Methodenartikel

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

DOI:

10.3791/57146

⸱

30. April 2018

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1Cell Cycle and Cancer Biology Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Zebrafisch wurden vor kurzem als in Vivo Modellsystem verwendet, um DNA-Replikation Timing während der Entwicklung zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung von Zebrafisch-Embryonen Profil Replikation Timing. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um Replikation Timing in einzelnen Zelltypen, Mutanten, Krankheitsmodelle und andere Arten zu studieren.

Zusammenfassung

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DNA-Replikation Timing ist eine wichtige zelluläre Eigenschaft, wichtige Beziehungen mit Chromatinstruktur, Transkription und DNA Mutationsraten ausstellen. Änderungen im Zeitplan der Replikation auftreten während der Entwicklung und in der Krebstherapie, aber die Rolle Replikation Timing spielt in der Entwicklung und Krankheit ist nicht bekannt. Zebrafisch entstanden vor kurzem als in Vivo Modellsystem Replikation Timing zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung der Zebrabärbling zur DNA-Replikation Zeitpunkt bestimmen. Nach der Sortierung der Zellen aus Embryonen und Erwachsenen Zebrafisch, können hochauflösende genomweite DNA Replikation Zeitverzögerungsmuster konstruiert werden, durch die Bestimmung der Veränderungen der DNA-Kopienzahl durch Analyse der nächsten Generation Sequencing-Daten. Der Zebrafisch-Modell-System ermöglicht eine Auswertung der Replikation Timing Veränderungen, die auftreten, während der gesamten Entwicklung in vivo, und kann auch zu Veränderungen in einzelnen Zelltypen, Krankheitsmodelle oder mutierten Linien verwendet werden. Diese Methoden ermöglichen es Studien untersuchen die Mechanismen und Determinanten der Replikation Timing Aufbau und die Pflege während der Entwicklung, die Rolle Replikation Timing spielt in Mutationen und Tumorgenese und die Auswirkungen der erkunden Replikation Timing auf Entwicklung und Krankheit.

Einleitung

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Für die Zellen sich zu teilen erfolgreich müssen sie zuerst genau und treu ihre gesamte Genom repliziert werden. Genom Verdoppelung tritt in einem reproduzierbaren Muster, bekannt als der DNA-Replikation Timing Programm1. DNA-Replikation Timing korreliert mit Chromatin Organisation, epigenetischen Markierungen und Gen Ausdruck2,3. Änderungen im Timing der Replikation treten während der gesamten Entwicklung und sind deutlich Bezug auf transkriptioneller Programme und Änderungen zum Chromatin Marken und Organisation4,5. Darüber hi....

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Protokoll

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Alle Tiere wurden in strikter Übereinstimmung mit Protokollen, die durch die Oklahoma Medical Research Foundation institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt behandelt.

1. Einrichten von Erwachsenen Zebrafisch für die Zucht

  1. Eine große Kohorte von erwachsenen männlichen und weiblichen Zebrafisch eines einzigen Stammes zur Zucht zu verwenden. Es gibt kleine Unterschiede in der genetischen Zusammensetzung der Zebrafisch sogar eines einzelnen Stammes, eine große Kohorte zu verwenden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse repräsentativ für die genetische Variabilität der Bevölkerung und nicht beschränkt auf einen kleinen ....

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Ergebnisse

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Verwendung von veröffentlichten Replikation Zeiterfassungsdaten, repräsentative Replikation Timing Profile und Qualitätssicherungsmaßnahmen15angeboten. Die ersten Schritte der Verarbeitung beinhalten Ausrichten der Sequenzierungsdaten, das Genom, Berechnung lesen Sie Länge und Genom Abdeckung Statistiken und geringe Filterqualität ungepaarte, und PCR-doppelte liest. Lesen Sie Statistiken für eine typische Zebrafisch Sequenzierung Probe werden in

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Diskussion

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Zebrafisch bieten ein neues und einzigartiges in Vivo Modell, DNA-Replikation Timing zu studieren. Wenn zeitliche Verpaarungen erfolgen als detailliert in diesem experimentellen Protokoll, Tausende von Embryonen können gesammelt werden, an einem einzigen Tag für Experimente. Diese Embryonen entwickeln sich synchron durch präzise getimten und deutlich zeichnet sich Phasen der Entwicklung. Zebrafisch kann leicht und präzise durch Morphologie mit einem Stereomikroskop wie Zebrafisch-Embryonen entwickeln sich nach a.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt vom National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health durch gewährt, 5P20GM103636-02 (einschließlich Flow Cytometry-Core-Support) und 1R01GM121703, sowie Auszeichnungen aus dem Oklahoma-Center für die adulten Stammzellen Forschung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
NaClFisher ScientificBP358-10
KClFisher ScientificP217-500
CaCl2Fisher ScientificC79-500
MgSO4EMD MilliporeMMX00701
NaHCO3Fisher ScientificBP328-500
PronaseSigma10165921001Proteaselösung
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)SigmaD1408
Ethanol (EtOH)KOPTECV1016
Rinderserumalbumin (BSA)SigmaA9647-100G
Propidiumiodid (PI)InvitrogenP3566
Tris-HClFisher ScientificBP153-500
EDTASigmaE9844
SDSSanta Cruzsc-24950
Proteinase KNEBP8107S
Phenol:ChloroformSigmaP3803-100ML
NatriumacetatJ.T.Baker3470
GlykogenAmbionAM9510
RNase AThermo ScientificEN0531
Quanit-iTInvitrogenQ33130Reagenzien für die fluoreszenzbasierte DNA-Quantifizierung
Covaris AFA microTUBECovaris520045Spezialröhrchen für die Beschallung
Covaris E220 Ultraschallgerät Covaris E220Ultraschallgerät
Agilent 4200 TapestationAgilentG2991AAautomatisierte Elektrophoresemaschine
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582Reagenzien für automatisierte Elektrophoresemaschine
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit für IlluminaNEBCat#E7370LDNA-Bibliotheksvorbereitungskit
NEBNext Multiplex-Oligos Kit für Illumina (Index Primers Set 1)NEBCat#E7335SMultiplex-Oligos für DNA-Bibliotheksvorbereitungskit
NEBNext Multiplex Oligos Kit für Illumina (Index Primers Set 2)NEBCat#E7500Szusätzliche Multiplex-Oligos für DNA-Bibliotheksvorbereitungskit
NEBNext Library Quant Kit für IlluminaNEBE7630LQuantifizierungskit für die Bibliotheksvorbereitung
Agencourt AMPure XP beadsBeckman CoulterA63882magnetische beads
Illumina HiSeq 2500IlluminaSY– 401– 2501DNA-Sequenzierungsplattform der nächsten Generation
40 & Mikro; m Falcon Nylon ZellsiebFisher Scientific08-771-1
VWR Einweg-Petrischale 100 x 25 mmVWR89107-632
6,0 mL Spritze für Nichiryo Modell 8100VWR89078-446
Posi-Click Röhrchen, 1,7 mL, natürliche FarbeDenville ScientificC2170 (1001002)Dnase/RNASE-frei
Vortex Genie 2Scientific IndustriesSI-0236
SpritzflaschenVWR16650-022Polyethylen niedriger Dichte, Weithalssieb
VWR470092-4406,9 cm, feinmaschig
Corssing TankAquaneeringZHCT100Einzelzuchtbecken
iSpawnTechniplastN/Agroßes Zuchtbecken
FACSAria IIBD biosciencesN/AZellsortiermaschine
Wild M5a SteromikroskopWild HeerbruggN/APräpariermikroskop
Qubit 3 FluorometerThermo ScientificQ33216quantitative fluoreszenzbasierte Methode zur Bestimmung der DNA-Konzentration
MatlabMathworksVersion 2017a
Matlab Statistics ToolboxMathworksVersion 11.1
Matlab Curve Fitting ToolboxMathworksVersion 3.5.5
fokussiertes

Referenzen

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  1. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).
  2. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  3. Rivera-Mulia, J. C., et al.

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Schlagwörter

DNA Replication TimingZebrafish EmbryosCell SortingNext Generation SequencingPropidium Iodide StainingFlow CytometryGenome wide AnalysisReplication Fork InitiationEmbryonic Development StagesSingle cell Suspension

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