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DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

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DOI:

10.3791/57146

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30. April 2018

 ,  ,  ,  , 
1Cell Cycle and Cancer Biology Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Zebrafisch wurden vor kurzem als in Vivo Modellsystem verwendet, um DNA-Replikation Timing während der Entwicklung zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung von Zebrafisch-Embryonen Profil Replikation Timing. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um Replikation Timing in einzelnen Zelltypen, Mutanten, Krankheitsmodelle und andere Arten zu studieren.

Zusammenfassung

DNA-Replikation Timing ist eine wichtige zelluläre Eigenschaft, wichtige Beziehungen mit Chromatinstruktur, Transkription und DNA Mutationsraten ausstellen. Änderungen im Zeitplan der Replikation auftreten während der Entwicklung und in der Krebstherapie, aber die Rolle Replikation Timing spielt in der Entwicklung und Krankheit ist nicht bekannt. Zebrafisch entstanden vor kurzem als in Vivo Modellsystem Replikation Timing zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung der Zebrabärbling zur DNA-Replikation Zeitpunkt bestimmen. Nach der Sortierung der Zellen aus Embryonen und Erwachsenen Zebrafisch, können hochauflösende genomweite DNA Replikation Zeitverzögerungsmuster konstruiert werden, durch die Bestimmung der Veränderungen der DNA-Kopienzahl durch Analyse der nächsten Generation Sequencing-Daten. Der Zebrafisch-Modell-System ermöglicht eine Auswertung der Replikation Timing Veränderungen, die auftreten, während der gesamten Entwicklung in vivo, und kann auch zu Veränderungen in einzelnen Zelltypen, Krankheitsmodelle oder mutierten Linien verwendet werden. Diese Methoden ermöglichen es Studien untersuchen die Mechanismen und Determinanten der Replikation Timing Aufbau und die Pflege während der Entwicklung, die Rolle Replikation Timing spielt in Mutationen und Tumorgenese und die Auswirkungen der erkunden Replikation Timing auf Entwicklung und Krankheit.

Einleitung

Für die Zellen sich zu teilen erfolgreich müssen sie zuerst genau und treu ihre gesamte Genom repliziert werden. Genom Verdoppelung tritt in einem reproduzierbaren Muster, bekannt als der DNA-Replikation Timing Programm1. DNA-Replikation Timing korreliert mit Chromatin Organisation, epigenetischen Markierungen und Gen Ausdruck2,3. Änderungen im Timing der Replikation treten während der gesamten Entwicklung und sind deutlich Bezug auf transkriptioneller Programme und Änderungen zum Chromatin Marken und Organisation4,5. Darüber hinaus Replikation Timing ist korreliert mit mutagenen Frequenzen, und Änderungen im Timing in verschiedenen Arten von Krebs6,7,8eingehalten werden. Trotz dieser Beobachtungen die Mechanismen und Determinanten der Replikation Timing Errichtung und Ordnung sind noch weitgehend unbekannt, und es spielt die Rolle in der Entwicklung und Krankheit ist unbestimmt. Darüber hinaus hatte bis vor kurzem die genomweite Replikation timing während der vertebrate Entwicklung auftretende Änderungen nur in Kultur zellmodellen untersucht worden.

Zebrafisch, Danio Rerio, eignen sich gut, Replikation Timing in Vivo während der Entwicklung zu studieren wie ein einzelnes Paarung paar Hunderter von Embryonen, die entwickeln sich rasch mit vielen Ähnlichkeiten zu Säugetier-Entwicklung9hervorbringen kann, 10. Darüber hinaus gibt es während der gesamten Entwicklung der Zebrafisch, Änderungen in den Zellzyklus, Chromatin Organisation und transkriptionelle Programmen, die Beziehungen mit DNA-Replikation Timing11teilen. Zebrafisch sind auch ein hervorragendes genetisches Modell, wie sie sind besonders offen für Manipulation durch Transgenese, Mutagenese und gezielte Mutationen und genetischen Bildschirme haben viele Gene, die erforderlich für vertebrate Entwicklung12identifiziert. Daher kann Zebrafisch, Replikation Timing Aufbau und die Pflege beteiligten Gene zu identifizieren und um die Auswirkungen der Deregulierung Replikation Timing auf vertebrate Entwicklung beobachten verwendet werden. Transgene Linien können auch zur Replikation Timing von einzelnen Zelltypen isoliert an verschiedenen Zeitpunkten Entwicklungsstörungen oder Krankheiten zu beurteilen. Wichtig ist, gibt es verschiedene Zebrafisch Modelle menschlicher Erkrankungen, die verwendet werden, um die Rolle der Replikation Zeitmessung in Krankheit Entstehung und Progression9,13,14zu untersuchen.

Vor kurzem wurden die erste Replikation Timing Profile von Zebrafisch als Modellsystem Replikation timing in Vivo15studieren generiert. Um dies zu erreichen, wurden die Zellen von Zebrafisch-Embryonen in mehrere Phasen der Unternehmensentwicklung und in einem Zelltyp isoliert von Erwachsenen Zebrafisch gesammelt. Zellen wurden dann sortiert nach FACS, die anhand der DNA-Gehalt (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung), G1 und der S-Phase-Bevölkerung zu isolieren. Kopieren Sie mithilfe der G1-Probe als eine Nummer Kopiersteuerung Nummer Variationen in S-Phase Populationen wurden ermittelt und verwendet, um relative Replikation Timing16ableiten. Änderungen im Zeitplan der Replikation können dann direkt zwischen verschiedenen Entwicklungsstörungen Proben und Zelltypen verglichen werden, und dies wurde verwendet, um Änderungen im Timing der Replikation zu ermitteln, die in Vivo in vertebrate Entwicklung auftreten. Diese Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen genomischen Methoden, vor allem, dass es keine Kennzeichnung mit Thymidin-Analoga oder Immunopräzipitation DNA4,6.

Hier wird detailliert die Protokolle zum Profil genomweite DNA Replikation Timing bei hochauflösenden im Zebrafisch. Diese Protokolle wurden zur Beziehungen mit genomischen und epigenetische Features in das Zebrafish Genom, sowie die Profilierung Änderungen in diesen Beziehungen, die auftreten, während der Entwicklung zu bestimmen. Diese Protokolle sind auch leicht angepasst, um Veränderungen in Replikation Timing im mutierten Zebrafisch-Stämme und in Krankheitsmodellen zu studieren. Darüber hinaus bieten diese Methoden eine Stiftung, die Replikation Timing in bestimmten Zelltypen zu studieren, durch erste Aussortieren der einzelnen Zelltypen aus dem Zebrafisch erweitert werden kann. Der Zebrabärbling dient als eine ausgezeichnete in Vivo Modellsystem zu Replikation Timing zu studieren und letztlich die biologischen Funktionen von dieser wichtige epigenetische Eigenschaft offenbaren.

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Protokoll

Alle Tiere wurden in strikter Übereinstimmung mit Protokollen, die durch die Oklahoma Medical Research Foundation institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt behandelt.

1. Einrichten von Erwachsenen Zebrafisch für die Zucht

  1. Eine große Kohorte von erwachsenen männlichen und weiblichen Zebrafisch eines einzigen Stammes zur Zucht zu verwenden. Es gibt kleine Unterschiede in der genetischen Zusammensetzung der Zebrafisch sogar eines einzelnen Stammes, eine große Kohorte zu verwenden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse repräsentativ für die genetische Variabilität der Bevölkerung und nicht beschränkt auf einen kleinen Teil der Bevölkerung sind.
  2. Am Vorabend Embryonen gesammelt werden, Dutzende von Zucht Erwachsene in Zucht Panzer, verwenden Sie etwa gleicher Anzahl von Männchen und Weibchen zu. Je nach dem Experiment verwenden Sie eine der folgenden Zuchtstrategien.
    1. Zucht-Strategie 1: Legen Sie ein paar männliche und weibliche Zebrafisch in einzelnen Zucht Panzer, die Männchen von den Weibchen mit einem Raumteiler trennen. Wenn dieser Ansatz verwendet wird, viele verschiedene Zucht Panzer setup und bündeln die Embryonen aus jedem um sicherzustellen, dass die biologische Variabilität ist repräsentativ für die Bevölkerung.
    2. Zucht von Strategie 2: Dutzende von männlichen und weiblichen Zebrafisch in einem großen Zucht-Tank zu kombinieren. Diese Strategie verwenden, solange gibt es eine ausreichend große Anzahl von Embryonen, ist es vernünftig anzunehmen, sie kamen aus einer Vielzahl von Gründern und sind daher genetisch repräsentativ für die Bevölkerung.

(2) zeitlich Paarungen - Sammlung, Sortierung und Gehäuse Zebrafisch-Embryonen für Experimente

  1. Durchführen Sie zeitgesteuerte Paarungen beginnen, sobald das Licht Zyklen morgens. Entsorgen Sie alle Embryonen erzeugt über Nacht.
  2. Erlauben Sie Fische zu züchten in seichtem Wasser (3-5 cm) für einen Zeitraum von 10 min, mit doppeltem Boden für Embryonen durch zu entkommen.
  3. Nach 10 Minuten sammeln Sie Embryonen durch durch ein Sieb Gießen und in einem 10-cm-Platte mit einer Waschflasche spülen. Pool alle Embryonen zum gleichen Zeitpunkt gesammelt markieren sie mit der Sammlung und Stelle sofort in einem Inkubator bei 28,5 ° C.
  4. Hunderte von Embryonen können von einem einzigen Paarung Paar an einem Tag zu rechnen. Können Sie Erwachsene, in 10 min zu züchten Zyklen, bis die Anzahl der Embryonen gewonnen, die weniger als 20 ist.
  5. Ca. 1-1,5 h nach der Entnahme, Art Embryonen, Tote und unbefruchtete Embryonen zu entfernen. Zum Sortieren von Embryonen Inkubator entnehmen und unter dem sezierenden Mikroskop beobachten.
    1. Anzahl der Embryonen und Ort bei einer Dichte von 100 Embryonen pro 10 cm Platte.
    2. Frisches E3-Medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) hinzufügen und Embryonen in den Inkubator 28,5 ° C zurück.

(3) Dechorionate, deyolk und Zebrafisch-Embryonen zu beheben

Hinweis: Dieser Abschnitt des Protokolls richtet sich an Embryonen vor 48 h Post Düngung (hpf). Besteht keine Notwendigkeit, die Chorions Embryonen in einem späteren Stadium der Entwicklung zu entfernen (nach 48 hpf), da sie oft natürlich abfallen. Es gibt keine Notwendigkeit, deyolk oder Entfernen des Chorions Fische älteren post 5 Tage Düngung (Dpf).

  1. Wenn Embryonen gewünschte Entwicklungsalter erreicht haben, überprüfen Sie entsprechenden Entwicklungsstand morphologisch unter einem Lichtmikroskop nach "Stadien der embryonalen Entwicklung der Zebrafisch"17.
  2. Übertragen Sie bis zu 1500 inszenierte Embryonen auf eine 15 mL konische Rohr und waschen Sie mehrmals mit E3.
    1. Fügen Sie 1 mL der E3 und 20 µL Pronase-Lösung (30 mg/mL) für jeden 100 Embryonen und Schwenken Sie sanft. Dechorionated in einer einzigen Röhre mit 15 mL E3 können bis zu 1500 Embryonen werden.
    2. Legen Sie Rohr auf die Seite und ordnen Sie Embryonen in einer gleichmäßigen Schicht auf maximale Oberfläche, Volumen-Verhältnis zu gewährleisten. Schütteln Sie sanft Rohr alle 2-3 Minuten bis alle Chorions gesunken Weg von der Embryonen. Die gesamten Dechorionation Zeit variiert je nach Pronase Aktivität.
  3. Entfernen Sie überstand und spülen Sie sanft Embryonen 3 Mal mit 10 mL der E3. Embryonen auf Eis für den Rest dieses Abschnitts des Protokolls zu platzieren.
  4. E3 zu entfernen und waschen Embryonen mit frisch zubereiteten eiskalte Deyolking Puffer (0,5 x Ginzburg Fisch Ringer-Lösung, ohne Calcium: 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 1,25 mM Nahco33).
    1. Fügen Sie 1 mL eiskaltes Deyolking Puffer für bis zu 500 Embryonen.
    2. Mit einem P1000 sanft pipette Embryonen nach oben und unten 5 - 10 mal Eigelb Sack zu stören.
    3. Übertragen Sie 1 mL auf eine 1,5 mL Microfuge Rohr- und Zentrifuge bei 4 ° C und 500 X g für 5 min.
  5. Entfernen Sie überstand und waschen Pellet mit 1 mL eiskaltes 1 X PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,0), Ringer Lösung zu entfernen. Zentrifuge bei 4 ° C und 500 X g für 5 Minuten.
  6. Sorgfältig entfernen Sie überstand und aufzuwirbeln Sie Zellen in 1 mL 1 X PBS. Legen Sie Rohr auf Eis.
  7. Eine 15 mL konische Rohr 3 mL eiskaltes Ethanol (EtOH) hinzufügen. Wirbelröhre von EtOH sanft auf Einstellung "niedrig".
    1. Verwenden sanft ein P1000, langsam (1 Tropfen pro Sekunde) Tropf Zebrafish Embryos Zellsuspension in EtOH beim aufschütteln.
    2. Fügen Sie eine Gesamtmenge von 1 mL der Embryo Zellsuspension für eine endgültige Fixierung-Lösung von 75 % EtOH.
  8. Nach 1 mL der Zelle wurde Aussetzung hinzugefügt, sanft Wirbel Rohr zu mischen und bei-20 ° C für mindestens 1 h. Es empfiehlt sich, legen Sie die Rohre auf ihrer Seite zu gewährleisten maximale Fläche zum Volumenverhältnis und reduzieren Sie die Anzahl der Embryonen und Zellen, die aneinander kleben. Speichern Sie embryonaler Stammzellen bei-20 ° C für ca. 2-3 Wochen.

(4) Färbung der DNA und FACS Sortierung Embryonen

Hinweis: Dieser Abschnitt des Protokolls richtet sich an Embryonen im 1 Dpf.

  1. EtOH-feste embryonaler Stammzellen von-20 ° C und Zentrifuge bei 4 ° C 1500 X g für 5 min zu entfernen.
    1. Legen Sie Rohr auf Eis und sorgfältig entfernen überstand. Mit einem P1000, sanft Aufschwemmen Sie Zellen in 1 mL frisch zubereiteten kalten PBS-BSA (1 X PBS, 1 % Rinderserumalbumin).
    2. Zentrifugieren Sie Zellen bei 4 ° C und 1500 X g für 5 min und auf Eis.
  2. Für jede 1000 Embryonen verwenden entfernen überstand und Aufschwemmen Zellen in Propidium Jodid (PI) Färbelösung (50 µg/mL PI, 100 µg/mL RNase A, PBS, pH 7,0), 200 µL.
    1. Können Sie Zellen in PI-Lösung für 30 min auf Eis, sanft mischen alle 5 min inkubieren.
    2. Legen Sie ein 40 µm Nylon Zelle Sieb auf eine 50 mL konische Rohr auf Eis. Pipette vorsichtig Zellen zu mischen und durch das Gitter zu filtern.
      Hinweis: Wenn mehrere Röhren von Embryonen aus der gleichen Timepoint in Abschnitt 3 des Protokolls gesammelt wurden, kombinieren Sie diese Embryonen an dieser Stelle, dass sie alle zusammen sortiert werden.
    3. Nutzung der Wohnung im inneren Ende ein Spritzenkolben, sanft stören Sie alle restlichen Klumpen von Zellen auf dem Netz.
    4. Spülen Sie Zellen durch den Filter mit 500 µL kaltem PBS-BSA für jede 1000 Embryonen.
    5. Platzieren Sie ein 40-µm-Netz über eine 15 mL konische Rohr auf Eis und Filtern Sie die Zellsuspension aus dem 50 mL konische Röhrchen ein zweites Mal in die 15-mL-Tube.
  3. Legen Sie mithilfe einer entsprechenden Zelle Sortieren Instrument die Laseranregung auf 561 nm und Emission Detection 610/20 Propidium Jodid zu erkennen.
    1. Mix 15-mL-Tube von gefärbten Zellen kurz durch aufschütteln und Platz im Instrument bei 4 ° C.
    2. Führen Sie Zellen bei einer langsamen Flow rate, idealerweise 1,0 mL/min, um eine saubere Zellzyklus-Profil zu erhalten und zu vermeiden, mischen G1 oder G2/M-Zellen mit dem S phase Bevölkerung.
    3. Erstes Tor für FSC-A X SSC-A (forward Scatter-Bereich durch Streuung Seitenbereich), Schmutz (Abbildung 1A).
      Hinweis: Zellen aus Embryonen können Größen je nach Stadium und Zelle unterschiedlich. Die Graufilter (ND) kann zwischen 1.0 und 1.5 abhängig von der Größe der Zellen vorhanden gewechselt werden müssen. Tor, ein großes Gebiet zu sammeln die meisten Zellen und Schmutz zu entfernen.
    4. Zweite, Tor für SSC-Bereich (SSC-A) von PI-Bereich (PI-A), um Schmutz und Zelle Dubletten (Abbildung 1 b) zu entfernen.
    5. Drittens: Tor für SSC-A von SSC-W (Breite), alle restlichen Zelle Dubletten (Abbildung 1) zu entfernen.
  4. Anzeigen der gated Populationen auf ein Histogramm mit Handynummer (Anzahl) auf der y-Achse und Propidium Jodid-Bereich (PI-A) auf der x-Achse. Dies sollte für 24 hpf Embryonen eine stereotype Zellzyklus-Profil wie in Abbildung 1geben.
    1. Um die Bevölkerung der Phase zu sortieren, setzen Sie das Tor von der rechten Seite des G1 Peak auf der linken Seite der G2 Spitze, darunter nur eine minimale Menge an der G1 und G2 Bevölkerung. Für 24 hpf Embryonen wird dies in der Regel ca. 10-15 % der gated Bevölkerung umfassen (siehe Abbildung 1).
    2. Um die G1-Bevölkerung zu sortieren, legen Sie das Tor auf der linken Seite der G1 Spitze, der Gipfel des Berges nicht übergeben. Passen Sie die Breite des G1 Tores so schmal wie möglich (siehe Abbildung 1).
    3. Tor der G1 und S Phase Bevölkerungen zu den richtigen ersten gating (Abbildung 1E) sorgen zurück.
  5. Sortieren Sie die G1 und S Phase Populationen in 15 mL konische Röhrchen mit 3 mL PBS-BSA. Das Ziel sollte sein, um zwischen 500.000 und 1 Million oder mehr sortierten Zellen pro angebrochene (G1 und S-Phase) zu erhalten.
  6. Nach Sortierung abgeschlossen ist, Röhren Zentrifuge bei 1500 x g und 4 ° C für 10 Minuten.
    Hinweis: Das kleinzellige Pellet wird schwierig sein, zu sehen und es ist wichtig, nicht zu stören, dass es, so verwenden Sie am besten einen schwingende Eimer Rotor über einen festen Winkel-Rotor.
  7. Sorgfältig entfernen Sie überstand und aufzuwirbeln Sie Pellet mit 1 mL 1 X PBS. Übertragen Sie Zellen auf einem 1,5 mL Microfuge Rohr- und Zentrifuge bei 6.000 x g und 4 ° C für 5 min.
  8. Sorgfältig entfernen Sie alle Flüssigkeit aus Rohr und frieren Sie trocken Pellet bei-20 ° C ein. Speichern Sie die Pellets bei-20 ° C für ca. 2-3 Wochen.

(5) DNA-Isolierung, RNase-Behandlung und DNA-Reinigung

  1. Entfernen Sie Zelle Pellet aus-20 ° C und auf Eis.
    1. Fügen Sie 400 µL SDS Puffers (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5 % SDS), Pellets und erneut hinzu.
    2. Eine Endkonzentration von 0,2 mg/mL Proteinase K hinzu und durch Vortexen kurz mixen.
    3. Inkubieren Sie Proben bei 56 ° C für 2 h, Wirbel alle 15 min.
  2. Durchführen Sie nach 2 h Phenol-Chloroform Extraktion durch Hinzufügen von 400 µL Phenol-Chloroform (Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol 25:24:1, gesättigt mit 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA).
    1. Vortex für 20 s und Zentrifuge Probe bei 16.000 x g für 5 min, Phasen zu trennen.
    2. Entfernen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase (400 µL) und Übertragung auf einen 1,5 mL-Tube.
  3. Durchführen Sie EtOH Niederschlag durch Hinzufügen von 40 µL 3M Natriumacetat (pH 5,2), 2 µL von Glykogen und 1 mL EtOH.
    1. Vortex mischen und bei-20 ° C über Nacht, DNA auszufällen. Probe kann auch bei-80 ° C oder auf Trockeneis für 1 h ausgefällt werden.
    2. Zentrifuge Probe bei 4 ° C und 16.000 x g für 30 min an der Pellet-DNA.
    3. Ablagestapel überstand und waschen Pellet mit 1 mL 70 % EtOH. Zentrifuge bei 4 ° C und 16.000 x g für 5 Minuten.
    4. Überstand und an der Luft trocknen Pellet bei Umgebungstemperatur für 2-3 min zu verwerfen.
  4. Lösen Sie Pellets in 96 µL autoklaviert Wasser auf, und fügen Sie 4 µL RNase A (2 mg/mL).
    1. Mischen Sie gut durch aufschütteln und Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
  5. Durchführen Sie Phenol-Chloroform Extraktion durch Zugabe von 100 µL Phenol-Chloroform und folgt in Schritten 5.2.1 - 5.2.2.
  6. Durchführen Sie EtOH Niederschlag durch Hinzufügen von 10 µL 3M Natriumacetat, 1 µL Glykogen und 250 µL EtOH und nach dem Eingriff in Schritten 5.3.1 - 5.3.5.
  7. Aufschwemmen Sie Pellet in 60 µL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH8.0)) und bestimmen Sie DNA-Konzentration mit einer quantitativen Fluoreszenz basierende Methode zu. Shop DNA bei-20 ° C.
    Hinweis: Es ist wichtig, DNA mit Hilfe von Fluoreszenz-basierte DNA-bindende Farbstoffe oder auf andere Weise zuverlässiger als UV-Spektrometer-basierte Methoden zu quantifizieren.

6. Vorbereitung der DNA-Bibliotheken und Sequenzierung der nächsten generation

Hinweis: Ein G1 Kopie Nummer Rückstellmuster für jede biologische Quelle ist erforderlich für jeden Lauf Sequenzierung (d.h. WT, mutierten, Transgene, Zell-Linie, etc.). Vergleichen Sie alle S-Phase-Proben aus der gleichen biologischen Quelle in der gleichen Sequenzierung ausgeführt, um die gleiche G1-Referenz. Führen Sie mindestens zwei biologische Wiederholungen jeder Probe zur Sicherstellung der Konsistenz zwischen Proben.

  1. Verdünnen Sie 1 µg DNA zu einem Endvolumen von 50 µL und Transfer zu einem spezialisierten Schlauch für Beschallung.
  2. Scheren Sie genomischen DNA für ein Ziel von 250-300 bp in einem fokussierten Ultrasonicator nach Hersteller Vorgaben und Protokoll.
  3. Qualität und Größe der geschert genomischer DNA, die eine automatisierte Elektrophorese maschinenbenutzung nach Vorgaben und Protokoll des Herstellers zu überprüfen. Stellen Sie sicher, es gibt eine große Spitze von ~ 250-300 bp für die sheared genomischer DNA.
  4. Bereiten Sie Sequenzierung Bibliotheken mit einer DNA-Bibliothek vorbereitungssatz mit Multiplex-Oligos für Sequenzierung auf Illumina-Plattform vor, laut Protokoll des Herstellers.
  5. Qualität der Bibliothek Prep automatisierte Elektrophorese-Automaten, laut Protokoll des Herstellers zu überprüfen. Stellen Sie sicher, es gibt eine große Spitze von ~ 400-450 bp, und es gibt minimale Spitzen für Grundierung Dimere (80-85 bp) und Adapter Dimere (~ 120 bp).
  6. Bibliotheken mit den DNA-Bibliothek Quantifizierung Kit für DNA-Sequenzierung der nächsten Generation, laut Protokoll des Herstellers zu quantifizieren.
  7. Verdünnte 15 µL der Bibliothek zu einer Konzentration von 5 nM und kombinieren gemultiplext Bibliotheken, wie erforderlich, um zu erzielen gewünscht eindeutig Zuordnung lesen zählt pro Probe.
    Hinweis: Die Anzahl der eindeutigen Zuordnung Lesevorgänge pro Probe wird die Auflösung zu bestimmen. Verwendung so wenig wie 5 Millionen abgebildet liest Replikation Timing für das Zebrafish Genom zu beurteilen. Es wird empfohlen, die beginnen mit 10 Millionen mal gelesen.
  8. Führen Sie gepaart-End 100 bp ganze DNA-Sequenzierung des Genoms von Proben auf ein next Generation Sequencing-Plattform gemäß Anweisungen des Herstellers.

7. Analyse der Sequenzierungsdaten

Hinweis: Die Anweisungen in diesem Abschnitt sollen als Richtlinie für die Analyse. Verwenden Sie zusätzliche Methoden zur Sequenzierung Ausrichtung, Filterung, Verarbeitung usw.. In diesem Abschnitt des Protokolls wird die bevorzugte Methode der Analyse in dieser Arbeit behandelt. Wenn zusätzliche Methoden verwendet werden, passen Sie die Parameter und Funktionen für diese Zwecke. Die folgenden Befehle werden in Ubutnu oder Mac terminal, mit die entsprechenden Pakete installiert eingetragen.

  1. Erhalten Sie die neuesten Versionen des Zebrafisch-Genoms (danRer10, ab wann dieses Protokoll geschrieben wurde) von UCSC Genom Browser mit den folgenden Befehlen:
    Wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz
    1. Dekomprimieren Sie die Datei fa.gz mit dem folgenden Befehl:
      Gunzip danRer10.fa.gz
    2. Richtet die Sequenzierungsdaten zum Genom mit BWA-Mem mit den folgenden Befehlen:
      BWA Mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
  2. .Bam-Datei mit Samtools mit dem folgenden Befehl umwandeln Sie .sam Datei:
    Samtools anzeigen -bS input.sam > output.bam
    1. Sortieren Sie die ausgerichteten Sequenzierung Dateien mithilfe von Samtools mit dem folgenden Befehl:
      Samtools sortieren output.bam > output_sorted.bam
    2. Indizieren Sie die .bam-Datei mit Samtools mit den folgenden Befehl:
      Samtools Index output.bam
  3. Mark PCR Duplikate mit Picard mit den folgenden Befehlen:
    Java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \
    Input=Input.BAM
    Output=Output.BAM
    REMOVE_DUPLICATES = False
    METRICS_FILE=output_metrics.txt
  4. Generieren Sie Textdateien (.txt) liest für jedes Chromosom mit dem folgenden Befehl:
    für i in {1.25}; tun CHROM = "chr" $i; Echo $CHROM; Samtools anzeigen input.bam $CHROM | Schneiden -f 2,4,5,7,8,9 > ReadsChr$ {i} .txt; fertig
    Hinweis: Die Spalten in der resultierenden .txt-Datei sind Flagge, Standort, MapQ, koppeln chr, paar Lage und Fragmentgröße, beziehungsweise.
  5. Matlab (oder andere ähnliche Software) über die Textscan Funktion gelesen Sie txt-Dateien ein.
    1. Niedrige Abbildung Qualität liest durch Festlegen einer MapQ Schwellenwerts von 30 herausfiltern.
    2. Entfernen Sie liest mit Fahnen für nicht primäre Ausrichtung, PCR Duplikate oder paar-Mapping auf einem anderen Chromosom.
    3. Jeder liest mit ihren paar jenseits der Schwelle eine Entfernung von 2000 bp herausfiltern.
    4. Bewerten Sie Statistiken des daraus resultierenden lautet, Anzahl lesen Sie Statistiken, Abdeckung, Plattengröße und Qualität (Abbildung 2) zu bestimmen.
  6. Lesen Sie Berichte auf 100 bp behoben Windows für jede Probe durch zählen der Anzahl der Lesevorgänge in 100 bp Intervallen über die Länge jedes Chromosoms zu bestimmen.
    1. Berechnen Sie der Median Anzahl für alle Fenster zu lesen.
    2. Regionen der hohen Abdeckung durch Entfernen von Windows, die größer als 5 Standardabweichungen vom Medianwert herausfiltern.
  7. Regionen für die Analyse in der G1-Referenzproben zu definieren, mit 200 liest mit Schiebefenster Segmente entlang jedes Chromosom zu finden.
    1. Bestimmen Sie lesen Sie Tiefe in jeder S-Phase-Probe durch zählen der Anzahl der S-Phase-Lesevorgänge im Fenster 200 lesende Graf für die begleitenden G1 Referenz definiert.
  8. Glätten Sie die raw-Daten über die Csaps-Funktion in die Software mit einem Interpolationsfaktor (p) von 10-16.
  9. Geglättete Daten zu Z-Score mit einem Mittelwert von 0 und Standardabweichung von 1 zu normalisieren.

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Ergebnisse

Verwendung von veröffentlichten Replikation Zeiterfassungsdaten, repräsentative Replikation Timing Profile und Qualitätssicherungsmaßnahmen15angeboten. Die ersten Schritte der Verarbeitung beinhalten Ausrichten der Sequenzierungsdaten, das Genom, Berechnung lesen Sie Länge und Genom Abdeckung Statistiken und geringe Filterqualität ungepaarte, und PCR-doppelte liest. Lesen Sie Statistiken für eine typische Zebrafisch Sequenzierung Probe werden in

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Diskussion

Zebrafisch bieten ein neues und einzigartiges in Vivo Modell, DNA-Replikation Timing zu studieren. Wenn zeitliche Verpaarungen erfolgen als detailliert in diesem experimentellen Protokoll, Tausende von Embryonen können gesammelt werden, an einem einzigen Tag für Experimente. Diese Embryonen entwickeln sich synchron durch präzise getimten und deutlich zeichnet sich Phasen der Entwicklung. Zebrafisch kann leicht und präzise durch Morphologie mit einem Stereomikroskop wie Zebrafisch-Embryonen entwickeln sich nach a...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt vom National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health durch gewährt, 5P20GM103636-02 (einschließlich Flow Cytometry-Core-Support) und 1R01GM121703, sowie Auszeichnungen aus dem Oklahoma-Center für die adulten Stammzellen Forschung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
NaClFisher ScientificBP358-10
KClFisher ScientificP217-500
CaCl2Fisher ScientificC79-500
MgSO4EMD MilliporeMMX00701
NaHCO3Fisher ScientificBP328-500
PronaseSigma10165921001Proteaselösung
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)SigmaD1408
Ethanol (EtOH)KOPTECV1016
Rinderserumalbumin (BSA)SigmaA9647-100G
Propidiumiodid (PI)InvitrogenP3566
Tris-HClFisher ScientificBP153-500
EDTASigmaE9844
SDSSanta Cruzsc-24950
Proteinase KNEBP8107S
Phenol:ChloroformSigmaP3803-100ML
NatriumacetatJ.T.Baker3470
GlykogenAmbionAM9510
RNase AThermo ScientificEN0531
Quanit-iTInvitrogenQ33130Reagenzien für die fluoreszenzbasierte DNA-Quantifizierung
Covaris AFA microTUBECovaris520045Spezialröhrchen für die Beschallung
Covaris E220 Ultraschallgerät Covaris E220Ultraschallgerät
Agilent 4200 TapestationAgilentG2991AAautomatisierte Elektrophoresemaschine
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582Reagenzien für automatisierte Elektrophoresemaschine
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit für IlluminaNEBCat#E7370LDNA-Bibliotheksvorbereitungskit
NEBNext Multiplex-Oligos Kit für Illumina (Index Primers Set 1)NEBCat#E7335SMultiplex-Oligos für DNA-Bibliotheksvorbereitungskit
NEBNext Multiplex Oligos Kit für Illumina (Index Primers Set 2)NEBCat#E7500Szusätzliche Multiplex-Oligos für DNA-Bibliotheksvorbereitungskit
NEBNext Library Quant Kit für IlluminaNEBE7630LQuantifizierungskit für die Bibliotheksvorbereitung
Agencourt AMPure XP beadsBeckman CoulterA63882magnetische beads
Illumina HiSeq 2500IlluminaSY– 401– 2501DNA-Sequenzierungsplattform der nächsten Generation
40 & Mikro; m Falcon Nylon ZellsiebFisher Scientific08-771-1
VWR Einweg-Petrischale 100 x 25 mmVWR89107-632
6,0 mL Spritze für Nichiryo Modell 8100VWR89078-446
Posi-Click Röhrchen, 1,7 mL, natürliche FarbeDenville ScientificC2170 (1001002)Dnase/RNASE-frei
Vortex Genie 2Scientific IndustriesSI-0236
SpritzflaschenVWR16650-022Polyethylen niedriger Dichte, Weithalssieb
VWR470092-4406,9 cm, feinmaschig
Corssing TankAquaneeringZHCT100Einzelzuchtbecken
iSpawnTechniplastN/Agroßes Zuchtbecken
FACSAria IIBD biosciencesN/AZellsortiermaschine
Wild M5a SteromikroskopWild HeerbruggN/APräpariermikroskop
Qubit 3 FluorometerThermo ScientificQ33216quantitative fluoreszenzbasierte Methode zur Bestimmung der DNA-Konzentration
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fokussiertes

Referenzen

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