Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Zweistufigen Ansatz - und Ende-Frühstadium der Orgel Formation im Vogelgrippe-Modell zu erkunden: die Thymusdrüse und Nebenschilddrüsen Organogenese Paradigma

6.4K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/57114

⸱

17. Juni 2018

 , 
1Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel enthält einen aktualisierten Ansatz zum klassischen Wachtel-Huhn-Chimäre System Orgel Formation, zu studieren, durch die Kombination von neuartige in-vitro- und in Ovo experimentellen Verfahren.

Zusammenfassung

Die Vogelgrippe Embryo wurde als ein experimentelles Modell von größter Bedeutung für die bahnbrechenden Entdeckungen in der Entwicklungsbiologie. Mehrere Ansätze, die Bildung von Wachteln-Huhn Chimären und die Verwendung der chorioallantoic Membrane (CAM), die Entwicklung von ektopische Gewebe reichen zurück bis in das letzte Jahrhundert zu erhalten. Heute bietet die Kombination aus diesen klassischen Techniken mit den letzten in-vitro- Methoden neuartige Perspektiven um Orgel Bildung weiter zu erforschen.

Hier beschreiben wir ein zweistufiges Konzept um - und Ende-Frühstadium der Organogenese zu studieren. Kurz, ist die embryonale Region mit dem mutmaßlichen Gebiet der Orgel von Wachteln Embryonen und angebaut in Vitro isoliert in einem organotypischen System (bis zu 48 Stunden). Kultivierten Gewebe sind anschließend auf der CAM ein Huhn Embryos gepfropft. Nach 10 Tagen in Ovo Entwicklung sind voll ausgebildete Organe veredelte Gewebe entnommen. Diese Methode ermöglicht auch die Modulation der Signalwege durch die regelmäßige Verabreichung von pharmakologischen Wirkstoffen und Genmanipulation der Gewebe im gesamten in-vitro- und in Ovo Entwicklungsschritte. Darüber hinaus kann Gewebe entwickeln bei jedem Zeitfenster zur Analyse ihrer Genexpression Profil (mit quantitativen PCR (qPCR), Microarrays, etc.) und Morphologie (bewertet mit konventionellen Histologie und Immundiagnostik) gesammelt werden.

Die experimentelle Prozedur dient als ein Werkzeug Orgel Bildung außerhalb der Vogelgrippe Embryo, von den frühen Stadien der Organogenese, voll ausgebildet und funktionelle Organe folgen.

Einleitung

Vogelgrippe Embryonen haben in zukunftsträchtigen Entwicklungsbiologie Studien verbreitet wurde. Die Hauptvorteile des Aviären Modells gehören die Möglichkeit zum Öffnen der Eier, die relativ einfachen Zugang zu den Embryo und die Fähigkeit, Mikromanipulation durchführen. Einige Beispiele umfassen die klassischen Wachtel-Huhn-Chimäre-System für das Studium Zelle Schicksal1, Anwendung von speziellen Wachstumsfaktoren der Embryo2und das Wachstum der ektopische Zellstrukturen in der CAM1,3, 4.

Um neue Einblicke in verschiedene Stadien der Orgel Formation zu erhalten, haben wir vor kurzem eine Methode entwickelt die Pfropfen Techniken mit in-vitro- Manipulation von embryonalen Gewebe5verbindet. Die zweistufigen Ansatz ermöglicht die Diskriminierung und Exploration von beiden frühen - und -spätstadien der Organogenese, die oft aufgrund der sehr dynamischen und komplexen Gewebe Interaktionen2begrenzt werden. Darüber hinaus das Fehlen von geeigneten Gewebe-spezifische Marker häufig schränkt die Verwendung von gentechnisch veränderten Tiermodelle6. Diese neuartige Methode der zweistufigen Ansatz überwindet weitgehend solche Beschränkungen.

Frühstadium der Orgel Formation, in einem ersten Schritt untersuchen die Wachtel embryonalen Gebiet bestehend aus prospektiven Orgel Rudiment isoliert und gewachsen in einem in Vitro organotypischen System für 48 h. Während dieser Zeit kann pharmakologische Modulation der spezifische Signalwege durch Hinzufügen von Drogen auf das Kulturmedium5,7durchgeführt werden. Darüber hinaus kultivierten Gewebe gesammelt zu irgendeinem Zeitpunkt des in-vitro- Wachstum und sondiert für Genexpression (mit Methoden wie qPCR, Microarrays, etc.).

Im zweiten Schritt 48 h-kultivierte Gewebe sind dann auf der CAM ein Huhn (c) Embryo im embryonalen Tag (E) 8 (cE8) gepfropft (Hamburger und Hamilton (HH)-Etappen 33-35)8. Die CAM verhält sich wie eine vaskuläre Lieferant von Nährstoffen und Gas Austausch1,3,4 , veredelte Gewebe ermöglicht seine Entwicklung in Ovo für längere Zeit erlaubt. Diese experimentelle Schritt ist besonders gut geeignet um spätstadien der Organogenese zu studieren als voll ausgebildete Organe nach 10 Tagen in Ovo Entwicklung5,9,10,11 gewonnen werden können . Morphologische Analyse erfolgt einfach durch konventionelle Histologie, angemessene Orgel Formation zu bestätigen und Spender Ursprung der Zellen durch Immunhistochemie mit Spezies-spezifische Antikörper (d.h., MAb Wachtel perinukleäre (QCPN)) identifiziert werden kann. Während der Inkubationszeit CAM können Transplantate auch in Anwesenheit von pharmakologischen Wirkstoffen angebaut und in jedem Stadium der Entwicklung, das Fortschreiten der Organogenese bewerten gesammelt werden.

Der hier beschriebene, in die Tiefe, zweistufigen Ansatz hat bereits in Figueiredo Et Al. beschäftigt 5 die Vogelgrippe Nebenschilddrüse/Thymus gemeinsame Primordium Entwicklung zu erkunden. Dementsprechend werden die inhärenten Besonderheiten der embryonalen Gebiete und Entwicklungsstadien der Organogenese beteiligt der Thymus und Nebenschilddrüsen unter vorgestellt.

Der Thymus und Nebenschilddrüsen Epithelien, entstammen zwar funktionell verschiedene, das Entoderm pharyngealen Beutel (PP)12. Stammen Vogelgrippe, die Epithelien dieser Organe aus der dritten und vierten PP Entoderm (3/4PP)12, während bei Säugetieren das zebrafischembryonen Epithel der 3PP entstammt und das Epithel der Nebenschilddrüsen aus dem 3PP und 3/4PP bei Maus und Mensch stammt, jeweils13,14.

Eines der frühesten Stadien bei der Bildung dieser Organe ist die Entstehung von diskreten Thymus und Nebenschilddrüse Domains in der gemeinsamen Primordium. Bei Hühnern können diese Domains von in Situ Hybridisierung mit spezifischen molekularen Markern, am E4.515identifiziert werden. Während Entwicklung voranschreitet, diese Orgel Rudimente individualisieren und aus dem Rachen zu trennen, während eine dünne Mesenchymale Kapsel, durch Neuralleiste stammenden Zellen gebildet, die sie (bei E5 umgibt; HH-stage-27). Später das zebrafischembryonen Epithel von hämatopoetischen Vorläuferzellen (bei E6.5; kolonisiert HH-stage 30)12.

Wie in Altertumswissenschaften Wachtel-Huhn1,12ist der zweistufigen Ansatz besonders nützlich, um die Bildung der hämatopoetischen/lymphatischen Organe, nämlich den Thymus5untersuchen. Da die Wachteln mit der Orgel Rudiment explant veredelt im Huhn Embryo vor der hämatopoetischen Vorläuferzellen Zelle Kolonisation, entsteht eine Chimäre Thymus mit Huhn Blut übertragbare Vorläuferzellen Wachtel zebrafischembryonen epithelialen Gegenstück zu infiltrieren. Diese Methode ist daher ein nützliches Werkzeug, um den Beitrag der hämatopoetischen Zellen in der Entwicklung des Aviären Hämato/lymphatischen Systems zu erkunden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle diese Experimente zu folgen, die Pflege der Tiere und ethischen Richtlinien des Centro Académico de Medicina de Lisboa.

1. Inkubation von befruchteten Wachteln und Hühnereier

  1. Inkubieren Sie japanischen Wachtel (Coturnix Coturnix Japonica) und (Gallus Gallus) befruchteten Huhneier 3 und 8 Tagen, beziehungsweise.
    1. Legen Sie die Eier mit der Luftkammer (Ei stumpfen Ende) nach oben in einem befeuchteten Inkubator bei 38 ° C.
    2. Verwenden Sie rund 20 Wachteleier und 40 Hühnereier, um dieses Experiment durchzuführen.
      Hinweis: Diese Zahlen sollte verdoppelt werden, wenn dieses Verfahren zum ersten Mal zur Gründung.

2. Isolierung der Wachtel embryonalen Region mit mutmaßlichen Gebietder Zebrafischembryonen und Nebenschilddrüse Grundlagen

Hinweis: Führen Sie Ei Manipulation Verfahren unter sterilen Bedingungen mit einer horizontalen Laminar-Flow-Kapuze und sterilisierte Instrumente und Materialien.

  1. Vorbereiten eine großen Borosilikat Glasschüssel über 3/4 gefüllt mit kaltem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Lösung.
  2. Öffnen Sie ein Wachtelei nach 3 Tagen Inkubationszeit, indem Sie auf die Schale und schneiden eine kreisförmige Öffnung auf der gegenüberliegenden Seite des stumpfen Ende mit gebogenen Schere. Sorgfältig entfernen Sie, Schale und übertragen Sie den Embryo auf die Glasschale gefüllt mit kaltem PBS.
  3. Halten Sie den Embryo Wachtel (Q) auf der E3 (qE3) (Wachtel Etappe entspricht der HH-Bühne 21 des Huhns) mit Hilfe von dünnen Zange. Machen Sie einen Schnitt in der dotterhäutchen Membran umhüllt das Eigelb mit einer gebogenen Schere. Weiter, um auch extern an den Umfang der extraembryonalen Schiffe zu schneiden.
  4. Transfer des Embryos zu einer kleinen Schüssel ca. 3/4 gefüllt mit kaltem PBS mit Hilfe von dünnen Zange. Den Embryo aus dem restlichen angeschlossenen Dotter gründlich zu waschen.
  5. Verwenden einen Skimmer, um den Embryo zu einem 100 mm Glas Petrischale mit schwarzem Sockel zu übertragen (siehe Tabelle der Materialien) mit 10 mL kaltem PBS.
  6. Ort der Petrischale unter einem Stereomikroskop.
    Hinweis: Ab diesem Punkt führen Sie die Mikrochirurgie Verfahren unter einem Stereomikroskop für progressive Vergrößerung. Als eine Beleuchtungsquelle ist es ratsam, LED-Leuchten im Stereomikroskop oder in der optischen Fasern aufgenommen, in Anbetracht der begrenzten Wärmelast verwenden.
  7. Den Embryo an der Unterseite der Platte mit dünnen Insekt Stifte zu halten. Platzieren von vier Pins bilden eine quadratische Form der extraembryonalen Region.
  8. Die extraembryonalen Membranen der cephalic Region mit Hilfe von dünnen Zange zu entfernen und dort eine fünfte Pin.
    Hinweis: Wenn der Embryo korrekt positioniert ist, sollte dann Gleichheitspartei Vesikel, das Herz Rohr, und die 1St2Ndund 3rd pharyngealen Bögen (PAs) sichtbar.
  9. Die embryonale Region of Interest, d. h., 3rd und 4th pharyngealen Bogen Region (3/4PAR), mit Wecker Auge Schere zu sezieren.
    1. Fang an zu schneiden längs und parallel zu der Embryo-Achse zwischen der Somiten/neuralen Schlauch und PAs.
    2. Entfernen Sie das ventral positionierte Herz Rohr durch Schneiden. Halten die Schere in der gleichen Position, drehen Sie die Petrischale um den Embryo entsprechend der Richtung des Schnittes zu positionieren.
    3. Schneiden Sie zwischen den 2Nd und 3rd PAs und unterhalb der 4th PA
    4. Die übrigen Membranen aus 3/4PAR mit Hilfe von dünnen Zange zu lösen.
  10. Aspirieren Sie die isolierte Gewebe (3/4PAR) und den Transfer zu einer Glasschale 3/4 mit kaltem PBS mit einer 2 mL sterile Kunststoff Pipette gefüllt.
    Hinweis: Im folgenden Geweben können angebaut in-vitro- bis zu 48 Stunden oder sofort die CAM ein Huhn Embryo in E8 aufgepfropft werden.
  11. Halten Sie die Glasschale mit isolierten 3/4PAR auf Eis während der Vorbereitung des in-vitro- Tests.

3. in Vitro organotypischen Assay: Kultur der embryonalen Region mit mutmaßlichen Gebietder Zebrafischembryonen und Nebenschilddrüse Grundlagen

  1. Bereiten Sie das Kulturmedium mit RPMI-1640 Medium mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
    Hinweis: Lösliche pharmakologische Reagenzien können auf das Medium (z. B. LY-411.575 (Ly) und di-Benzazepine oder Cyclopamine und Vismodegib, Kerbe und Igel (Hh) Signalwege, bzw. zu hemmen. hinzugefügt werden Für diesen Test 50-200 nM von Ly oder 5-15 µM der Di-Benzazepine um zu hemmen, Kerbe signalisieren in den 3 4PAR. verwenden / 20 µM Cyclopamine oder 10 µM von Vismodegib Hh Signalisierung in der 3/4PAR-5zu hemmen.
  2. Bereiten Sie die in-vitro- Kultur von 3/4PP Explant in einem 6-Well-Platte.
    1. Füllen Sie einen Brunnen aus dem 6-Well-Platte mit 5 mL Kulturmedium. Legen Sie eine 24 mm Polycarbonat Membran einfügen (siehe Tabelle der Materialien) mit Hilfe von dünnen Zange gut.
    2. Unter dem Stereomikroskop übertragen 3/4PAR Explant aus der Glasschale auf der Membranoberfläche indem Sie sanft mit Hilfe einer Transplantation Löffel (oder Spachtel) und dünne Zange. Legen Sie die Explantate mit der ventralen Seite nach oben und der dorsalen Seite in Kontakt mit der Membran. Fügen Sie bis zu sieben Explantaten pro Membran einfügen. Fahren Sie mit Schritt 3.4.
  3. Alternativ explants Kultur in schwimmenden Membranfilter.
    1. Bereiten Sie eine 35 mm Petrischale mit 5 mL Kulturmedium. Mit Hilfe von dünnen Zange, Schwimmer eine Membran Filtern (siehe Tabelle der Materialien) und eine trockene Oberfläche Kontakt mit der Luft zu halten.
    2. Unter dem Stereomikroskop transfer 3/4PAR Explant aus der Glasschale zum Membranfilter durch sanftes Gleiten mit Hilfe einer Transplantation Löffel (oder Spachtel) und dünne Zange. Legen Sie die Explantate mit der ventralen Seite nach oben und der dorsalen Seite in Kontakt mit der Membran. Fügen Sie bis zu 8 Explantaten pro Membranfilter.
  4. Legen Sie vorsichtig die Explantaten in 3.2 und 3.3 in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2Schritte vorbereitet.
  5. Nach einer Inkubationszeit von 48 h 6-Well-Platte und die 35 mm Petrischale aus dem Inkubator zu entfernen.
    1. Sammeln Sie die kultivierten Explantaten aus der Membran-Einsatz von 6-Well-Platte.
      1. Die Membran einfügen PBS bei Raumtemperatur (RT) hinzufügen.
      2. Nehmen Sie Explantaten aus der Membran durch kräftiges Spülen mit einer 2 mL sterile Kunststoff-Pipette ab.
      3. Übertragen Sie mit Hilfe von Spachtel und dünne Zange die kultivierten Explantaten zu einer Glasschale 3/4 gefüllt mit PBS bei RT
    2. Ebenso sammeln Sie die kultivierten Explantaten von schwimmenden Membranfilter in 35 mm Petrischale.
      1. Membranfilter mit dünnen Pinzette zu übertragen, um eine neue 35 mm Petrischale gefüllt mit PBS bei RT
      2. Nehmen Sie Explantaten aus dem Membranfilter durch kräftig Pipettieren mit einer 2 mL sterile Kunststoff Pipette ab.
      3. Tilgen Sie mit Hilfe von dünnen Zange Explant-freie Membranfilter, nachdem bestätigt wird, dass keine Explantaten blieb daran befestigt.
      4. Übertragen Sie mit einem Spatel und dünne Zange die Explantaten auf einer Glasschale gefüllt mit PBS bei RT
  6. Die kultivierten Explantaten mit einem Spatel zu 1 mL Reagenz für total RNA Isolierung zu übertragen und verwenden für Genexpression Studien.
    Vorsicht: Dieses Reagenz kann (siehe Tabelle der Materialien) ein ernstes Gesundheitsrisiko sein. Tragen Sie geeignete Schutzbrille, Kleidung und Handschuhe. Befolgen Sie die Handhabung und lesen Sie die Sicherheitsdatenblätter des Herstellers zu.
  7. Alternativ Transplantat der kultivierten Gewebe auf CAM von Hühnerembryos am E8. Folgen Sie mit Schritt 4 fort.

4. Vorbereitung der CAM

  1. Entfernen Sie die Hühnereier mit 8 Tagen Embryonalentwicklung aus dem Inkubator.
    Hinweis: Eier wurden mit Luftkammer mit Blick nach oben bei 38 ° C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert.
  2. Decken Sie die stumpfe Ende des Eies mit durchsichtigen Klebeband zu verhindern, dass Teile der Schale fallen in die Luftkammer. Tippen Sie auf die Schale und geschnitten Sie eine kreisförmige Öffnung in das Ei mit gebogenen Schere. Die Luftkammer sollte sichtbar sein.
  3. Entfernen Sie mit Vorsicht die weiße Membran der Luftkammer mit dünnen Pinzette. CAM ist dann sichtbar und zugänglich für ektopische Gewebetransplantation.
    Hinweis: Verwenden Sie nicht PBS Hydrat der CAM, vor oder nach der Transplantation, da PBS Gleit- und Abhandenkommen der Explantate fördert. Wenn die Membran austrocknet, verwerfen Sie das Ei.

(5) Pfropfen von kultivierten Explantaten auf der CAM

  1. Erstellen Sie kleine vaskuläre Läsionen/Wunden in den kleineren Gefäßen des Nockens mit einer Microscalpel in einer Halterung.
    Hinweis: Verwenden Sie die Spitze einer Pasteurpipette, um Blut durch Kapillarität bei übermäßige Blutungen zu entfernen.
  2. Verwenden Sie einen Spachtel und dünne Zange um kultivierten Explant auf den verletzten Bereich des Nockens übertragen.
  3. Schneiden Sie ein Stück von einem Filterpapier etwas größer als die modellabhängigen und legen Sie es auf der Oberseite der modellabhängigen.
    Hinweis: Das Filterpapier hilft Verfolgung der modellabhängigen Position nach seiner Entwicklung in der CAM. Es erlaubt auch tägliche Drug-Delivery, die modellabhängigen Entwicklungsphase in Ovo , bei Bedarf (im Schritt 5.6 beschrieben).
  4. Das Ei-Fenster mit durchsichtigen Klebeband verschließen und mit einem Kohlestift identifizieren.
    Hinweis: Das Kunststoffband schützt den Embryo vor Austrocknung während der Inkubationszeit.
  5. Inkubieren Sie das manipulierte Ei für 10 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 38 ° c Folgen Sie mit Schritt 6 fort.
  6. Optionaler Schritt: Tägliche Gesundheitsbehörde während der Inkubationszeit.
    1. Um den Filter zu gelangen, heben Sie teilweise das Kunststoffband auf. Fügen Sie 100 µL medikamentenlösung, Tropfen für Tropfen auf dem Papier. Verschließen Sie das Fenster wieder zu und das Ei wieder in den befeuchteten Inkubator bei 38 ° C.
      Hinweis: Für diesen Test wird die Dosis von 20 µM Cyclopamine hemmen Hh Signalisierung während in Ovo Entwicklung5.

(6) ektopische Orgel Formation im Camchat nach 10 Tagen In Ovo Entwicklung

  1. Entfernen Sie nach 10 Tagen Inkubation das Ei aus dem Inkubator und ziehen Sie sorgfältig das Kunststoffband.
  2. Schneiden Sie die CAM rund um die Filter-Region mit gebogenen Schere und Übertragung der CAM abgeleitet Explant mit Filterpapier auf ein kleines Glas Schüssel ca. 3/4 gefüllt mit kaltem PBS.
  3. Übertragen Sie mit Hilfe von dünnen Zange die CAM abgeleitet Explant mit einem 100 mm Petrischale mit schwarzen Sockel mit 10 mL PBS. Entfernen Sie vorsichtig das Filterpapier und der Überschuß der Membran mit Wecker Auge Schere und dünne Zange.
  4. CAM-Explant Fixativ Lösung zu übertragen (3,7 % PFA mit PBS-Puffer) mit einem Schaumlöffel. Einschläfern der Hühnerembryos ohne herausnehmen aus dem Ei durch einen präzisen Schnitt in den Hals-Bereich des Embryos mit Hilfe der großen Schere machen.
  5. Beurteilen Sie die Orgel-Bildung in Paraffin Abschnitten des CAM-abgeleitete Explantaten durch konventionelle Histologie und Immunhistochemie.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die oben beschriebenen Protokolldetails eine Methode, die Untersuchung der beiden frühen - und -spätstadien der Organogenese, oft begrenzt durch komplexe zelluläre und molekulare Interaktionen ermöglicht.

Diese Methode war zuvor in Figueiredo Et Al. beschäftigt. 5 , die Rolle der Kerbe und Hh-Signalisierung bei der Vogelgrippe Nebenschilddrüse/Thymus gemeinsame Primordium Entwicklung zu entwirren...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Ein wesentlicher Aspekt für den Erfolg dieser Methode ist die Qualität der Hühner und Wachteln Eier. In Anbetracht der langen Inkubationszeiten, besonders während der in Ovo Test, eine gute Qualität von Hühnereiern verbessert Preise Lebensfähigkeit (bis zu 90 %) durch das Ende des Verfahrens. Um dies zu erreichen, Eier von verschiedenen Herstellern zu testen. Brüten unmanipuliertes Eier über einen längeren Zeitraum (bis zu 16-17 Tage) und ihre Entwicklung zu überprüfen. Um eine gute Qualität-Charge in Betracht g...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren sind António Cidadão, Isabel Alcobia und Leonor Parreira dankbar für die kritische Lektüre des Manuskripts zu Padma Akkapeddi für video Erzählung und Vitor Proa aus der Histologie-Service des Instituto de Histologia e Biologia zufügen Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, für den technischen Support. Wir sind insbesondere verpflichtet, Paulo Caeiro und Hugo Silva aus Unidade de Audiovisuais (Referat audiovisuelle Medien), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa für ihr herausragendes Engagement für die Produktion von diesem Video. Wir anerkennen Leica Microsystems freundlicherweise dafür ein Stereoskop ausgestattet mit video-System und Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A. für den Beitrag mit Wachteln Eier befruchtet. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Mit Hühnern befruchtete Eier (Gallus gallus)Pintobar, PortugalGeflügelzucht 
Mit Wachteln befruchtete Eier (Coturnix coturnix)Interaves, PortugalVogelfarm 
15 mL PP ZentrifugenröhrchenCorning430052
50 mL PP ZentrifugenröhrchenCorning430290
60 x 20 mm PyrexschalenDuran Gruppe21 755 41
100 x 20 mm PyrexschalenDuran Gruppe21 755 48
Polycarbonat MembraneinsatzCorning341224 mm Transwell mit 0,4 mm Poren-Polycarbonat-Membraneinsatz 
MembranfilterMilliporeDTTP013000,6 mm Isopore Membranfilter
6-Well-KulturplattenNunc, Thermo Fisher Scientific140675
Petrischale, 35 x 10 mmSigma-AldrichP5112 
Pyrex-Schalenaus dem Supermarkt 
TransferpipettenSamco Scientific, Thermo Fisher Scientific2041S2 mL Kunststoffpipette
Glaspasteurpipettenormax5426015
Whatman  qualitatives FilterpapierSigma-AldrichWHA1001090Filterpapier
durchsichtiges Kunststoffbandaus dem Supermarkt 
Cytokeratin (pan; sauer und basisch, Typ I und II Cytokeratine), Klon Lu-5BMA BiomedicalsT-1302
CyclopaminhydratSigma-AldrichC4116Pharmakologischer Inhibitor des Hh-Signalwegs
Fötales RinderserumInvitrogen, Thermo Fisher ScientificStandart FBS
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
Penicillin-StreptomycinInvitrogen, Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)GIBCO, Thermo Fisher Scientific10010023
QCPNAntikörper-Entwicklungsstudien Hybridoma BankQCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Ergänzung GIBCO, Thermo FisherScientific 61870010
Bluesil RTV141A/B Silikonelastomer 1,1 kg KitELKEM/SilmidRH141001KGZur Vorbereitung der hinteren Basis für die Petrischale
Stemolecule LY411575Stemgent04-0054Pharmakologischer Inhibitor des Notch-Signalwegs
TRIzol ReagenzInvitrogen, Thermo Fisher Scientific15596026Reagenz für die vollständige RNA-Isolierung
Dumont #5 PinzettenFine Science Werkzeuge11251-30 Dünne Pinzette
Extra feine Bonn Schere, gebogenFine Science Tools14085-08Gebogene Schere
Insektenstifte Fine Science Tools26001-30
Mikrospatel Fine Science Tools10087-12Transplantationslöffel
Minutien PinsFine Science Tools26002-20Microscalpel
Moria Vernickelter StifthalterFine Science Tools26016-12Halter
Moria Perforierter LöffelFine Science Tools10370-17Skimmer
Wecker AugenschereFine Science Tools15010-11
KameraLeica Microsystems MC170 HD-Stereoskop
Leica Microsystems Leica M80
MikroskopLeica Microsystems DM2500

Referenzen

  1. Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
  2. Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
  3. Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
  4. Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
  5. Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
  6. National Research Council. Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , The National Academies Press. Washington, DC. (2000).
  7. Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660(2011).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
  9. Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
  10. Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
  11. Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
  12. Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
  13. Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
  14. Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
  15. Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
  16. Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
  17. Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
  18. Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
  19. Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

In-vitro-KulturChorioallantois-MembranSchlundbögenThymusentwicklungGenexpressionsanalyseHistologieImmunhistochemiepharmakologische Modulation
Zweistufigen Ansatz - und Ende-Frühstadium der Orgel Formation im Vogelgrippe-Modell zu erkunden: die Thymusdrüse und Nebenschilddrüsen Organogenese Paradigma
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.