Methodenartikel

Bestimmen, ob DNA mit einem Cyanin Farbstoff kann nicht verdaut werden mit Restriktionsenzymen gebeizt

DOI:

10.3791/57141

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2. Februar 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Nebraska - Kearney

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Färbung der DNA-Moleküle für die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht eine Wissenschaftler um sie während eines Experiments zu sehen. In die hier vorgestellte Methode sind DNA-Moleküle vorab mit Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt und mit Methylierung und nicht-Methylierung sensibel Restriktionsenzymen verdaut.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Visualisierung der DNA für die Fluoreszenzmikroskopie nutzt eine Vielzahl von Farbstoffen wie Cyanin-Farbstoffe. Diese Farbstoffe werden aufgrund ihrer hohen Affinität und Sensibilität für DNA eingesetzt. Um festzustellen, ob die DNA-Moleküle in voller Länge nach Abschluss des Experiments sind, ist eine Methode erforderlich, um festzustellen, ob die gefärbten Moleküle in voller Länge sind von DNA mit Restriktionsenzymen verdaut. Gefärbten DNA kann jedoch die Enzyme hemmen, so eine Methode benötigt wird, um festzustellen, welche Enzyme, die man für Fluorochrom verwenden DNA befleckt. Bei dieser Methode wird DNA gefärbt, mit einem Cyanin-Farbstoff über Nacht um den Farbstoff und DNA zu equilibrate ermöglichen. Nächste, gefärbten DNA ist mit einem Restriktionsenzym verdaut, geladen in ein Gel und electrophoresed. Die experimentelle DNA-Digest-Bänder sind ein in Silico -Digest zu bestimmen, die Beschränkung Enzym-Aktivität gegenüber. Wenn es die gleiche Anzahl von Bands wie erwartet, ist die Reaktion abgeschlossen. Mehr Bands als erwartet, teilweise Verdauung zeigen und weniger Bands zeigen unvollständige Verdauung. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt in seiner Einfachheit und es verwendet Geräte, die ein Wissenschaftler für ein Restriktionsenzym müssten assay und gel-Elektrophorese. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass die Enzyme zur Verfügung, um die meisten Wissenschaftler im Handel erhältlichen Enzyme sind; jedoch konnte Restriktionsenzyme verwendet werden.

Einleitung

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Die TOTO-Serie (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, und BOBO-3; Tabelle 1) wird in einer Vielzahl von Experimenten verwendet wo die Visualisierung der DNA erforderlich1,2,3,4,5,6,7, ist 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. Cyanin-Dimer-Familie ist weit verbreitet, aufgrund ihrer Quantenausbeute, Empfindlichkeit und hohe Affinität für DNA-Moleküle18,19,20. Cyanin Dimer Farbstoffe haben große Selektivität für doppelte stranded DNA und wenn Zwischenspiele einen 100 bis 1000 fachen Anstieg der Fluoreszenz21haben. Pyridiniumdichromat Farbstoffe (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 und TOTO-3) haben eine kürzere Emissionswellenlänge als ihre Quinolium färben (BOBO-1, POPO-1, BOBO-3 und POPO-3) Pendants (Tabelle 1)22. Auch die Quantenausbeute für Cyanin Dimere Zwischenspiele in DNA ist hoch (0,2 - 0,6)22. Mithilfe eines Enzyms bestimmen das Profil der Methylierung von DNA-Molekül2 oder dehnen23 eines DNA-Moleküls, die bereits mit fluoreszierenden Farbstoff gefärbt erfordert jedoch eine Methode, um festzustellen, welche Enzyme wird gebeizt DNA zu verdauen. Jede Art von Farbstoff, die in DNA Plasmamembrane oder jedes Enzym, das eine erkennbare Muster des Substrats DNA gibt kann für diese Methode verwendet werden.

Meng Et Al. bestimmt zunächst die Verdauung bei prestained DNA durch Gelelektrophorese mit einer Vielzahl von verschiedenen Farbstoffen24. Maschmann Et Al. vertieft tiefer zu betrachten, die TOTO-Familie von Farbstoffen. Beide entschlossen die Verdauung bei gefärbten DNA zu sehen, ob DNA mit einem bestimmten Farbstoff gefärbt mit einem Restriktionsenzym25verdaut werden könnte. Andere Methoden studieren Bindung Auswirkungen von Farbstoffen mit DNA mit Hilfe von optischen Pinzette26 oder NMR27eingelagert. Entweder-Methode erfordert spezialisierten Ausrüstung; in der Erwägung, dass mit dieser Methode können Geräte, die meisten molekularbiologischen Labore haben um festzustellen, ob ein Farbstoff stört eine Beschränkung Enzym Verdauung.

Darüber hinaus hat optische Zuordnung in andere Methoden, um die Länge eines bestimmten Moleküls zu messen, länglich ungefärbten DNA-Moleküle auf einer Oberfläche und verdaut DNA, um die Ausdehnung und Größe der Fragmente zu bestimmen. Interkalation von Farbstoff wurde gezeigt, dass die Kontur Länge der Gewebekulturen gefärbten DNA-Moleküle und abhängig von der Farbstoff verwendet, die Konturen Längen sind verschiedene21. Diese Methode wurde verwendet worden, in einer Vielzahl von Genome1,3,4,6,13,28,29,30, 31. jedoch wenn Moleküle vor gebeizt, je nach Farbstoff und Enzym, das Enzym möglicherweise nicht zum Schneiden von DNA mit einem bestimmten Farbstoff gefärbt. Diese Methode bestimmt somit, wenn DNA mit einem bestimmten Farbstoff gefärbt mit einem Enzym verdaut werden kann. Darüber hinaus werden abhängig von der Konzentration des Farbstoffes und der Farbstoff genutzt, die Mobilität der DNA Bands in einem Gel langsamer als native DNA aufgrund der teilweise Abbau der DNA Rückgrat um Platz für den Farbstoff zwischen Basenpaare32 einfügen zu migrieren .

Aber manchmal diese Farbstoffe können teilweise oder vollständig hemmen die Wirkung von bestimmten Restriktionsenzyme7,24. Dies ist vermutlich aufgrund eines strukturellen Wandels in der DNA verursacht durch die Befestigung der Fluoreszenzfarbstoff, die das Enzym kann verhindern, dass seine spezifischen Reihenfolge zu erkennen. Verstehen, wie diese Farbstoffe Restriktionsenzyme beeinflussen kann in Experimenten helfen wo die Methylierung-Profil oder die gefärbten DNA-Abschnitt erforderlich ist.

In unserer Methode wurde DNA befleckt mit einem Fluorochrom von Interesse und mit einem Restriktionsenzym verdaut. Dann wurde die DNA auf einem Gel, abgebildet, electrophoresed und die Beschränkung Enzym Verdauung wurde gemessen. Die Restriktionsenzyme wurden basierend auf den geschnittenen Muster auf einem Gel gewählt. Zu viele Bands verursacht Überlappung der DNA-Bänder und zu wenige Bands gaben kein vollständiges Bild des DNA-Moleküls. Es gibt ein Sweet Spot, das Profil der verdauten DNA-Moleküls bestimmen zu können; Daher hängt es von der DNA verwendet und das Enzym. Ein Vorteil dieser Methode ist seine Einfachheit; Es erfordert nur eine Einschränkung Verdauung und Gel-Elektrophorese verwendet.

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Protokoll

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1. Vorbereitung von Farbstoffen, Puffer und Agarose-Gel

  1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen zum Beizen von DNA oder die Verdauung von gefärbten DNA.
    1. Bereiten Sie 1 X TE (Tris-HCl und Ethylenediaminetetraacetic Säure; EDTA)-Puffer mit 10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA in einem Messzylinder oder volumetrischer Kolben. Lagerung bei Raumtemperatur (18-25 ° C).
    2. Aliquote jede Farbe zu machen: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (Tabelle 1). Pipette 4 µL 1 mM Farbstoff in einem dunkel gelb oder schwarz 1,5 mL-Tube und 36 µL 1 X TE hinzufügen, mischen Sie mit der Pipette; Diese Konzentration macht ein 100 µM Farbstofflösung (insgesamt 40 µL). Führen Sie diesen Schritt für jede Farbe. Shop bei 4 ° C.
      Hinweis: Vermeiden Sie Farbstoff, Licht, um Immunofluoreszenz oder Abbau des Farbstoffs zu verhindern.
    3. Bereiten Sie Puffer 1 mit 10 mM Bis-Tris-Propan-HCl, 10 mM MgCl2und 100 µg/mL Rinderserumalbumin (BSA). Bereiten Sie Puffer 2 mit 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2und 100 µg/mL BSA. Bereiten Sie Puffer 3 mit 50 mM Kalium Acetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesium-Acetat und 100 µg/mL BSA. Jedes Enzym benötigen eine dieser speziellen Puffer funktioniert.
  2. Bereiten Sie die folgenden Lösungen für Gelelektrophorese.
    1. Machen ein 6fach laden Farbstoff durch die Kombination von 0,25 % Bromophenol blue, 0,25 % Xylol Cyanol, 15 % Ficoll dH2O. Store bei Raumtemperatur.
    2. Um eine 0,7 % Agarose gel, Abwiegen 0,07 g hohe Geliermittels Temperatur (HGT) Agarose in einen Erlenmeyerkolben, 100 mL 1 X TAE Puffer hinzufügen und ein umgekehrtes Becherglas auf den Kolben.
      1. Erhitzen Sie die Lösung auf einer heißen Platte, bis Bläschen zu bilden auf der Unterseite der Flasche und der Schwimmer nach oben beginnen.
      2. Entfernen Sie die Lösung von der Heizplatte, lassen Sie die Lösung abkühlen, bis der Kolben mit bloßen Händen berührt werden und dann gießen Sie das Gel in eine 24,5 x 21,8 cm Gel-Form mit einem Gel Kamm Brunnen erstellen kann.
      3. Entfernen Sie Luftblasen in der Nähe der Kamm oder auf der Oberfläche des Gels durch Tauchen sie mit einer Pipettenspitze und lassen Sie das Gel mindestens 15 Minuten lang zu festigen. Dies kann in einem Kühlschrank (4 ° C), eingewickelt in Plastikfolie für 1 Woche um zu verhindern, Trocknung von Gel oder Kontamination gespeichert werden. Weitere Informationen zum Ausführen ein Gels beziehen sich auf Lee Et al. 33 .
        Hinweis: Verwenden Sie einen Gel-Kamm mit 30 einzelnen Brunnen. Jeder sollte gut 4,5 mm breit mit einer Tiefe von 2 mm. Die Höhe des Brunnens hängt von der Menge des Gels in die Box gegossen.
    3. Bereiten Sie 1 X TAE (Tris - Acetat - EDTA)-Puffer mit 40 mM Tris-HCl, Essigsäure 20 mM und 1 mM EDTA vor. Lagerung bei Raumtemperatur (18-25 ° C).

2. Vorbereitung des gefärbten DNA

  1. Färben Sie Lambda DNA (300-800 ng) mit verschiedenen Aliquote von Farbstoffen. Jede Farbe (Tabelle 1) werden sechs verschiedene Konzentrationen getestet, für eine Gesamtmenge von 48 Reaktionen pro Restriktionsenzym haben. Das folgende Verfahren beschreibt eine Reihe von für 1 Reaktion (Abbildung 1).
    1. Verdünnen Sie Lambda DNA mit 1 X TE bis 100 ng / µL. Store bei 4 ° C. Machen Sie eine Lösung mit Gesamtvolumen von 300 µL.
    2. Führen Sie unmethylated Lambda DNA zu Flecken. Schätzen Sie für jedes Band erwartet aus dem Digest 75-100 ng/Band. Fügen Sie entsprechende Mengen Farbstoff herzustellen Konzentrationen von 1,9 µM, 3.8 µM, 19,4 µM, 32,2 µM, 48.3 µM 63,5 µM / 100 ng DNA.
    3. Über Nacht inkubieren (15 h - 18 h) bei 4 ° C.
    4. Lassen Sie eine Reaktion unbefleckt, um wie ein Steuerelement25zu handeln.
      Hinweis: Verwenden Sie unmethylated DNA für die Verdauung Reaktion. Methylierung empfindlichen Enzyme nicht methylierte DNA Regionen schneiden und geben den Anschein von einer unvollständigen Verdauung.

3. Vorbereitung der Beschränkung Enzym-Assays

  1. Digest gebeizt DNA mit einem Restriktionsenzym um festzustellen, ob dieses Enzym prestained DNA (Abbildung 1) verdauen kann.
    1. Am folgende Tag, fügen Sie 20 U der Restriktionsenzym, 3 µL des entsprechenden Puffers (Tabelle 2), und destilliert, autoklaviert und gefiltertes Wasser für eine Gesamtmenge von 30 µL. Wählen Sie für jede Enzymreaktion Puffer mit höchster Zerspanungsleistung, die auf der Website des Herstellers finden.
    2. Legen Sie die Reaktionen in einem Wasserbad bei einer Temperatur von optimale enzymatische Aktivität, für die 6 Enzyme Maschmann Et al.in Tabelle 2 aufgeführt., für 2-4 h (Tabelle 2)25.
    3. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 2 µL 0,5 M EDTA pH 8.0.

4. Electroeluting gebeizt DNA in ein Agarose-Gel

  1. Entfernen Sie die Seiten aus der 24,5 x 21,8 cm Gel Form (Schritt 1.2.2) und legen Sie das Gel in der Gel-Elektrophorese-Box. Gießen Sie 2,5 L 1 X TAE-Puffer in der Box. Entfernen Sie vorsichtig den Gel-Kamm aus dem Gel so Brunnen zugänglich33sind.
  2. Pipette Restriktionsenzym Reaktionen auf einer Kunststoff-Folie und jede Reaktion mit 6 x laden Farbstoff zu kombinieren. Fügen Sie für jede Reaktionslösung 1 µL 6 x laden Farbstoff pro 5-6 µL DNA-Lösung (1 X). Dann pipette die Reaktionen (der Farbstoff beladen mit < 18 µL) in die Vertiefungen.
  3. Mischen Sie 1 µL 1 kb Leiter, 9 µL 1 X TE und 2 µL 6 x laden Farbstoff. Laden Sie die Projektmappe in die Vertiefungen, die anderen Lösungen zu flankieren.
  4. Decken Sie die Gel-Box mit dunkel blauen oder schwarzen Papier oder Stoff. Verbinden Sie die Gel-Box an eine Stromversorgung, die Stromversorgung auf 30 V, und es über Nacht laufen (15-20 h). Schalten Sie das Licht, während das Gel läuft, um Photocleavage der beschrifteten DNA zu verhindern.
  5. Schalten Sie am nächsten Morgen die Stromversorgung. Nehmen Sie das Gel mit dem Fach und in einem Behälter mit 45 µL Interkalation Bromid und 1 L 1 X TAE Puffer übertragen. Speichern des Behälters bei Raumtemperatur im Dunkeln oder Abdeckung in Folie, Lichteinfall zu verhindern. Lassen Sie Gel Fleck für mindestens 45 Minuten bei Raumtemperatur.
    Achtung: Verwenden Sie Interkalation Bromid mit Handschuhe und tragen Sie Schutzbrille. Bei der Reinigung der Behälter, die Interkalation Bromid Lösung enthält und das Gel wegwerfen, wenden Sie sich an Ihren Staaten Entsorgung Leitlinien zum Umgang mit gebrauchten Interkalation Bromid zu bestimmen; Darüber hinaus können andere Flecken anstelle von Interkalation Bromid genutzt werden.

5. imaging das Agarose-Gel

  1. Legen Sie das Gel auf ein blaues Licht Transilluminator, die maximale Lichtleistung zwischen 400-500 nm emittiert. Fotografieren Sie mit der Kamera an die Station angeschlossen.
    Achtung: Stellen Sie sicher, verwenden Sie die Abdeckung für den Strahler und legte auf Schutzbrille vor die Lichtquelle einschalten.
    Hinweis: Dieser Schritt kann auch mit einem UV-Lichtquelle oder standard Gel Scanner ausgeführt werden.
  2. Sehen Sie die Bilder in ImageJ durch Ziehen der das auf der Statusleiste ImageJ und das Bild wird eingeblendet.
  3. Durch den Vergleich der Bands auf dem Gel, das erwartete in Silico Gel Muster wird die Verdauung Geschwindigkeit für das Experiment bestimmt. Um die Verdauung Rate zu ermitteln, ist die Anzahl der experimentellen Gruppen mit der erwarteten Anzahl von DNA-Bänder24,25unterteilt. Wenn das experimentelle verdaute DNA-Band Muster das erwartete Muster hat, ist die Verdauung 1. Wenn das Muster mehr Fragmente als erwartet hat, ist die Verdauung Rate größer als 1. Wenn das Muster weniger Fragmente als erwartet hat, ist die Verdauung Rate kleiner als eins.

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Ergebnisse

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Um festzustellen, wenn ein intercalating Farbstoff ein Restriktionsenzym verdauen DNA auswirkt, muss die richtige Reihenfolge der Schritte sein gefolgt (Abbildung 1). Sobald DNA ist gebeizt und mit einem bestimmten Enzym verdaut, kann ein Bild des Gels aufgenommen werden, bestimmen die Anzahl der Fragmente und ihrer Größe (Abbildung 2). Um die Enzym-Effizienz, die Gesamtzahl der erwarteten sichtbare Bänder geteilt durch die Anzah...

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Diskussion

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Um Eindringmittel beschrifteten DNA (Abbildung 1)zu verdauen, sind eine Reihe von Schritten erforderlich. Erstens ist DNA über Nacht mit einem Fluorochrom befleckt. DNA kann für einen kürzeren Zeitraum mit Cyanin Dimere inkubiert; Allerdings fand Carlsson Et Al. , dass DNA doppelte Bändern für jede DNA-Größe aufgrund unvollständiger Färbung20erstellt. Um dem abzuhelfen, kann die DNA über Nacht zu verhindern, dass doppelte Bänder gebeizt. Dies...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde durch das nationale Institut für allgemeine medizinische Wissenschaft (NIGMS) (5605100122001), eine Komponente des National Institute of Health (NIH), und die University of Nebraska Kearney (UNK) Sommer Student Research Program (SSRP) und UNK finanziert. Undergraduate Research Fellowship (URF).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Unmethylierte Lambda-DNANEBN3013S
YOYO-1ThermoFisher ScientificY3601
TOTO-1ThermoFisher ScientificT3600
POPO-1ThermoFisher ScientificP3580
BOBO-1ThermoFisherScientific B3582
YOYO-3ThermoFisher ScientificY3606
TOTO-3ThermoFisher ScientificT3604
POPO-3ThermoFisher ScientificP3584
BamHINEBR0136S
PmlINEBR0532S
ScaINEBR3122S
EcoRI NEBR0101S
HindIIINEBR0104S
SmaINEBR0141S
TrisFisherBP152-1Reizstoff
EDTAFisherS316-212Giftig
HClFisherS25358und reizender
Puffer 1NEBB7201SNEB 1.1
Puffer 2NEBB7202SNEB 2.1
Puffer 3NEBB7204SNEB Cutsmart
Agarosegel mit hoher GeliertemperaturLonza50041
EssigsäureFisherS25118Gefährlicher
Blaulicht-TransilluminatorDark ReaderDR196Tragen Sie die richtige Brille 
EthidiumbromidFisher15585011krebserregend; andere Alternativen sind Nancy 520, Gel rot, etc.
Cannon EOS Rebel T3I KameraCannon
Apogee Model H4Biorad1704510
Power Pac Basic NetzteilBiorad1645050 
FicollFisher ScientificBP525-25
BromphenolblauFisher ScientificB-392
Xylol CyanolEastmenT1579
Ätzender

Referenzen

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Schlagwörter

DNA Verdaufluoreszierende DNAGelelektrophoreseAgarosegelEnzymeffizienzBandenanalyseEthidiumbromidBlaulicht Transilluminator

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