSigma-AldrichP5493-1L
p-CumarsäureSigma-AldrichC9008-1G
Poly-D-LysinhydrobromidCorning354210
PEIPolysciences23966
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher (Gibco)11548876 (15140-122)
PMSFCarl Roth6367.1
PNGase FNEBP0704L
ProteaseinhibitorRoche11873580001
PVDF-Membran Immobilon-PMilliporeIPVH00010
Magermilchpulver Sigma70166
Natriumdodecylsulfat (SDS)Carl RothCN30.2
Tetrazin-Cy3Jena BioscienceCLK-014-05
Tetramethylethylendiamin (TEMED)Carl Roth2367.3
trans-Cycloocten-L-lysin (TCO*K)SichemSC-8008
TRISSigma-AldrichT1503
Triton X-100Carl Roth3051.4
Trypsin 2.5%Thermo Fisher (Gibco)15090046
Tween 20Carl Roth9127.2
Wasserstoffperoxid (30%)Merck1.07210.0250
Cell lines
HEK293 ZellenDeutsch Kollektion von Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-305
HEK293T cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-635<
strong>Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nmBio-Budget Technologies GmbH40-BLX-E3655 x 8 Watt
Röhren Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega BMG LABTECH
strong>Plasmids
Plasmid E2AziRSDas huminisierte Gen für E2AziRS wurde von Geneart (Life Technologies)Plasmid synthetisiert,das 4 Tandemkopien der Suppressor-tRNA Bst-Yam, die vom humanen U6-Promotor angetrieben wird, und eine Kopie eines humanisierten Gens für die verstärkte Variante der Azi-tRNA-Synthetase (EAziRS), die von einem PGK-Promotor
angetrieben wird, enthält.POI-TAG-mutierte Plasmide Plasmide, die für den POI kodieren, der vom CMV-Promotor gesteuert wird, C-terminal mit dem FLAG-Tag fusioniert ist und an der gewünschten Position ein TAG-Codon trägt 
CRF1R-95TAG-EGFPkloniert in der MCS von pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFPKloniert in der MCS von pcDNA3.1
Arrestin3-FLAGsynthetisiert von Genart (Life Technologies)Kloniert in der MCS von pcDNA3.1
Antikörpern
Anti-FLAG-HRP M2 Antikörperkonjugat Sigma-AldrichA8592 monoklonal, hergestellt im Mausklon M2
Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP-AntikörperSanta Cruzsc-2004
Kaninchen-Anti-CRF-AntikörperhausgemachterPBL #rC69polyklonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., und Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Kaninchen-anti-Ucn1-AntikörperhausgemachtPBL #5779polyklonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., und Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

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