Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.
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Methodenartikel
Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die genetische Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) über Bernstein Stopp-Codon Unterdrückung ist eine leistungsstarke Technik, künstliche Sonden und reaktive Moieties auf Proteine direkt in der live Zelle zu installieren. Jede ncAA ist durch eine spezielle orthogonale Suppressor-tRNA/amino-Acyl-tRNA-synthestase (AARS) Paar aufgenommen, die in den Wirtsorganismus importiert wird. Die Einbeziehung Effizienz der verschiedenen NcAAs kann stark unterschiedlich und in einigen Fällen unbefriedigend sein. Orthogonale Paare können verbessert werden durch die Manipulation der AARS oder der tRNA. Gerichtete Evolution von tRNA oder AARS mit großen Bibliotheken und tot/lebendig Auswahlmethoden sind jedoch nicht machbar in Säugetierzellen. Hier ist eine einfache und robuste Fluoreszenz basierende Assays, die Effizienz der orthogonalen Paare in Säugetierzellen zu bewerten präsentiert. Der Test ermöglicht screening Dutzende bis Hunderte von AARS/tRNA-Varianten mit mäßigem Aufwand und innerhalb eines angemessenen Zeitraums. Verwendung des Assays neue tRNAs generieren, die deutlich die Effizienz der Pyrrolysin orthogonalen System beschrieben ist, zusammen mit der Anwendung von NcAAs zur Erforschung der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), die Objekte eine für ncAA Herausforderung sind Mutagenese. Erstens werden durch die systematische Integration eine Foto-Vernetzung ncAA in der extrazellulären Oberfläche eines Rezeptors, Bindungsstellen der verschiedenen Liganden auf den intakten Rezeptor direkt in der live Zelle zugeordnet. Zweite, durch den Einbau von NcAAs der letzten Generation in einem GPCR, ultraschnelle Katalysator-freie Rezeptor Kennzeichnung mit einem fluoreszierenden Farbstoff ist gezeigt hat, nutzt die Bioorthogonal Belastung gefördert inverse Diels Alder Cycloaddition (SPIEDAC) auf die live-Zelle. Wie NcAAs in der Regel auf jedem Protein unabhängig von dessen Größe angewendet werden kann, ist die Methode von allgemeinem Interesse für eine Reihe von Anwendungen. Darüber hinaus ncAA Einarbeitung erfordert keine spezielle Ausrüstung und erfolgt im standard Biochemie Labor.
Einleitung
Die genetische Einbeziehung der chemischen Sonden in Proteinen ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung der strukturellen und dynamischen Aspekte der Proteinfunktion direkt im heimischen Kontext der live Zelle zu erleichtern. Heute können Hunderte von nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs), ausgestattet mit den verschiedensten chemischen Gruppen ortspezifisch Proteine durch Biosynthese1,2,3,4integriert werden. Dazwischen findet man lichtempfindliche NcAAs wie Foto-Vernetzer5, Foto-Käfig6
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Protokoll
(1) Fluoreszenz-basierten Screening der Einbeziehung Wirkungsgrade (Abbildung 1)
- HEK293 Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium zu erhalten (DMEM; hohe Glukose, 4 mM Glutamin, Pyruvat) mit 10 % (V/V) fetalen bovine Serum (FBS), 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin bei 37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 % und 5 % CO2ergänzt.
- Samen der Zellen am Vortag Transfektion.
- Lösen Sie die Zellen für 5 min bei 37 ° C in 0,05 % Trypsin/PBS mit 0,5 mM EDTA ergänzt. Verwenden Sie 1 mL Trypsin/EDTA für ein 10-cm-Schüssel. Ablöschen mit 10 Bände komplette Medium und Aufschwemmen der Zellen durch pipettieren.....
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Ergebnisse
Die Umrisse der Fluoreszenz-Test ist in Abbildung 1dargestellt. Der Test ist in drei Anwendungen eingesetzt. An erster Stelle werden eine Reihe von tRNA-Varianten für den Einbau des Lys(Boc) durch die Pyl orthogonal paar gezeigt. Lys(BOC) ist eine Aminosäure Pyl sterisch ähnlich. Pyl nicht kommerziell verfügbar ist, wird Lys(Boc) häufig als standard Substrat für die PylRS verwendet. Die abgeschirmten tRNAs basieren auf der tRNAPyl. Jede tRNA-Varian.......
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Diskussion
Das Protokoll beschreibt eine einfache und zuverlässige Assays zur Bewertung der Effizienz der orthogonalen Paare für die Einbindung der NcAAs in Proteine in Säugetierzellen. Der Hauptvorteil dieser Methode in Bezug auf weit verbreiteten Tests basierend auf FACS ist, dass es die gleichzeitige Zubereitung und Messung einer größeren Anzahl von Proben ermöglicht und liefert Daten, die leicht mit einem normalen Software analysiert werden. Die Verfügbarkeit einer Medium-Durchsatz-Methode zur orthogonalen Paare in Säugetierzel.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Konflikte zu erklären.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) unter Stipendien CO822/2-1 (Emmy-Noether-Programm) und CO822/3-1 bis I.C gegründet
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Materialien
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Chemicals | |||
| Acryamide/Bisacrylamid 30% (37,5:1) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Ammoniumpersulfat (APS) | Carl Roth | 9592.2 | |
| p-Azidophenylalanin (Azi) | Bachem | F-3075.0001 | |
| Borsäure | Sigma Aldrich | B6768 | |
| Bromphenolblau | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Carl Roth | 8076.2 | |
| Carbobenzyloxy-L-lysin (Lys(Z)) | NovaBiochem | 8540430100 | |
| Cyclooctin-L-lysin (SCOK) | Sichem | SC-8000 | |
| DMEM | Life Technologies | 41966052 | |
| DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
| DTT | Carl Roth | 6908.1 | |
| Reagenz (ECL) mit erhöhter Chemilumineszenz | hausgemachtes | 10 mg/l Luminol in 0,1 M Tris-HCl pH 8,6 ; 1100 mg/l p-Cumarsäure in DMSO ; 30 % H2O2 (1.000 : 100 : 0,3) | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.1 | |
| Endo-Bicyclo[6.1.0]nonyn-L-lysin (BCNK) | Sichem | SC-8014 | |
| FBS | Thermo Fisher ( Gibco) | 10270106 | |
| FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher (Gibco) | A1896701 | |
| Glycerin | Carl Roth | 7533.1 | |
| Glycin | Carl Roth | 3908.3 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| KCl | Carl Roth | 6781.3 | |
| Lipofectamin 2000 | Thermo Fisher | 11668019 | |
| Luminol | Applichem | A2185,0005 | |
| Methanol | Carl Roth | 0082,3 | |
| MgCl2 | Carl Roth | 2189,2 | |
| NaCl | Carl Roth | HN00.2 | |
| Na-Lactat | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
| NaOH | Grü ssing | 121551000 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| p-Cumarsäure | Sigma-Aldrich | C9008-1G | |
| Poly-D-Lysinhydrobromid | Corning | 354210 | |
| PEI | Polysciences | 23966 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher (Gibco) | 11548876 (15140-122) | |
| PMSF | Carl Roth | 6367.1 | |
| PNGase F | NEB | P0704L | |
| Proteaseinhibitor | Roche | 11873580001 | |
| PVDF-Membran Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Magermilchpulver | Sigma | 70166 | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | Carl Roth | CN30.2 | |
| Tetrazin-Cy3 | Jena Bioscience | CLK-014-05 | |
| Tetramethylethylendiamin (TEMED) | Carl Roth | 2367.3 | |
| trans-Cycloocten-L-lysin (TCO*K) | Sichem | SC-8008 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Trypsin 2.5% | Thermo Fisher (Gibco) | 15090046 | |
| Tween 20 | Carl Roth | 9127.2 | |
| Wasserstoffperoxid (30%) | Merck | 1.07210.0250 | |
| Cell lines | |||
| HEK293 Zellen | Deutsch Kollektion von Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) | ACC-305 | |
| HEK293T cells | German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ) | ACC-635< | |
| strong>Equipment | |||
| Crosslinker Bio-Link 365 nm | Bio-Budget Technologies GmbH | 40-BLX-E365 | 5 x 8 Watt |
| Röhren Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega | BMG LABTECH | ||
| strong>Plasmids | |||
| Plasmid E2AziRS | Das huminisierte Gen für E2AziRS wurde von Geneart (Life Technologies)Plasmid synthetisiert, | das 4 Tandemkopien der Suppressor-tRNA Bst-Yam, die vom humanen U6-Promotor angetrieben wird, und eine Kopie eines humanisierten Gens für die verstärkte Variante der Azi-tRNA-Synthetase (EAziRS), die von einem PGK-Promotor | |
| angetrieben wird, enthält.POI-TAG-mutierte Plasmide Plasmide | , die für den POI kodieren, der vom CMV-Promotor gesteuert wird, C-terminal mit dem FLAG-Tag fusioniert ist und an der gewünschten Position ein TAG-Codon trägt | ||
| CRF1R-95TAG-EGFP | kloniert in der MCS von pcDNA3.1 | ||
| HA-PTH1R-79TAG-CFP | Kloniert in der MCS von pcDNA3.1 | ||
| Arrestin3-FLAG | synthetisiert von Genart (Life Technologies) | Kloniert in der MCS von pcDNA3.1 | |
| Antikörpern | |||
| Anti-FLAG-HRP M2 Antikörperkonjugat | Sigma-Aldrich | A8592 | monoklonal, hergestellt im Mausklon M2 |
| Ziegen-Anti-Kaninchen-HRP-Antikörper | Santa Cruz | sc-2004 | |
| Kaninchen-Anti-CRF-Antikörper | hausgemachter | PBL #rC69 | polyklonal Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., und Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999) |
| Kaninchen-anti-Ucn1-Antikörper | hausgemacht | PBL #5779 | polyklonal Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., und Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999) |
Referenzen
- Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-....
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Nachdrucke und Genehmigungen
