Methodenartikel

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Histon-Modifikationen von Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/57080

⸱

29. Dezember 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Maryland

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir ein Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation der geänderten Histone aus der angehende Hefe Saccharomyces Cerevisiae. Immunoprecipitated DNA wird anschließend für die quantitative PCR verwendet, um die Fülle und die Lokalisierung von Histon post-translationalen Modifikationen während des Genoms zu befragen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histon post-translationalen Modifikationen (PTMs), wie Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, sind dynamisch geregelt durch eine Reihe von Enzymen, die hinzufügen oder entfernen Sie diese Zeichen in Reaktion auf Signale, die von der Zelle. Diese PTMS sind wichtige Mitwirkende bei der Regulierung von Prozessen wie gen-Expressions und DNA zu reparieren. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine instrumentale Ansatz für sezieren die Fülle und die Lokalisierung von vielen Histon PTMs im gesamten Genom als Reaktion auf verschiedene Störungen in der Zelle gewesen. Hier ist eine vielseitige Methode zur Durchführung von ChIP posttranslational modifizierte Histone aus der angehende Hefe Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae) beschrieben. Diese Methode beruht auf der Vernetzung von Proteinen und DNA mit Formaldehyd Behandlung von Hefekulturen, Generierung von Hefe Lysates durch Wulst schlagen, Solubilisierung der Chromatin-Fragmente von micrococcal Nuklease und Immunopräzipitation der Histon-DNA -komplexe. DNA, verbunden mit dem Histon-Zeichen von Interesse ist gereinigt und quantitative PCR-Analysen, seine Anreicherung an mehrere Loci während des Genoms zu bewerten unterzogen. Repräsentative Experimente sondieren die Lokalisierung der Histon-Marken H3K4me2 und H4K16ac in Wildtyp und Mutanten Hefe werden diskutiert, um Datenanalyse und Interpretation zu demonstrieren. Diese Methode eignet sich für eine Vielzahl von Histon PTMs und kann mit verschiedenen mutierte Stämme oder in Gegenwart von verschiedenen Umweltbelastungen, so dass es ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Untersuchung von Veränderungen in der Chromatin-Dynamik unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt werden.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die dynamische Post-translationale Modifikation (PTM) der Histone ist eine wichtige Regulationsmechanismus für viele DNA-templated Prozesse, einschließlich Transkription, Replikation und DNA-Reparatur1,2. Die Fähigkeit, die Fülle und die präzise Lokalisierung der geänderten Histone mit dieser Prozesse zu bestimmen ist daher entscheidend für ihre Verordnung unter verschiedenen Bedingungen in der Zelle zu verstehen. Die Entwicklung von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) als eine Methode weitgehend entstammte biochemische Untersuchungen der Interaktionen von Proteinen mit DNA, insbesondere in-vitro- Methoden mit chemischen Vernetzer, gepaart mit zu bewerten die Dynamik der Protein-DNA-Wechselwirkungen in Vivo und in bestimmten Regionen des Genoms3,4,5. Die Weiterentwicklung der quantitativen PCR (qPCR) und Sequenziertechnologien hat auch die Fähigkeit zur ChIP-Experimente mit quantitative Vergleiche und in ganzer Genome, so dass es ein leistungsfähiges Werkzeug für DNA-Protein Interaktionen zu sezieren erweitert. mehrere Ebenen.

Derzeit ist ChIP eine gewünschte Methode für jede Forschungsgruppe Chromatin-vermittelte Regulation des Genoms interessiert, da gibt es keine vergleichbaren Methoden für direkt befragen die physikalische Verbindung zwischen eine modifizierte Histon und einer spezifischen genomischen Locus in Vivo. Obwohl Variationen dieser Methode mit der Sequenzierung der nächsten Generation zuordnen Histon Änderungen im gesamten Genom6,7 verfügbar sind, können diese Ansätze richten verschiedene wissenschaftliche Fragestellungen und deren Umfang, Kosten und technische Ressourcen können für einige Forschungsgruppen zu begrenzen. Darüber hinaus gezielte ChIP-qPCR ist notwendig, diese ergänzen Ansätze durch die Bereitstellung von Methoden, um beide zu optimieren das ChIP-Protokoll vor der Sequenzierung und Ergebnisse aus der epigenomischen-Datasets zu validieren. Massenspektrometrie basierte Ansätze für identifizieren die volle Ergänzung von Histon Marken genomische Regionen zugeordnet auch haben8,9,10,11, doch tauchten diese Ansätze haben einige Einschränkungen in Bezug auf die Regionen des Genoms sondiert werden können und sie erfordern Fachwissen und Instrumentierung, die nicht zur Verfügung, um alle Forschungsgruppen werden. ChIP bleibt daher eine grundlegende Methode für die Analyse, die Fülle und den Vertrieb von Histon-Modifikationen unter unterschiedlichen Bedingungen für alle Forschungsgruppen Epigenetik, Chromatin und die Regulierung der genomischen Funktionen interessiert.

Hier beschreiben wir eine Methode für sein Modell die ChIP mit den angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae) um die Verteilung von Histon PTMs im Chromatin zu untersuchen. Dieser Ansatz stützt sich auf eine Reihe von Kernkomponenten des ChIP-Protokolle in Hefe entwickelt und galt auch für diverse Modell Systeme12,13. Wechselwirkungen zwischen geänderten Histone und DNA in der Zelle sind durch Vernetzung mit Formaldehyd konserviert. Nach lysate Vorbereitung sind Chromatin Fragmente in gleichmäßig große Fragmente durch Vergärung mit micrococcal Nuklease solubilisiert. Immunopräzipitation der geänderten Histone erfolgt mit kommerziellen oder Labor erzeugten Antikörper und alle damit verbundenen DNA isoliert und analysiert für die Anreicherung an bestimmten genomische Regionen mit qPCR (Abbildung 1). Für viele Histon-Modifikationen reicht die Menge an DNA erhalten aus diesem Protokoll mehr als 25 verschiedenen genomic Loci von qPCR getestet.

Diese ChIP-Methode ist sehr vielseitig für die Überwachung der Verteilung einer einzelnen Histon-Modifikation über mehrere mutierte Stämme oder Umweltbedingungen oder in Wildtyp-Zellen bei einer Reihe von genomic Loci zu Testzwecken mehrere Histon-Modifikationen. Darüber hinaus sind zahlreiche Komponenten des Protokolls leicht einstellbar, Erkennung von entweder hoch - oder niedrigen-reichlich vorhandene Histon-Marken zu optimieren. Schließlich bietet angehenden Hefe ChIP der geänderten Histone bei die Möglichkeit, wichtige Kontrollen für Antikörperbesonderheit, die weitgehend in andere Systeme nicht verfügbar sind. Nämlich Hefestämme erzeugt werden können, den Punktmutationen in Histon Rückstände zu tragen, die für eine Änderung ausgerichtet sind, und in einigen Fällen gibt es nur ein einziges Enzym, die Änderung auf einen bestimmten Histon-Rückstand katalysiert (zB. Histon Lysin Methyltransferasen). Daher kann ChIP durchgeführt werden, entweder die Histon Mutant oder Enzym Löschung Stämme, inwieweit assay auf die unspezifische Bindung des Antikörpers kann auftreten und falsch positive Ergebnisse generieren. Diese Kontrolle ist besonders wertvoll für die neu entwickelten Antikörper und kann auch verwendet werden, um Antikörper Spezifität für konservierte Histon Änderungen vor ihrer Verwendung in anderen Systemen zu überprüfen. Dieser Ansatz ergänzt andere Methoden um Antikörperbesonderheit zu testen, die Unterscheidung zwischen den verschiedenen Modifikation Staaten (z. B. Mono-, di- und Tri-Methylierung), einschließlich Sondierung Arrays modifizierte Peptide und westliche Flecken der Histone durchführen oder Nukleosomen mit definierten Modifikationen. Insgesamt ist ChIP in der angehenden Hefe eine leistungsfähige Methode für die Bewertung der Dynamik der Histon PTMs im gesamten Genom und sezieren die Mechanismen ihrer Regulierung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pre-binden Sie Antikörper gegen magnetische Beads

  1. Das Protein A/G magnetische Beads gut mischen und 20 µL des magnetischen Kügelchen je ein Immunopräzipitation (IP) Probe auf einem 1,5 mL-Tube übertragen.
    Hinweis: Wenn Perlen pipettieren, verwenden Sie weite Bohrung, Low Retention Spitzen.
  2. Legen Sie das Rohr mit Perlen in einem Magnetstativ und ermöglichen Sie Perlen zu sammeln auf Seite des Rohres zu. Den Überstand zu entfernen.
  3. Waschen Sie die Perlen 3 Mal mit 1 mL kalte Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl).
  4. Perlen und entsprechende Menge des Antikörpers 200 µL des TBS hinzufügen. Drehen Sie bei 8 u/min bei 4 ° c über Nacht
    Hinweis: Für viele Histon-PTM-Antikörper reicht 1 bis 3 µg des Antikörpers pro IP. Titration Experimente werden jedoch empfohlen, um angemessene Konzentrationen festzustellen. Empfohlenen Konzentrationen gut charakterisierten, kommerzielle Histon-PTM-Antikörper sind oft genau und finden Sie in den veröffentlichten Berichten oder Produkt-Literatur.
  5. Die Perlen in einem Magnetstativ und Entfernen des Überstands. Waschen Sie sie mit 1 mL TBS.
  6. Aufschwemmen der Perlen 20 µL des TBS pro IP Probe plus eine zusätzliche 5 µL (Pipettier Fehlerfall) TBS.
    Hinweis: Die Perlen können kurzfristig bei 4 ° C bis zum Gebrauch gespeichert werden.

(2) Hefezellen wachsen

  1. 10 mL YPD (10 % Hefeextrakt, 20 % Pepton und 20 % Traubenzucker) mit einer einzigen Kolonie der entsprechenden Sorte zu impfen und bei 30 ° C über Nacht in einem schütteln Inkubator bei 220 u/min zu wachsen.
  2. Messung die optische Dichte bei 600 nm (OD600) die Hefekultur mit einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die Kultur, die eine OD600 = 0,2 in 100 mL YPD in eine neue Flasche.
  3. Wachsen die Zellen bei 30 ° C in einem schütteln Inkubator bei 220 u/min, bis sie Mitte des Log-Phase erreichen (OD600 = 0,6-0,8).

3. in-Vivo -Vernetzung von Proteinen, DNA

  1. Wenn Kulturen Mid Log-Phase erreichen, hinzugeben Sie 2,7 mL 37 % Formaldehyd direkt auf das Medium für eine Endkonzentration von 1 % Formaldehyd. Übertragen Sie den Kolben auf einen Shaker bei 25 ° C (oder Raumtemperatur) und 50 u/min für 15 min schütteln.
  2. Das Medium 5 mL 2,5 M Glycin hinzufügen und weiter Schütteln bei 50 u/min bei Raumtemperatur für 5 min um das Formaldehyd zu stillen.
  3. Transfer der Zellen, um die Zentrifuge Flaschen und drehen Sie die Zellen bei 5800 X g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren Sie überstand.
    1. Waschen Sie die Zellen mit der resuspending sie in 45 mL kaltem TBS und übertragen Sie die Aussetzung in ein 50 mL konische Röhrchen. Drehen Sie das Rohr auf 2800 X g für 3 min bei 4 ° C. Den Überstand zu entfernen.
    2. Waschen Sie die Zellen in 10 mL kalten Lysis Puffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), 1 % Nonidet Octyl Phenoxypolyethoxylethanol (NP-40) Chip, bei 4 ° C gelagert).
    3. Drehen Sie die Zellen bei 2800 X g für 3 min bei 4 ° C. Den Überstand zu entfernen.
      Hinweis: Zellen können mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° C bis zur Weiterverarbeitung gelagert.

4. machen Sie Hefe Lysates

  1. Die Zellen in 1 mL kalte ChIP Lysis Puffer mit 1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF) und 1:1,000 Verdünnung der Hefe-Protease-Inhibitor cocktail aufzuwirbeln. Übertragen Sie die Aussetzung auf eine 2,0 mL-Schraubverschluss-Röhrchen mit 200 µL von Glasperlen.
  2. Übertragen Sie die Zellen auf eine Perle schlagen Apparat für high-Speed-Agitation bei 4 ° C und Wulst beat 6 Mal für 30 s. Halten Sie die Zellen auf Eis für mindestens 1 Minute zwischen jede Perle zu schlagen.
  3. Übertragen Sie auf einer 1,5 mL-Tube mit Gel laden Tipps der lysate. Zentrifugieren der lysate 15.500 x g für 20 min bei 4 ° C.
  4. Den Überstand verwerfen und erneut das Pellet in 250 µL MNase Verdauung Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 21 mM CaCl2, 1 % NP-40, bei 4 ° C gelagert) durch sanft auf und ab pipettieren.
  5. Die Reaktionen 2,5 µL MNase hinzufügen. Mischen Sie sie sanft durch invertieren 4-6 Mal und es sofort im Wasserbad 37 ° C für 20 min inkubieren.
    Hinweis: Digest Bedingungen sollten optimiert werden, wenn eine neue Aktie der MNase verwendet wird. Siehe Schritt 10 des Protokolls.
  6. Legen Sie die Rohre sofort auf Eis, um die Reaktion zu stoppen, und fügen Sie 5 µL 0,5 M EDTA für eine Endkonzentration von 10 mM EDTA. Mischen Sie sie sanft durch Umkehrung.
  7. Zentrifugieren Sie die Reaktion bei 15.500 x g für 15 min bei 4 ° C und übertragen Sie den Überstand auf eine neue 1,5 mL Tube.
    Hinweis: Lösliche (verdaut) Chromatin werden im Überstand. Die Tablette enthält alles unverdaut und unlöslichen Zellenrückstand.

5. Immunoprecipitate (IP) modifiziert Histone

  1. Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins der einzelnen MNase veröffentlicht Chromatin-Fraktionen mit einem Bradford-Assay. Fügen Sie 1 mL der Bradford-Reagenz zu jedem der 8 verfügbaren Küvetten plus 1 zusätzliche Küvette für jedes Protein Sample getestet werden.
    1. Bereiten Sie eine Stammlösung von 2 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA).
    2. Fügen Sie das entsprechende Volumen um die folgenden Konzentrationen von BSA in 1 mL der Bradford-Reagenz zu erreichen: 0 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 µg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL und 10 μg/mL. Die zusätzliche Küvetten 2 μL des Bruches MNase veröffentlicht Chromatin hinzufügen.
    3. Decken Sie die Spitze der einzelnen Küvette mit einem kleinen Stück Parafilm und invertieren die Küvetten 4-6 Mal die Lösung gut mischen. Inkubieren Sie die Küvetten bei Raumtemperatur für 15 min.
    4. Mit einem sichtbaren Licht Spektralphotometer messen die Extinktion bei 595 nm für die Standardkurve und experimentellen Proben.
      Hinweis: Verwenden Sie die Küvette ohne BSA (0 μg/mL), das Spektrophotometer vor der ersten Messung leer.
    5. Zeichnen Sie eine Standardkurve über die Extinktion-Werte für die unterschiedlichen Konzentrationen von BSA auf Software verbunden mit dem Spektralphotometer oder Tabellenkalkulations-Software. Anhand der Standardkurve und den Verdünnungsfaktor verwendet (1: 500), verwenden Sie die Absorption Werte um die Proteinkonzentration für jede der Chromatin Bruchteil Proben zu berechnen.
  2. Fügen Sie für jede IP 50 µg Gesamt-Protein aus der MNase veröffentlicht Chromatin-Fraktion auf ChIP Lysis Puffer zu einem Endvolumen von 1 mL zu erreichen hinzu.
    Hinweis: Wenn mehr als eine IP-Adresse pro lysate einrichten, um ein master-Mix von der lysate und ChIP Lysis Puffer und aliquoten 1 mL zu einzelnen Rohre für die IP-Adresse.
  3. Entfernen Sie 100 µL aus der IP-Mix, als das Eingabesample zu verarbeiten. Fixieren Sie das Eingabesample bei-20 ° C bis Schritt 7.1.
    Hinweis: Alle verbleibenden Chromatin-Probe kann auch bei-20 ° C eingefroren und bei Bedarf für eine spätere IP verwendet.
  4. Fügen Sie 20 µL des magnetischen Protein A/G Perlen mit Antikörper gegen jede IP-Probe bereits gebunden.
Drehen Sie die Probe mit 8 u/min für 3 h (Standard) oder über Nacht (falls gewünscht) bei 4 ° C.

6. Waschen Sie IPs und eluieren Sie Histon-DNA-komplexen

  1. Die Röhren in einem Magnetstativ und lassen Sie Perlen auf der Seite der Röhre zu sammeln. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Waschen Sie die Perlen nacheinander mit 1 mL eines jeden der Puffer unten.
    1. Führen Sie jedem Waschgang indem drehen bei 8 u/min für 5 min bei 4 ° C, Perlen in einem Magnetstativ, überstand entfernen und Hinzufügen von nächste Puffer: 2 X - ChIP Lysis Puffer, 2 X - hohe Salz Waschpuffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA 1 % NP-40, bei 4 ° C gelagert), 1 X - LiCI/Reinigungsmittel Waschpuffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM LiCI, 1 mM EDTA, 1 NP-40 %, 1 % Natrium Deoxycholate, bei 4 ° C gelagert), 1 X - TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, bei 4 ° C gelagert) und 1 X - TE.
    2. Übertragen Sie mit letzten TE waschen Perlen auf eine neue Röhre mit 0,5 mL TE, übertragen die meisten Perlen, dann eine weitere 0,5 mL TE zu waschen das Rohr und übertragen die restlichen Perlen.
  2. Fügen Sie 250 µL frisch zubereiteten ChIP Elution Buffer (1 % SDS, 1 mM Nahco33). Wirbel die Lösung kurz. Drehen Sie die Proben bei 8 u/min für 15 min bei Raumtemperatur.
  3. Rohr in einem Magnetstativ und sammeln Sie die Perlen zu. Sorgfältig übertragen Sie den Überstand zu, zu einem neuen Schlauch und vermeiden Sie die Perlen.
    Hinweis: Das Eluat enthält Immunoprecipitated Proteine und damit verbundenen DNA.
  4. Hinzu kommt eine weitere 250 µL ChIP Elution Buffer Perlen. Drehen Sie die Proben bei 8 u/min für 15 min bei Raumtemperatur.
  5. Übertragen Sie den Überstand sorgfältig auf das Röhrchen mit der ersten Elution. Entfernen Sie ggf. ein kleineres Volumen (240 µL) für alle IPs zu vermeiden, die Perlen zu stören.

7. rückwärts Protein-DNA vernetzt

  1. Die Eingabesamples Auftauen und 400 µL ChIP Elution Buffer zu jeder Eingabe hinzufügen.
  2. Eingang und IP-Proben fügen Sie 20 µL 5 M NaCl 5 µL von 20 mg/mL Glykogen und 12,5 µL von 20 mg/mL Proteinase K. Mix gut durch invertieren oder Rohre streichen hinzu. Über Nacht inkubieren Sie die Proben im Wasserbad 65 ° C.

8. reinigen und DNA zu konzentrieren

  1. Am Eingang und IP-Proben 10 µL von 10mg/mL RNase A hinzufügen. Inkubieren Sie die Proben im Wasserbad 37 ° C für 30 min.
  2. Die wässrige Lösung 600 µL Phenol: Chlorofrom:isoamyl Alkohol (25:24:1 PCI) hinzufügen und gut mischen. Drehen sie mit 15.500 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
    1. Entfernen Sie die wässrige Schicht zu einem neuen Schlauch. 600 µL des PCI-Standards hinzufügen und gut mischen. Drehen Sie das Rohr auf 15.500 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die wässrige Schicht auf einen neuen Schlauch.
      Achtung: Arbeiten in der Dunstabzugshaube und tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung bei der Arbeit mit PCI. Flüssige und feste Abfälle zu entsorgen, wie institutionelle Richtlinien angewiesen.
  3. Fügen Sie 0,1 X Volumen von 3M Natriumacetat und 1 mL kalte 100 % Ethanol, die DNA auszufällen. Invertieren den Schlauch 4 - 6 Mal die Lösung gut mischen. Über Nacht bei-20 ° C inkubieren.
    1. Drehen Sie das Rohr auf 15.500 x g für 20 min bei 4 ° C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette.
    2. Gewaschen Sie das Pellet in 1 mL kaltem 70 % igem Ethanol werden. Drehen sie bei 15.500 x g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette.
    3. An der Luft trocknen Sie die Pellets in der Haube für ca. 20 min (bis es komplett trocken). IP-Proben in 50 µL Nuklease-freies Wasser Aufschwemmen und Eingabesamples in 100 µL Nuklease-freies Wasser Aufschwemmen. Lagern Sie die DNA-Proben bei-20 ° C bis zur Durchführung qPCR.

9. Quantitative PCR (qPCR) erkennen bereichert genomische Regionen

  1. Machen Sie einen qPCR-master-Mix für jeden Satz von Primern. Eine mögliche Reaktion enthält 5 µL 2 X qPCR-Mix, 0,25 µL 20 µM vorwärts Grundierung und 0,25 µL 20 µM-rückwärts-Primer.
    Hinweis: Die richtige Grundierung Gestaltung und Prüfung für qPCR Experimente sind an anderer Stelle beschrieben14,15,16.
  2. DNA-master Mix für jede DNA-Probe zu machen. Eine mögliche Reaktion enthält 0,5 µL DNA und 4.0 µL Nuklease-freies Wasser.
  3. Jede Vertiefung auf einer qPCR 384-Well-Platte 5,5 µL der entsprechenden Grundierung-master-Mix und 4,5 µL der entsprechenden DNA-master-Mix hinzufügen.
    Hinweis: Starten Sie mit dem Hinzufügen von 5,5 µL der Primer-Mix in jede Vertiefung. Drehen Sie die Platte 200 X g für 1 min bei Raumtemperatur vor dem Hinzufügen von 4,5 µL DNA-Mix.
  4. Die Dichtung an der Platte und Spin 200 X g für 1 min bei Raumtemperatur zu halten.
  5. QPCR mit einem Echtzeit-qPCR-System mit den folgenden Bedingungen durchzuführen: 95 ° C für 3 min; 40 Zyklen von 95 ° C für 10 s, 55 ° C für 30 s; schmelzenden Kurve 65 ° C bis 95 ° C in 0,5 ° C-Schritten, 5 s.
  6. Für jede Primerpaar berechnet die prozentuale Eingabe der IP-Probe im Vergleich zu den 5 % Eingabesample in der qPCR verwendet. Nutzen Sie Mittel der technischen PCR-Triplicates, um die Berechnungen durchzuführen.
    Hinweis: Wenn erhebliche Unterschiede in der PCR Triplicates eingehalten wird, ist es am besten, die qPCR mit Augenmerk auf master-Mix Zusammensetzung, Pipettieren Fehler und Kreuzkontaminationen zwischen Brunnen in 384-Well-Platte zu wiederholen.
    1. Passen Sie die Cq Werte für die Eingabe zu 100 % durch die Anzahl der Zyklen, die Vertretung des Verdünnungsfaktor von Cq-Rohwerte subtrahieren.
      Hinweis: Fünf Prozent Eingang steht ein Verdünnungsfaktor 20-fache, das 4,32 Zyklen entspricht (log2 20 = 4.32).
    2. Berechnen Sie den Eingang als 2 Prozent ^ (CqEingang - CqIP) multipliziert mit 100.

10. Bedingungen Sie MNase Digest (empfohlen vor dem ersten vollen ChIP Experiment)

  1. Führen Sie die Schritte 2.1 bis 4.4 des vorhergehenden Protokolls. Scale-up des Protokolls, genug für mehrere Proben von MNase Verdauung des Pellet-Chromatin-haltigen lysate zu generieren. Bei Schritt 4.4 Aufschwemmen der Pellets in 1,25 mL MNase Verdauung Puffer. Aliquot zu 5 Proben Rohre so, dass jeder enthält 250 µL des Chromatins Pellet-Nukleinsäuretablette in MNase Verdauung Puffer.
  2. Fügen Sie 0, 1,5, 2,5 oder 5 µL MNase für jedes Rohr. Mischen Sie sie sanft durch invertieren 4-6 Mal und sofort die Rohre im Wasserbad 37 ° C für 20 min inkubieren.
  3. Stopp-Reaktionen sofort Rohre auf dem Eis und Hinzufügen von 5 µL 0,5 M EDTA für eine Endkonzentration von 10 mM.
Mischen Sie durch Umkehrung der Lösung vorsichtig.
  • Schläuche am 15.500 x g für 15 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand auf eine neue 1,5 mL Tube übertragen.
  • 1 % Endkonzentration (25 µL der Stammlösung 10 %) und Nahco33 bis 0,1 M Endkonzentration (25 µL der Stammlösung 1 M) zu den Beispielen in den 1,5 mL Röhrchen SDS hinzufügen.
  • Die Proben in den 1,5 mL Röhrchen 20 µL 5M NaCl 5 µL von Glykogen und 12,5 µL 20mg/mL Proteinase K hinzugefügt werden. Inkubieren sie bei 65 ° C über Nacht.
  • Fügen Sie 10 µL 10 mg/mL RNaseA. Bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
  • Die wässrige Lösung 300 µL des PCI-Standards hinzufügen und gut mischen. Drehen Sie mit 15.500 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
    1. Entfernen Sie wässrige Schicht zu einem neuen Schlauch. 300 µL des PCI-Standards hinzufügen und gut verrühren. Drehen Sie mit 15.500 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie wässrige Schicht auf einen neuen Schlauch.
  • Fügen Sie 0,1 X Volumen von 3 M Natriumacetat (in der Regel ~ 30 µL) und 1 mL kalte 100 % Ethanol, die DNA auszufällen. Invertieren den Schlauch 4 - 6 mal gut mischen. Über Nacht inkubieren Sie das Rohr bei-80 ° C für 1 h oder-20 ° C.
    1. Drehen Sie das Rohr auf 15.500 x g für 20 min bei 4° C. Überstand mit einer Pipette vorsichtig zu entfernen.
    2. Gewaschen Sie die Pellets in 1 mL kaltem 70 % igem Ethanol werden. Drehen Sie mit 15.500 x g für 10 min bei 4 ° C.
    3. Lassen Sie die Pellets in die Haube ca. 20 min (oder bis es komplett trocken) an der Luft trocknen. Die Pellets in 30 µL Nuklease-freies Wasser Aufschwemmen.
  • Fügen Sie die DNA loading Dye und laufen 20 µL auf ein 2 % Agarose Gel visualisieren verdaut DNA.

    • Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

    Ergebnisse

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Ein wesentlicher Bestandteil dieses Protokolls wird die Konzentration der micrococcal Nuklease (MNase) verwendet, um das Chromatin in lösliche Fragmente zu verdauen, wie in Schritt 10 beschrieben optimiert. Dies ist wichtig für den Erhalt der hochauflösenden Daten über die Verteilung der Histon-Modifikationen an genomischen Regionen von Interesse. Ein MNase Titration sollte durchgeführt werden, um festzustellen, die am besten geeignete Konzentration in erster Linie Mono-Nukleosomen mit ei...

    Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

    Diskussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die effiziente Gewinnung von DNA mit geänderten Histone in Hefezellen durch Immunopräzipitation verbunden. Dies wird gefolgt von qPCR mit Primer die Regionen von Interesse festzustellen, lokale Anreicherung oder Erschöpfung der spezifische Histon-Modifikationen zu verstärken. Trotz der vor fast 20 Jahren als eine Methode entwickelt, bleibt ChIP der entscheidende Test für die Untersuchung von Histon Änderungsstand an verschiedenen genomischen Regionen und unter unterschiedlichen ...

    Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

    Offenlegungen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Die Autoren haben nichts preisgeben.

    Danksagungen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Die Autoren möchten das grüne Labor für hilfreiche Gespräche danken. Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt von NIH-Stipendien, R03AG052018 und R01GM124342, E.M.G.

    Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

    Materialien

    Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
    NameUnternehmenKatalognummerKommentare
    HefeextraktResearch Products International (RPI)Y20025-1000.0
    PeptonResearch Products International (RPI)P20250-1000.0
    DextroseThermoScientificBP350-1
    FormaldehydSigma-AldrichF8775
    GlycinFisher ScientificAC12007-0050
    TrisAmresco0497-5KG
    EDTASigma-AldrichE6758-500G
    NaClThermoScientificBP358-10
    4-Nonylphenyl-polyethylenglykolSigma-Aldrich74385entspricht NP-40
    MgClThermoScientificS25533
    CaCl2Sigma-Aldrich20899-25G-F
    LiClThermoScientificAC413271000
    NatriumdodecylsulfatAmrescoM107-1KG
    NatriumdesoxycholatSigma-Aldrich30970-100G
    NatriumacetatSigma-AldrichS2889
    NaHCO3ThermoScientificS25533
    PMSFSigma-AldrichP7626-5G
    Hefe-Protease-Inhibitor-CocktailVWR10190-076
    25 Phenol:24 Chloroform:1 IsoamylalkoholVWR Life Science97064-824
    EthanolSigma-AldrichE7023
    Nukleasefreies WasserVWR100720-992
    Mikrokokken-NukleaseWorthington BiochemischesLS004797
    GlykogenThermoScientificR0561
    Proteinase KResearch Products International (RPI)P50220-0.1
    RNase A Sigma-AldrichR6513-50MG
      Bradford Assay ReagenzThermoScientific23238
      BSA-Standard 2 mg/mLThermoScientific23210
    α H4EMD Millipore04-858
    α H4K16acEMD MilliporeABE532
    α H3Abcamab1791
    α H3K4me2Aktives Motiv39142
      High Rox qPCR MixAccuris qMax Grün, Low Rox qPCR MixACC-PR2000-L-1000
    Protein A/G Magnetische PerlenThermoScientific88803
    Magnetständer für 1,5 mL RöhrchenFisher ScientificPI-21359
    Säuregewaschene GlasperlenSigma-AldrichG8772
      Mikroröhrchen HomogenisatorBenchmarkD1030
    2,0 mL Schraubverschlussröhrchen mit DichtungsringenSigma-AldrichZ763837-1000EA
    Gel-LadespitzenFisher Scientific07-200-288
    KüvettenFisher Scientific50-476-476
    ParafilmFisher Scientific13-374-10
    50 mL konische RöhrchenFisher Scientific14-432-22
    384-Well-PCR-PlatteFisher ScientificAB-1384W
      KreiselbodenschüttlerNew Brunswick ScientificModell G10
    SpektralphotometerThermoScientificND-2000c
      Real-Time-PCR-NachweissystemBio-Rad1855485

    Referenzen

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
    2. Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
    3. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
    4. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
    5. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
    6. Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37(2009).
    7. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
    8. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
    9. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
    10. Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
    11. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
    12. Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
    13. Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
    14. Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
    15. Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
    16. Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
    17. Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
    18. Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
    19. Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
    20. Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
    21. South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
    22. Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952(2012).
    23. Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
    24. Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
    25. Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
    26. Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).

    Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

    Nachdrucke und Genehmigungen

    Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

    Genehmigung beantragen

    Schlagwörter

    Mikkokkale NukleaseQuantitative PCRHefe LysatFormaldehyd QuervernetzungMagnetperlenH3K4me2H4K16ac

    Verwandte Artikel