Wachsende Proteinkristallen mit unterschiedlichen Abmessungen mit automatisierten Kristallisation gepaart mit In Situ dynamische Lichtstreuung

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die kontrollierte Produktion von Protein Mikrokristalle. Das Verfahren nutzt ein automatisierte Gerät ermöglicht kontrollierte Manipulation verschiedener Parameter der Kristallisation. Die Protein-Kristallisation ist durch kontrollierte und Automatische Zugabe von Kristallisation Lösungen während der Überwachung und Untersuchung der Radius-Verteilung von Partikeln in der Kristallisation Tropfen durchgeführt.

Zusammenfassung

Das automatisierte Kristallisation-Gerät ist eine patentierte Technik¹ speziell für die Überwachung der Protein-Kristallisation-Experimente mit dem Ziel, die Keimbildung und Kristallwachstum zur gewünschten Größen von Proteinkristallen präzise manövrieren. Die kontrollierte Kristallisation basiert auf Probe Untersuchung mit in Situ dynamisches Licht Streuung (DLS), während alle optische Veränderungen in den Tropfen online mit Hilfe eines Mikroskops, gekoppelt mit einer CCD-Kamera, so dass eine vollständige überwacht werden Untersuchung von Protein-Tröpfchen in allen Phasen der Kristallisation. Die Verwendung von in Situ DLS Messungen während des gesamten Experiments ermöglicht eine genaue Identifizierung der hoch übersättigten Proteinlösung Übergang zu einer neuen Phase – die Bildung von Kristall-Kernen. Durch die Identifizierung der Keimbildung Phase Protein, kann die Kristallisation von großen Proteinkristallen für die Produktion von Protein Mikrokristalle optimiert werden. Das experimentelle Protokoll zeigt eine interaktive Kristallisation Ansatz basierend auf präzise automatisierte Schritte wie Fällungsmittel hinaus Wasserverdunstung für induzierende hohe Übersättigung und Probenverdünnung zur Verlangsamung induzierte homogenen Keimbildung oder Rückwärtsfahren Phasenübergänge.

Einleitung

In den letzten Jahren hat das Wachstum von Eiweiß Mikro- und Nanokristalle die Aufmerksamkeit der Proteinkristallographie Gemeinschaft, vor allem mit der kontinuierlichen Entwicklung von seriellen Femtosekunden Kristallographie (SFX) erfasst. Durch die Brillanz der neuartigen Röntgen Strahlung Quellen und basierend auf den erfolgreichen Ergebnissen so weit, die Produktion von Protein Mikro- und Nanokristalle geworden von hoher Relevanz, einem hohen Anspruch an die Vorbereitung von solchen kristalline Suspensionen posiert ^{2 , 3}. aufgrund der kleinen Kristall-Größenbereich benötigt für die Datenerfassung auf freie-Elektronen-Laser (XFELs) und die begrenzte Verfügbarkeit von experimentellen Strahlzeit, Charakterisierung der Probe vor der Datenerhebung ist wichtig. Am häufigsten verwendeten Techniken, Eiweiß Mikro- oder Nanocrystal Suspensionen zu charakterisieren sind bis jetzt Elektronenmikroskopie und Röntgenbeugung Pulver.

Bisher wurden verschiedene Ansätze von gemeinsamen Kristallisation Methoden mit dem Ziel, Masse Mengen von Proteinkristallen mit Abmessungen im Mikrometerbereich kleine produzieren angepasst. Das Batch-Verfahren dient zum schnellen mischen hoch konzentriertes Eiweiß und Fällungsmittel Lösungen, so zwingt die Beispiellösung zu einer hoch übersättigten Phase wo Nanocrystallization favorisierte⁴sein könnte. Andere Methoden sind die Zerkleinerung von großen Proteinkristallen um ein Kristall-Gülle bilden dienen als nanokristallinen Suspensionen für Daten Sammlung⁵verwendet werden können. Allerdings könnte die Ergebnisse manchmal verminderte Beugung Qualität führen, da verschlechterte Kristalle untere inneren Ordnung haben. Nanocrystallization basierend auf freie Schnittstelle Diffusion ist auch Alternative zur Verfügung, wo Proteinlösung in kleinen Mengen mit einer hochkonzentrierten Fällungsmittel Lösung³hinzugefügt. Jedoch scheinen unter alle Techniken, die effizientesten Methoden der Batch-Kristallisation und weitere innovative manipulativen Techniken, die mit Dampf-Diffusions-Methoden in Tropfen⁶sitzen.

Im Allgemeinen muss für Kristallisation eines Proteins eine Energiebarriere gekreuzt werden, um Keimbildung - thermodynamischen zunächst Kristallbildung zu unterstützen. Um die Proteinlösung von einem thermodynamisch stabilen Zustand zu Übersättigung zu bewegen und schließlich um einen Phasenübergang zu induzieren, einige Variablen, die im Zusammenhang mit der Proteinlösung geändert werden müssen. Solche Variablen sind in der Regel die Konzentration der Proteinlösung, Veränderungen der Umwelt (zB., Temperatur, Luftfeuchtigkeit), Lösungsmittel Eigenschaften (z.B., pH, Ionenstärke), Konzentration und Puffer Eigenschaften, etc.^{7 ,8} eine Übersicht der Probe-Parameter, die geändert werden können ist in der Regel mittels Phasendiagramme, wodurch verschiedene Formen der Präsentation, wie Löslichkeit Diagramme, Keimbildung Phasendiagramme oder noch detailliertere vertreten Beschreibungen, dreidimensionale oder komplexere Diagramme in Erwägung^8,9,10kommen können. Die attraktivsten Phase Diagramm-Typen sind in der Regel zweidimensional, wo die wichtigsten Variable ist die Konzentration des Proteins als Funktion der anderen Parameter, während die übrigen Parameter konstant^6,11gehalten werden. Sobald eine oder mehrere Kerne gebildet sind, können größere Kristalle wachsen, durch die Aufnahme von zusätzlichen Protein aus der Bulk-Lösung. Wenn Mikro- und Nanocrystal Produktion mit dem Ziel, ist solch ein konventionelle Kristallisation Ansatz nicht möglich mehr aufgrund der geringen Anzahl von Kristallen, die in der Lösung vorhanden sind. Nanokristallinen Suspensionen haben in der Regel reich an kristallinen Einheiten, so sein, dass die Kristallisation Weg hat neu justiert werden, so dass es eine Maxima der Keimbildung Ereignisse in der Probe vorhanden. Dies erfordert in der Folge die Untersuchung einiger neuer, bis jetzt unerforschten Keimbildung Wege für Proteine, die auch noch nicht vollständig verstandenen^12,13. Basierend auf den Phase Diagramm Grundlagen erwähnt, die klassische Theorie wurde erweitert um eine neue Hypothese, wo Keimbildung als zweistufigen Mechanismus beschrieben wird: auf den ersten, ein Übergang zu einer höheren Proteinkonzentration erfolgt (Dichte Flüssigkeit Phase) und zweitens einen Übergang von einer dichten-reiche Phase mit einer höheren inneren Ordnung (Kristall Kerne mit Gitter Architektur)^14,15,16. Protein-Kristallisation ist empfindlich auf viele Faktoren, und daher bei der Kristallisation Rezepte neu justiert werden, zu verschiedenen großen Kristallen führen, die Rezepte nicht immer auf stützen Vorkenntnisse. Neue Erkenntnisse müssen für jedes einzelne Protein-Ziel festgelegt werden: Anpassung der Puffer Zusammensetzung, Reinheit und Stabilität der Probe, präzise Kenntnisse der Protein Löslichkeit, etc..

Dynamische Lichtstreuung ist heute eine etablierte Methode zur Analyse und Optimierung von Protein Kristallisation Prozessen wegen einem breiten Größenbereich von Teilchen, die untersucht werden können: aus Monomeren Proteinen Nanokristallen und kleine Mikrokristalle. Die Methode nutzt, dass Partikel in Lösung Brownsche Bewegung unterzogen und, dass die durchschnittliche Geschwindigkeit dieser Bewegung von der Partikelgröße, ihre thermische Energie und der Viskosität des Mediums und der partikelgeometrie bestimmt wird. Zunächst wird das flüssige Medium durch eine kohärente Lichtquelle mit dem Einsatz eines Lasers beleuchtet. Durch Partikel gestreute Licht bildet sich ein Interferenzmuster. Weil die Partikel in ständiger Bewegung sind ändert sich das Interferenzmuster auch dauerhaft. Wenn man in eine bestimmte Richtung, können intensitätsschwankungen beobachtet werden. Diese Schwankungen zeigen jetzt die Teilchenbewegung verursacht durch die Brownsche Bewegung. Aus der gemessenen intensitätsschwankungen wird eine Autokorrelationsfunktion (ACF) berechnet. Eine Analyse des ACF geben ein Maß für die Geschwindigkeitsverteilung (genauer gesagt die Diffusionskoeffizienten) von Partikeln und mithilfe der Stokes-Einstein-Gleichung, ist ein Partikel Radius Verteilung¹⁷umgebaut. Zusätzlicher Informationen zum DLS-Funktionalität und Funktionsweise finden Sie in verschiedenen Publikationen und Bücher^18,19.

Hier wenden wir und beschreiben eine einzigartige automatisierte Kristallisation Gerät, XtalController900, eine verbesserte Version der XtalController Technologie⁶, gerade für die Überwachung der interaktiven Protein Kristallisation Experimente entwickelt. Diese Technik zeigt ein hohes potential für Identifikation und Verfolgung von Keimbildung Ereignisse in Echtzeit, ermöglicht ein präzises Manövrieren durch die Kristallisation Phasendiagramm. Dieses besondere Kristallisation Verfahren soll Protein Kristallisation erhalten qualitativ hochwertige Eiweiß Mikro- und Nanokristalle, die geeignet sind für Anwendungen unter Verwendung von Mikro-Fokus Synchrotron Röntgenquellen, Elektronenbeugung, optimieren oder SFX.

Protokoll

Hinweis: Während das gesamte Protokoll wird das Mikro-Dosiersystem für die Zugabe von Wasser verwendet als Pump0 bezeichnet, werden während der Mikro-Dosiersystem für die Zugabe von Fällungsmittel verwendet Pump1 aufgerufen wird. Die Ergebnisse dieses Experiments werden weiter diskutiert und als THM2_micro-Kristalle bezeichnet.

1. Parameter und Lösung Setup

1. Filtern Sie 16 mL Na-Tartrat-Lösung (1,2 M) und 16 mL destilliertem Wasser mit einem 0,2 µm sterile Spritze Filter.
   Hinweis: Die Na-Tartrat-Lösung stellt die Fällungsmittel Lösung für die Kristallisation Experiment dar.
2. Füllen Sie das Fällungsmittel und Wasserflaschen mit 5 mL der gefilterte Lösungen.
   Hinweis: Die Flaschen haben eine maximale Kapazität von 5 mL.
3. Montieren Sie die Flaschen in die Pumpe Halter der experimentellen Kammer.
4. Legen Sie die experimentellen Parameter im Softwarefenster auf folgende Werte: Temperatur bei 20 ° C, Relative Luftfeuchtigkeit bei 20 und Lösungsmittel wie Wasser.
   Hinweis: Abbildung 2 zeigt das Anzeigefenster, wo der Benutzer die korrekten Werte für jeden Parameter wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Lösungsmittel einfügen können. Das Softwarefenster zeigt auch einige zusätzliche Parameter wie Zusatzstoffe. Dies ist nur wichtig bei versuchen, wo sind Zusatzstoffe in das Fällungsmittel Lösung.
5. Öffnen Sie die vordere Klappe der experimentellen Kammer und entfernen Sie den Deckglas Träger zu.
6. Legen Sie ein sauberes und silikonisierte Deckglas auf dem Träger und legen Sie sie wieder in das Gerät.
   Hinweis: Das Deckglas hat eine Größe von 2,2 cm.
7. Schließen Sie die experimentelle Kammer um den Umgebungsbedingungen ab Schritt 1.4 zu sichern.
   Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

2. Micro-Dosiersystemen Anpassung

1. Schalter ON Pump0 über die wichtigsten Merkmale in Abbildung 3 Pumpen und erzeugen einen Wasserstrom.
   Hinweis: Die Wasser-Strom-Flugbahn wird basierend auf einige Pumpe-Eigenschaften erstellt, die angepasst werden können. Abbildung 3 zeigt die Hauptpumpe Merkmale und die optimalen Werte, die für dieses Experiment verwendet werden soll.
2. Passen Sie den Wasserstrahl, mit dem Ziel Position in Richtung der Mitte des das Deckglas durch seine ausgewiesenen Einstellschraube manuell betätigen. Wechseln Sie aus Pump0.
3. Schalter ON Pump1 und erstellen Sie ein Flüssigkeitsstrom, wie zuvor in Schritt 2.1 getan. Passen Sie die Stream-Position des Pump1 auf die Position für Pump0 fest. Wechseln Sie aus Pump1.
4. Gebrauchte Deckglas durch eine neue ersetzen und eine für die Kristallisation Experiment reinigen.
   Hinweis: Weiche Tücher sind in der Regel empfohlen, für die Reinigung der neuen Deckglas aus verbleibenden Staub vor der Kristallisation Experiment verwendet wird.

3. setzen einen Thaumatin-Tropfen in der experimentellen Kammer

1. Erstellen Sie eine neue experimentelle Datei mit dem Softwarepaket. Geben Sie die folgende Informationen in der experimentellen Datei: Eiweiß (Thaumatin aus Thaumatococcus Daniellii), Proteinkonzentration (14 mg/mL), Fällungsmittel (Na-Tartrat) und Fällungsmittel Konzentration (1,2 M).
   Hinweis: Diese Informationen werden für die automatisierte Berechnung von Fällungsmittel und Protein-Konzentration während der Kristallisation Experiment dienen.
2. Laden Sie die neue Experiment-Datei alle Informationen aus Schritt 3.1 aktivieren.
3. Markieren Sie die Position von der Protein-Tropfen durch das Hinzufügen einer kleinen Wassertropfen mit Pump0.
   Hinweis: Das Ziel ist die Schaffung eine kleine Wassertropfen, die als ein Wahrzeichen wird auf dem Protein Probe gestellt werden.
4. Drücken Sie die Taste Tara , das Gewicht durch die Mikrowaage auf NULL gesetzt.
   Hinweis: Dadurch wird das Gewicht von dem Deckglas und das zusätzliche Gewicht hinzugefügt, indem die kleinen Wasser-Wahrzeichen im Schritt 3.3 erstellt entfernt.
5. Öffnen Sie den Deckel der experimentellen Kammer und pipette 8 µL Thaumatin-Lösung auf das Wasser-Wahrzeichen.
6. Registrieren Sie die neue Thaumatin-Drop, indem die nächsten Befehle.
   1. Drücken Sie die Taste, die zu die ursprünglichen Bedingungen aus der experimentellen Datei Attribut New drop .
   2. Drücken Sie die Taste "const" , die natürliche Verdunstung des Wassers aus den Tröpfchen zu kompensieren.
7. Überprüfen Sie mit der CCD-Kamera, ob Pump0 im Protein Drop anstrebt. Passen Sie die Position des Pump0, wenn der Strom des Wassers außerhalb der Drop anstrebt.
   Hinweis: Ab diesem Zeitpunkt, das Protein Tröpfchen auf ein konstantes Gewicht durch automatisierte Wasserzugabe bleibt die natürliche Wasserverdunstung aus der Protein-Tropfen kompensiert. Das Gewicht der Protein-Tropfen als auch die anderen Parameter wie Temperatur und Relative Luftfeuchtigkeit kann überwacht werden, in Echtzeit mit dem Anzeigefenster. Das Experiment kann hier angehalten werden.

4. in Situ DLS-Messungen

1. Schalter auf der DLS laser und platzieren Sie den Laserstrahl in der Drop-Protein manuell mithilfe der Einstellschrauben.
2. Geben Sie die folgenden DLS-Parameter: Messdauer (60 s), Wartezeit zwischen zwei Messungen (10 s), und Anzahl der Messungen (300).
   Hinweis: Die ersten 30 Messungen dienen als Referenzmessungen für Protein Stabilität-Check. Der Rest der Messungen dienen als eine vollständige Untersuchung des Proteins tropfenabscheiders während der gesamten Dauer der Kristallisation.
3. Drücken Sie die Taste starten , um die DLS-Messungen zu initiieren. Überprüfen Sie die Qualität der Probe durch Auswahl einer der die DLS grafischen Darstellungen.
   Hinweis: Das Beispiel sollte ein hohes Maß an Mono-Dispersität, ohne Aggregate in der Lösung zeigen. Die DLS-Ergebnisse gezeigt und als gelesen werden können: Radius Vertrieb, Radius Histogramm, Radius Plot, Messungen, Zusammenfassung, sowie einen Überblick über die Anzahl Rate Intensität.

5. Probe Verdunstung Schritt

1. Geben Sie die Bedingungen für die Verdunstung Schritt in der Spielplan-Tabelle mit den Daten in Tabelle 1dargestellt.
   Hinweis: Das Zeichen "-" eingeführt in der Spalte "Molarity/Prozentsatz" in der zweiten Zeile darstellt einen Verlust von Wasser aus der Protein-Tropfen, während der Wert "25" bedeutet, dass das Tröpfchen Volumen eine Ermäßigung von 25 % erleiden. Dies bedeutet, dass die Konzentration des Proteins des tropfenabscheiders mit 25 % zunehmen wird.
2. Aktivieren Sie die Probe Verdunstung Schritt durch Drücken der Taste Autom. Drücken Sie die Taste Beenden , wenn der Probe verdampfen Schritt abgeschlossen ist.
3. Betätigen Sie die Schaltfläche "const" , die Tropfen konstant zu halten, nach dem Absetzen der Probe verdampfen.

6. Schritt Fällungsmittel Zusatz

1. Geben Sie die Bedingungen für das Fällungsmittel Zusatz-Schritt in der bauteiltabelle in Abbildung 4 mit den Angaben in Tabelle 2dargestellt.
   Hinweis: Die erste Zeile der Tabelle repräsentiert eine Kalibrierung, bei denen die Software berechnet die natürliche Verdunstung des Proteins tropfenabscheiders anhand der Menge an Fällungsmittel, die das Protein Tröpfchen hinzugefügt werden. Die Software dieser Wert extrapoliert und passt automatisch die Dreharbeiten Frequenz für Pump0 um die Wasserverdunstung für den nächsten Schritt des fällungsmittels Zusatz automatisch zu kompensieren.
2. Aktivieren Sie den Fällungsmittel Zusatz Schritt durch Drücken der Taste Autom.
   Hinweis: Die Zugabe von Fällungsmittel ist ein automatisierter Prozess, nach der Eingabe aus der bauteiltabelle.

(7) verfolgen die Entwicklung der Kristallisation Tröpfchen im Laufe der Zeit

1. Überprüfen Sie das Aussehen der Thaumatin Kristalle mit der CCD-Kamera.
2. Überprüfen Sie die Partikelgrößenverteilung mithilfe der DLS grafischen Darstellungen.
3. Überprüfen Sie die Entwicklung von Gewicht und experimentellen Parameter mithilfe des Anzeigefensters.
   Hinweis: Wenn die Na-Tartrat-Lösung in der Drop-Protein eine Konzentration von 0,74 M erreicht, wird der Tropfen reich an Thaumatin Mikrokristalle wie in Abbildung 7zu sehen.

8. Wiederherstellung der Kristallisation Droplet

1. Bestreichen Sie eine sauberen standard Terasaki Platte mit Paraffin-Öl.
   1. Die Platte 3 mL Paraffin-Öl hinzufügen.
   2. Das Paraffinöl auf Platte Brunnen zu zerstreuen, sanft bewegen der Plattenrandes in verschiedenen Winkeln, so dass das Öl alle 72 Brunnen der Platte bedeckt.
   3. Entfernen Sie das überschüssige von Paraffinöl durch Gießen Sie das Öl, das auf der Platte schwimmt.
2. Drücken Sie die Taste stoppen , um die Kristallisation Experiment zu beenden. Herausnehmen Sie sorgfältig die Probenträger, enthält die Kristallisation Tröpfchen.
3. Legen Sie mit einer Pipette ein Volumen von 2 µL-Aliquots der Kristallisation Tropfen in den Vertiefungen der Terasaki Platte.
   Hinweis: Durch die Rückgewinnung der Kristallisation Tröpfchen in einer Platte unter Öl, kann die Probe in regelmäßigen Abständen überprüft werden für Stabilität und Kristallwachstum mit dem Einsatz eines Mikroskops oder anderen DLS-Techniken, die mit Standardplatten Terasaki arbeiten.

Ergebnisse

Die Ergebnisse von DLS Messungen während der Kristallisation Experiment zeigen eine detaillierte Entwicklung die hydrodynamischen Partikel Radien, wodurch zwei wichtigsten Span-Verteilung-Fraktionen, die sich im Laufe der Zeit entwickeln. Im ersten Teil des Experiments wurde die Probe langsam verdampft, um eine höhere Proteinkonzentration zu erreichen. Wie in Abbildung 5 bgezeigt, konzentrierte sich die Protein Drop von 14 mg/mL bis 19,5 mg/mL. Während dieser Zeit nach dem Radius Verteilungsmuster in Abbildung 5A, das Protein zeigt eine Monomere Verhalten in Lösung mit einer Konstanten Korngröße von etwa 2,5 nm. Wie die Probe weiter verdampft wird, bleibt die Monomere Protein stabil in Lösung, ohne irgendwelche Anzeichen von Denaturierung oder Probe Aggregation.

Die Zugabe von Fällungsmittel Lösung zum Drop-Protein ist sofort nach dem Probe verdampfen initiiert und mit grau in der Verteilung Muster und Balance Radien zur besseren Visualisierung (Abbildung 5) hervorgehoben. Basierend auf den Berechnungen das Probengewicht abgeleitet, wird die markierte Partikel-Fraktion Einleitung der Kristall Keimbildung, was zu einer Radius-Größe von ca. 200-400 nm zugeschrieben. Dieses Phänomen (bekannt als Keimbildung) wird bei einer Fällungsmittel Konzentration von 0,6 M in der Protein-Tropfen auf einen Zeitraum von etwa 66 min nach der Einleitung des Experiments und ca. 23 min in Bezug auf die Einleitung der Fällungsmittel eingeleitet. Außerdem. Die Konzentration des fällungsmittels steigt zeigt die Radius-Verteilung eine breite Verteilung der Partikel in Lösung. Da mehr Kerne bilden, die erste kristalline Entitäten werden immer größer, eine Radius-Verteilung zwischen 800-1.300 nm zu erreichen. Es kann geschlossen werden, dass in diesem Stadium die Kristall-Kerne weiter wachsen und die Proteinfraktion wird allmählich ärmer als die Proteinmoleküle genommen durch Mikrokristalle oben sind. Langsam steigt die Fällungsmittel Konzentration in der Drop-Protein ist die Bildung von Mikrokristalle leicht nach 75 min, identifiziert, wenn die Radius-Verteilung zwischen 500 und 1.500 nm entwickelt sich weiterhin. Die Entwicklung des Radius Vertriebs bestätigt auch CCD-Kamera-Bilder, wo Protein Mikrokristalle in Lösung (Abbildung 7) bei einer Fällungsmittel Konzentration von 0,7 M sichtbar sind. Als Fällungsmittel Zusatz fertig ist und die Kristallisation Drop wird konstant gehalten, zeigt die Radius-Verteilung eine vorherrschende Phase zwischen 1.000 und 3.000 nm, während der Anteil der Keimbildung Ereignisse im Laufe der Zeit verringert. In diesem Moment die Kristallisation Drop mit Mikrokristalle voll gesättigt ist und keine weiteren Keimbildung Ereignisse sind in Lösung.

Verwenden als experimentelle Eingabe der Feedback-Daten durch die Mikrowaage gegeben, war eine Kristallisation Phasendiagramm für ein umfassendes Verständnis für die Kristallisation Thaumatin gezogen. In Abbildung 6zeigt das experimentelle Phasendiagramm drei unabhängige Kristallisation Experimente, wo die Produktion von Thaumatin T. Danieli Mikrokristalle als THM_2 Mikro-Kristalle (Protokoll) bezeichnet. Zwei weitere Kristallisation Experimente beschrifteten THM_1 Makro-Kristallen und THM_3 Makro-Kristalle als dienten Eingangsdaten um eine korrekte Zuordnung der verschiedenen Bereiche in das Phasendiagramm haben (zB., Löslichkeit oder metastabile Region). Da die Protokolle für diese Experimente unterschiedliche Kristallisation Wege folgen, wird die Kennung für die Keimbildung Region leichter und somit genauer. Für jedes Experiment wird die Kristallisation Pfad hervorgehoben durch Zahlen des Ordens, die unterschiedlichen Ansätze zu betonen und Anzahl der Kristallisation Schritte, die für ein bestimmtes Ergebnis verwendet wurden, während die grauen Pfeile eine Abschätzung des endgültigen Proteins repräsentieren Konzentration beim Kristall Wachstum Aufnahme Eiweißmoleküle aus Lösung bei der Bildung von klar definierten Proteinkristallen stabil.

Die drei Thaumatin-Experimente, die in Abbildung 6 dargestellt unterschiedliche Bedingungen beim Anzeigen die Keimbildung Region, und daher unterschiedliche abschließenden Kristallisation Ergebnisse als es aus den Bildern unten das Phasendiagramm erkennbar. Im Falle von THM1 und THM3 die Proteinlösung übergibt die Keimbildung Phase und wieder betritt die metastabile Region, wo es, bis sich Kristalle bilden ruht. Deshalb, die Experimente zu groß, klar definierte geformte Kristalle umgeben von Mutterlauge führen. Für das Experiment vorgestellt, die im Abschnitt "Protokoll", THM2_micro-Kristalle, folgt der Kristallisation Pfad jedoch einen bestimmten Ansatz. In einem vorherigen Abschnitt erwähnten wir, dass damit ein Beispiel geben Mikrokristalle, die Proteinlösung hat tief in die Keimbildung Phase befinden, so dass die Keimbildung Ereignisse mit einer maximalen Rate bilden können. Bei THM2_micro-Kristalle, war das Verhältnis von Protein zu Fällungsmittel Konzentration in einer solchen Weise angepasst, dass die Probe nicht nur die Keimbildung Region, tritt aber wie ein Fällungsmittel ist weiter die Proteinlösung hinzugefügt, und die Bedingungen nicht zu bewegen eine andere Region in das Phasendiagramm, aber bleiben Sie in einem hoch übersättigten Zustand innerhalb der Keimbildung Region. Infolgedessen sinkt die Entropie der Lösung drastisch wie das Protein Tröpfchen sofort mit kleinen kristallinen Einheiten gesättigt wird.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Experiments Kristallisation. Die Zeichnung zeigt einen Überblick über die Kristallisation experimentelle Kammer mit alle technischen Teile, die für die Durchführung von automatisierten Kristallisation Experiment benötigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Fenster Software für DLS und Probe relevanten Parameter für eine Kristallisation Experiment. Parameter sind Temperatur, Relative Luftfeuchtigkeit, Viskosität, etc..

Abbildung 3: Software-Kontrollfenster für die Mikro-Dosierung-Systeme an die Kristallisation-Experiment beteiligt. Die Funktionen ermöglichen die Anpassung der Parameter für die Erzeugung von Tröpfchen oder Lösung Stream.

Abbildung 4: Software-Fenster für die bauteiltabelle Beschreibung der Kristallisation Schritte an dem Experiment beteiligt. Die Anfangsbedingungen der Kristallisation Tröpfchen sind auch in diesem Fenster integriert.

Abbildung 5. Überblick über Thaumatin T. Daniellii Mikrokristalle Produktion. (A) Radius Verteilung der Partikelgröße in der Drop-Protein während der gesamten Kristallisation. (B) überwachte Übersicht der experimentellen Parameter. Die Grundstücke repräsentieren die Evolution im Laufe der Zeit für das Gewicht des Protein-Tröpfchen (schwarze Kurve) zusammen mit den berechneten Proteinkonzentration (rote Kurve) und Fällungsmittel Konzentration (blaue Kurve). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6: experimentelle Kristallisation Phasendiagramm für Thaumatin T. Danieli zusammen mit den daraus resultierenden Ergebnissen. Alle Grundstücke stammen aus experimentellen Daten, basierend auf der Feedback-Informationen durch die Mikrowaage gegeben. Die Nummern jedes Experiment zugeschrieben, die Klammern sichtbar sind repräsentieren die Reihenfolge und die Anzahl der Schritte, die während einer Kristallisation-Protokoll. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7: aufgenommene Foto für THM2_Micro-Kristalle (Protokoll) zeigen eine reiche Anzahl von Mikrokristalle in Lösung gesättigt. Das Bild entstand um 4 Uhr (240 min) nach der Einstellung des Protein-Tropfens in der experimentellen Kammer für die Kristallisation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 8: aufgenommene Foto für THM_1 Makro-Kristalle zeigen ein paar große Thaumatin Kristalle in Lösung stabil. Das Bild entstand 20 h nach der Einstellung des Protein-Tropfens in der experimentellen Kammer für die Kristallisation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 9: aufgenommene Foto für THM_3 Makro-Kristalle Thaumatin Kristalle in verschiedenen Größen in Lösung zeigen. Das Bild entstand 20 h nach der Einstellung des Protein-Tropfens in der experimentellen Kammer für die Kristallisation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Substanz	Molarity/Prozentsatz	Zeit (s)
Wasser	0	100
Wasser	-25	2100
Wasser	0	2100

Tabelle 1: Automatisierte Zeitplan Eingang zum Beispiel verdampfen Schritt bei der Herstellung von Thaumatin Mikrokristalle.

Substanz	Molarity/Prozentsatz	Zeit (s)
Wasser	0	100
prec	0,8	1800
Wasser	0	18000

Tabelle 2: automatisierte Zeitplan Input für das Fällungsmittel hinzufügen Schritt bei der Herstellung von Thaumatin Mikrokristalle.

Diskussion

Die Kristallisation Gerät soll überwachen und manipulieren entscheidenden Parameter während einer Kristallisation Experiments basiert auf einer modifizierten Dampf-Diffusion-Methode. Diese Technik ermöglicht Überwachung und ein Protein Kristallisation bewertungsexperiment auf allen Stufen, so dass der Benutzer die genaue Kenntnis und Kontrolle der Proteinlösung während der Kristallisation Phasendiagramm in Situ DLS Analyse anhand der Probe-Suspension.

Die Kristallisation Vorrichtung umfasst eine experimentelle Kammer (Abbildung 1) verbunden mit einer CCD-Kamera, die ermöglicht die Echtzeitüberwachung der Kristallisation Tropfens. Die Kamera wird an ein Mikroskop mit unterschiedlicher Vergrößerung Objektive, Bereitstellung einer maximalen räumlichen Auflösung von ca. 2,5 µm ausgestattet. Der Kern der experimentellen Kammer ist ein Gromer Mikrowaage für die Verfolgung der Entwicklung der das Probengewicht im Laufe der Zeit. Die Kristallisation Vorgehensweise entspricht einem sitzen-Drop Dampf-Diffusions-Experiment, dem Protein Drop in ein silikonisierte Deckglas gebracht wird, die auf die Mikrowaage gelegt wird. Basierend auf Gewichtsveränderungen von Tröpfchen, die durch Fällungsmittel Addition, Wasserzusatz/Ergänzung oder Probe Verdunstung verursacht werden, bietet die Mikrowaage eine präzise Eingabe an einen Algorithmus für sofortige Berechnung der Protein- und Fällungsmittel Konzentration im Laufe der Zeit . Darüber hinaus sind wichtige Kristallisation Parameter wie Temperatur und Luftfeuchtigkeit präzise überwacht und gesteuert.

Um eine Kristallisation Experiment durchzuführen, verfügt das Gerät über zwei Mikro-Dosiersysteme (kontaktieren Sie kostenlose piezoelektrische Pumpen), die bei einem Picoliter Maßstab für Fällungsmittel und Wasser zusätzlich arbeiten. Durch die Zusammenarbeit mit solch kleinen Mengen an Substanz, die Konzentration Steigungen und das Phänomen der Konvektion innerhalb des tröpfchens Protein minimiert. Die Hauptrolle der piezoelektrischen Pumpen ist die Zugabe von Fällungsmittel oder Wasser, letzteres zum Beispiel als Ersatz für natürliche Verdunstung von der Protein-Tropfen verwendet. Die Mikro-Dosierung-Systeme haben eine Reihe von Features, die den Zusatz eines Stoffes diktieren können. Solche Merkmale sind: die Wiederholrate für das Hinzufügen eines Stoffes, die Anzahl der Tropfen pro Sekunde, die Breite und Höhe des Stoffes Stream Flugbahn usw.hinzugefügt. Darüber hinaus die Position der Pumpen manuell einstellbar ermöglicht dem Benutzer eine genaue Position für die Addition von Stoffen in das Protein Tröpfchen haben.

Die einzigartige Feedback gesteuert Manipulation des Tropfens Kristallisation wird durch in Situ DLS-Daten erreicht, mögliche Änderungen im Protein Oligomere Zustand während des gesamten experimentellen Verfahrens zeigen können. Die Technik ermöglicht die ständige Evaluierung der Partikelgrößenverteilung im Laufe der Zeit so offenbart unbekannte Protein-bezogene Mechanismen. Die DLS-Optik-Ausrüstung befindet sich strategisch unter dem Deckglas-Bereich erlauben den Detektor und Laser Strahl durch das Deckglas und weiter durch das Protein Tröpfchen in einem Wohnort in Situ ; Daher werden nur Änderungen innerhalb des tröpfchens von DLS Weg aufgezeichnet. Um einfache Handhabung ermöglichen, das Gerät verfügt über zwei Öffnungen: eine Haustür für eine optimale Positionierung der Deckglas und einem Deckel, der entfernt werden kann, so dass der Benutzer die Schussposition der Mikro-Dosierung Systeme anpassen kann sowie mit Genauigkeit eine neue Protein-Dro Plet auf das Deckglas.

Die interaktive kristallisationsverfahren mit dem oben genannten Gerät ist eine zuverlässige Technik für Größe-gesteuerten Herstellung von Proteinkristallen. Obwohl viele Kristallisation Methoden derzeit verfügbar sind, ist Mechanismus selbst Insider-Informationen über die Kristallisation nicht leicht erreichbar. Im allgemeinen erlaubt die Anwendung herkömmlicher Kristallisation Methoden nur begrenzte Kontrolle über eine Lösung in der Kristallisation Phasendiagramm, mit nur ein paar Möglichkeiten, seinen Kurs zu ändern, nachdem ein Experiment gestartet wurde. Während der Durchführung einer Kristallisation experimentieren und so eine automatisierte Kristallisation Technologie gepaart mit in Situ DLS, eine große Anwendung ist viel Wissen über Übergänge in das Phasendiagramm gewonnen. Im Allgemeinen sind die Regionen, was zu amorphen Niederschlag und die Induktion von homogenen Keimbildung nahe beieinander im Phasendiagramm. Daher, durch die Manipulation des Kurs eine Kristallisation Tropfens basierend auf Echtzeit-Informationen über die Kornverteilung, ist es möglich, Niederschlag eines Proteins durch schrittweise Anpassung der Kristallisation Bedingungen zur Keimbildung zu vermeiden und Kristallbildung.

Heute gehören viele Bedingungen, Kristallisation Fällungsmittel Lösungen wo Polyethylenglykol (PEG) Derivate weit verbreitet sind. Solche Verbindungen haben in der Regel eine hohe Viskosität, die Schwierigkeiten für pipettieren oder Abgabe besitzen kann. Die vorliegende Fallstudie gelten die Mikro-Dosierung-Systeme, die für das Fällungsmittel Dosierung verwendet werden sehr dünne Kapillaren, die den Zusatz von Picolitre Schritten ermöglichen. Infolgedessen gibt es einige Einschränkungen bei der Arbeit mit hochviskosen Substanzen. Innerhalb einer Serie der letzten Versuche, das System hat positive Ergebnisse mit Hilfe der folgenden PEG-Derivate gegeben: PEG200 50 %, PEG3000 20 %, PEG6000 10 %, PEG800010 %. Obwohl bisher nur die oben genannten Lösungen getestet wurden, enthalten die Micro-Dosiersystemen einen speziellen Heizung Mechanismus, der verwendet werden kann, um die Viskosität einer Lösung zu verringern. Ein weiterer Faktor ist Salzlösungen, die müssen berücksichtigt werden, wenn als Protein Fällungsmittel verwendet. Beim Arbeiten mit hochkonzentrierten Salze kann eine kleine Menge an der Düse des Mikro-Dosiersystem, oberflächliche Blockierung der Mikro-Dosierpumpe während Fällungsmittel Zugabe verursacht kristallisieren; auch wenn eine sehr hohe Relative Luftfeuchtigkeit experimentelle anwesend ist. Um dieses Problem zu überwinden, muss das Experiment auf Eis gelegt werden, so dass das Salz von der Düse entfernt werden kann. Dies könnte erfordern eine besondere Behandlung und Fehler in der Phase des fällungsmittels Zusatz erzeugen könnte.

Basierend auf die wertvollen Informationen, die erreicht werden kann, wenn solche automatisierten Kristallisation Experimente durchführen, kann diese Technik auch auf Studien zur Untersuchung der physikalischen Chemie Aspekte der Protein Kristallisation ausgedehnt werden. Die Keimbildung und Kristall Wachstum Reaktionsgeschwindigkeiten sind kinetische Phänomene abgeleitet und berechnet anhand der Zeitabhängigkeit Informationen aus einem Experiment wie Temperatur, Wachstum der Partikelgröße und Protein dargestellt und Fällungsmittel werden können Konzentration.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Thaumatin aus Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	1002365940	Protein für das Protokoll
Bis-Tris 14880	Sigma-Aldrich	2302377	Puffer für Proteinlösung
Di-Natriumtartrat-Dihydrat	AppliChem	A0451,0500	Fällungsmittel für Proteinlösung
Sillikonisierte Deckgläser	Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH	1051203	Deckgläser für die Kristallisation
Spritzenvorsatzfilter	Starstedt	831826001	Filterpore 0,2 &Mikro; m
Spritze		Omnifix 4617207V	Luer Lock Solo 20 mL
Paraffinöl	Sigma-Aldrich	2323842	Öl zum Beschichten der Platte
Standard Terakasi Platte	Sigma-Aldrich	M5812270EA	Platte zur Rückgewinnung des Kristallisationströpfchens
Weiche Tücher	KIMTECH Science
XtalController900	Xtal-Concepts GmbH	XTC900	Kristallisationsgerät