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Histologischen Quantifizierung Lunge Pilz Belastung in experimentellen Aspergillose bestimmen

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DOI:

10.3791/57155

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9. März 2018

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1Department of Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine - Terre Haute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur pulmonalen Pilz Belastung bei Mäusen mit invasiver Aspergillose durch Quantifizierung der Gomoris modifizierten Methanamine Silber Färbung in histologischen Abschnitte bestimmen. Verwendung dieser Methode führte zu vergleichbaren Ergebnissen mit weniger Tiere im Vergleich zu Bewertung der Pilzinfektionen Belastung durch quantitative PCR der Lunge Pilz DNA.

Zusammenfassung

Die Quantifizierung der Lunge Pilz Belastung ist entscheidend für die Bestimmung der relativen Pegel der Immunschutz und Pilz Virulenz in Mausmodellen der pulmonalen Pilzinfektion. Obwohl mehrere Methoden verwendet werden, um Pilz Belastung zu beurteilen, hat quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Pilz DNA eine Technik mit mehreren Vorteilen gegenüber früheren Kultur-basierte Methoden entwickelt. Derzeit erfordert eine umfassende Bewertung der Lunge Pathologie, Rekrutierung von Leukozyten, Pilzinfektionen Belastung und Genexpression bei Mäusen mit invasiver Aspergillose (IA) den Einsatz zahlreicher experimenteller und Kontrolltieren. Hier war die Quantifizierung der Lunge histologische Färbung bestimmen pilzartige Belastung mit einer reduzierten Anzahl von Tieren im Detail untersucht. Lunge Abschnitte waren voller Flecken, um Pilz Strukturen mit Gomoris modifizierten Methanamine Silber (GMS) Färbung zu erkennen. Bilder stammen aus der GMS-gefärbten Abschnitte von 4 diskrete Felder jedes Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten Lunge. Die GMS gefärbten Bereiche in jedem Bild wurden quantifiziert mit einem Bild-Analyse-Programm, und aus dieser Quantifizierung wurde der mittlere Anteil der verschmutzten Bereich für jede Probe bestimmt. Mit dieser Strategie, verringert die Eosinophilen-defizienten Mäusen ausgestellt Pilz Belastung und Krankheit mit Caspofungin Therapie, während Wildtyp Mäusen mit IA nicht mit Caspofungin verbessern. Ebenso Pilz Belastung bei Mäusen fehlt γδ T-Zellen wurden auch verbessert durch Caspofungin, gemessen mittels qPCR und GMS Quantifizierung. GMS Quantifizierung ist daher als eine Methode zur Bestimmung der relativen Lunge Pilz Belastung eingeführt, die letztlich die Anzahl der Versuchstiere erforderlich für umfassende Studien über invasive Aspergillose reduzieren kann.

Einleitung

IA ist eine opportunistische Infektion, die bei empfindlichen Personen mit angeborenen oder erworbenen Immunschwäche aufgrund suppressive Immuntherapie oder chronische Infektion1,2entwickeln kann. Primäre Infektion oft tritt in der Lunge, obwohl in einigen Fällen Verbreitung von Aspergillus Fumigatus , Leber, Nieren, Herz und Gehirn auftreten, was zu umfangreichen Gewebe Invasion von Hyphen, begleitet von schweren Krankheiten und hohe Rate von Sterblichkeit1,2. Darüber hinaus die Wirksamkeit der bestehenden Pharmakotherapien ist begrenzt und kann durch das Aufkommen von Antimykotika-resistente Stämme in der Umgebung3weiter geschwächt werden. Es ist daher wichtig, die Mechanismen der Pilz Virulenz und Host-Pathologie, die Förderung der Entwicklung oder Verschlimmerung der invasiven pilzartige Krankheit zu verstehen.

Murine Modelle bleiben für mechanistische IA Studien wichtig, da sie Forschern erlauben zu beurteilen, die Rollen der Pilz Virulenz Gene und host immun Effektoren für die Gründung und das Wachstum von A. Fumigatus in-vivo-4,-5. Infolgedessen wurden mehrere Strategien erarbeitet, um effektiv zu quantifizieren oder Pilzinfektionen Belastung in Gruppen von Versuchstieren6,7zu vergleichen. Diese Strategien beinhalten kulturbasierte, biochemische, Immunoassay oder qPCR Methoden, jeweils mit unterschiedlichen vor- und Nachteilen. Darüber hinaus jede dieser Methoden beinhalten die Widmung einer Teilmenge der Tiere zusätzlich zu den für die Beurteilung der immun-Effektor-Funktion, Ausdruck Genanalyse und vergleichende Histopathologie7geopfert. So erfordern umfassende IA Studien oft erhebliche Anzahl von Versuchstieren zu erheblichen Kosten. Wirksame Strategien, die experimentelle Zeit, Tier Kosten und ethische Überlegungen zu reduzieren, durch die Verwendung von tierischem Gewebe für mehrere Analysen sind daher äußerst wertvoll7.

In diesem Bericht wird eine Methode beschreibt die Quantifizierung der GMS Färbung in histologischen Abschnitte zum Vergleich der relativen Pilz Belastung zwischen experimentellen Gruppen von Mäusen mit IA eingeführt. Jeder Schritt vom Pilz Kultur, Infektion, Gewebe-Ernte und Verarbeitung, und Bildaufnahme, Datenanalyse, ist im Detail beschrieben. Pilze Belastungen durch GMS Quantifizierung gewonnen wurden mit qPCR neutropenisch Modelle der IA und Caspofungin behandelt Wildtyp oder Eosinophilen-defizienten Mäusen mit IA8verglichen. Die Ergebnisse zeigen Ähnlichkeit mit GMS Quantifizierung und qPCR Pilz DNA. Dies deutet darauf hin, dass GMS Quantifizierung nützlich, um Forscher in histologischen Analysen als eine ergänzende oder alternative Methode des Vergleichs der relative Pilz Belastung bei Mäusen mit IA engagiert sein kann und letztlich die Kosten und die Verwendung von Versuchstieren in reduzieren kann komplexe, mechanistische Studien.

Protokoll

Alle tierische Verfahren wurden genehmigt durch das Animal Care und Nutzung Ausschuss der Indiana State University, die Host-Campus der Indiana University School of Medicine – Terre Haute.

1. Vorbereitung von A. Fumigatus Konidien auf Infektion

  1. Während der Arbeit in einem gut gelüfteten Abzug, fügen Sie 125 µL der Stammlösung A. Fumigatus 293 900 µL Kultur Grade Zellwasser (CCGW hinzu). Übertragen Sie dann die Lösung Malz-Extrakt (MEA) Nährbodenplatte per Pipette und gleichmäßig mit einer Impfkeimen Schleife.
  2. Speichern Sie die Pilze Platte im Dunkeln bei 24 ° C für mindestens 14 Tage und nicht mehr als 28 Tage.
  3. Ernten Sie mit Glasperlen als zuvor beschriebenen9Konidien.
  4. Gießen Sie 1,5 g 0,5 mm Glasperlen auf den Teller und neigen Sie ihn sanft hin und her bis die Perlen beschichtet sind, um Konidien zu extrahieren. Die Perle/Konidien Mischung in einem 15 mL konische Röhrchen zu sammeln. Aussetzen Sie in 5 mL Dulbecco Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) und Wirbel.
  5. Zählen Sie die Konidien in ein 50 X Verdünnung der Überstand in DPBS mit einer Hemocytometer. Die Anzahl der Konidien im Bereich in Abbildung 1 dargestellte und Gleichung 1 verwenden, um die Konzentration zu berechnen.
    #Conidia × Verdünnung Faktor 10 ×4= Konidien/mL (Gleichung 1)
    Hinweis: Zusätzliche 4 x 4 Quadrat Eckbereichen können, mit dem Mittelwert dieser Bereiche als #Conidia in Gleichung 1angerechnet werden.

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Abbildung 1: Hemocytometer repräsentativen Bereichs verwendet für Konidien zählen (Box, Pfeil).

  1. Verdünnen Sie die Konidien Aussetzung mit steriler Kochsalzlösung (DPBS) um die gewünschte Konzentration, 1.0 x 108 Konidien/mL für eine Infektion mit 5 x 106 Konidien/50 µL. bereiten 50 µL Konidien Lösung zu erhalten pro 'n + 2' Mäuse entfallen Pipettieren ansteckungsverdächtigen Fehler.
    Hinweis: Standard Pilz Ernte und Vorbereitung/Filtration können alternativ verwendeten10sein. Die Glas-Wulst-Methode eignet sich besonders dazu bei, dass Konidien Proben mit minimal kleinen/löslichen Bodenaggregaten Antigene für Aspiration gewonnen werden.

(2) Immunsuppression und Infektion von Mausmodell

  1. 7-10-Wochen alten Mäusen zu verwenden.
    Hinweis: BALB/c, C57BL/6 (B6), Eosinophilen-defizienten (ΔdblGATA, BALB/c-Hintergrund) und γδ T-Zell-Mangel (TCRδ-/-, B6-Hintergrund) Mäuse wurden für diese Studie verwendet. Für jedes experiment, Alter und Geschlecht angepasst wurden (Männchen und Weibchen) Mäuse für jede Gruppe verwendet.
  2. Neutrophilen Granulozyten über intraperitoneale (IP) Injektion von 0,1 mL (0,5 mg) anti-mouse-Ly - 6G Antikörper in steriler Kochsalzlösung bei 45° in den seitlichen unteren rechten Quadranten zu einem Abbau (für einen experimentellen Terminplan, siehe Abbildung 2).
  3. 24 h später, infizieren Mäuse durch Absaugen mit 5,0 x 106A. Fumigatus Konidien ausgesetzt in 50 µL steriler Salzlösung (siehe Schritte 2.4-2.10) wie oben beschrieben11. Nach Infektion, eine Teilmenge von Tieren mit Antimykotikum z. B. 5 mg/kg Caspofungin Diacetat in DPBS in dieser Studie verwendeten injizieren (täglich, siehe Abbildung 2).
  4. Mäuse mit 99,9 % Isofluran Verwendung eine tierärztliche Anästhesiegerät zu betäuben.
    1. Legen Sie ein Papiertuch auf den Boden der Kammer Induktion, Kot und Urin zu fangen.
    2. Platzieren Sie den Mauszeiger in der Induktion-Kammer, sichern den Deckel und legen Sie den Verdampfer auf 5 % Isofluran für 2 min und 30 s.
      Hinweis: Vet-Salbe wird nicht verwendet, weil die Gesamtzeit unter Narkose weniger als 5 Minuten ist.
    3. Reduzieren den Vaporizer auf die Hälfte der maximalen Einstellung für 30 s.
  5. Bestätigen, dass die Maus durch die Beobachtung richtig betäubt wird verlangsamt, Atmung, Mangel an Bewegung und mangelnde Reaktion auf Zehe-Prise Reiz.
  6. Entfernen Sie die Maus aus der Induktion Kammer und auf einem Brett schräg. Platzieren Sie die Maus mit dem Rücken gegen das Brett. Stellen Sie sicher, dass die oberen Schneidezähne sanft mit einem Gummiband gesichert sind und die unteren Schneidezähne sind mit einem Metallgitter vorsichtig verhalten.
  7. Halten Sie sorgfältig die Zunge bei voller Streckung mit kleinen Zangen und 50 µL Pipette Konidien/PBS-Aufhängung an der Basis der Zunge.
  8. Halten Sie die Zunge bei voller Streckung; schnelle Atmung und die ausgeprägte klickendes Geräusch der Aspiration hören. Halten Sie für 20 s oder bis Aussetzung vollständig abgesaugt wird.
  9. Entfernen Sie die Maus vom Brett schräg und sanft in einen Käfig für die Beobachtung.
  10. Nach Aspiration sollte die Maus wieder zu Bewusstsein innerhalb 1 min. Monitor die Maus bis voll bewusst und in der Lage, um den Käfig zu gehen kommen. Die Tiere sollten bei 21 ° C untergebracht und zweimal täglich überwacht, bis die Lunge geerntet werden.
  11. Wiederholen Sie die Erschöpfung der Neutrophilen (Schritt 2.2) 24 Stunden nach der Infektion (Abbildung 2).

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Abbildung 2: experimentelle Zeitplan. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung8geändert.

3. die Ernte und die Erhaltung der Maus Lungen für histologische Analyse

  1. Das Tier mit einer tödlichen Dosis von 0,1 ml 390 mg/ml Natrium Pentobarbital Lösung IP tief zu betäuben.
  2. Bestätigen Sie Euthanasie durch die fehlende Spontanatmung und keine Antwort erhalten, Leib Stimulierung mit einer Pinzette Beobachtung. Sobald eingeschläfert, sprühen Sie die Karkasse mit 70 % Ethanol zu sterilisieren.
  3. Legen Sie den Kadaver auf eine Dämmplatte mit einem Saugkissen bedeckt.
    Hinweis: Die Karkasse sollte auf dem Rücken mit Stecknadeln sichern alle vier Gliedmaßen zu Dämmplatte platziert werden.
  4. Öffnen Sie den oberen Brustraum mit einer Schere vorsichtig. Um die Lunge und das Herz aussetzen schneiden Sie des Brustkorbs Weg. Schneiden der minderwertigen Vena Cava, um Durchblutung zu ermöglichen. Schneiden die Blutgefäße und Punktion der Organe zu vermeiden.
  5. Durchspülen Sie langsam mit 5 mL kalte DPBS in den rechten Ventrikel des Herzens in einem Winkel von 45° mit einer 25-G-Nadel. Wiederholen Sie die Perfusion mit 5 mL der 10 % Formalin.
  6. Vorsichtig aussetzen der Luftröhre und der umgebenden Fettpolster zu lösen. Seien Sie vorsichtig und vermeiden Sie Punktion der Trachea. Stellen Sie sicher, dass überschüssige Bindegewebe entfernt wird, um die Luftröhre, bevor Sie fortfahren vollständig sichtbar zu machen. Sobald die Luftröhre ausgesetzt ist, legen Sie Zange unter der Luftröhre, es zu erheben.
  7. Stechen Sie ein kleines Loch in der oberen Luftröhre mit einer 25-G-Nadel.
    Hinweis: Das Loch sollte positioniert werden, so dass die gesamte Kanüle in der Luftröhre passt. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, bersten die Luftröhre.
  8. Legen Sie eine Kanüle durch das Loch und in Richtung der Lungen. Sichern Sie die Kanüle mit einem chirurgischen Faden locker um die Luftröhre gebunden.
    Hinweis: Wenn die Luftröhre gerissen ist, kann die Kanüle vorbei an der Luftröhre so weit wie möglich in die Atemwege eingeführt.
  9. Mit einer Spritze, Aufblasen der Lunge mit 1 mL 10 % Formalin Puffer durch die Kanüle. Stellen Sie sicher, dass die Inflation der Lunge sichtbar ist. Wenn dies nicht der Fall ist, passen Sie den Katheter und wiederholen. Sobald die Lungen aufgeblasen sind, schnell entfernen der Kanüle mit Vorsicht und ziehen Sie den Faden fest an der Luftröhre abzuriegeln.
    Hinweis: Wenn die Luftröhre gebrochen ist und die Lunge können nicht aufgepumpt werden, die Lunge können noch geerntet werden, aber dies kann verhindern, dass die ordnungsgemäße Fixierung.
  10. Entfernen Sie vorsichtig die Luftröhre und Lunge von der Brust durch sorgfältig trennen das Bindegewebe der Trachea mit der Pinzette während sanft auf dem Thread hochziehen. Legen Sie die Lunge und Luftröhre in ein 50 mL konische Röhrchen mit 15 mL 10 % Formalin Puffer. Platzieren Sie ein Ende des Fadens außerhalb der Röhre und verschließen Sie die Kappe. Invertieren Sie das Rohr um völlig eintauchen die Probe in Fixiermittel.
  11. Speichern Sie die Proben bei Raumtemperatur für mindestens 24 h oder bis Weiterverarbeitung.
    Vorsicht: Formalin ist gefährlich. Geeignete persönliche Schutzausrüstung einschließlich Schutzbrille und Mundschutz zu tragen. Arbeiten Sie unter einer chemischen Haube bei der Verarbeitung von Proben.

4. Ernte und Erhaltung der Maus Lungen für DNA-Pilz-Belastung

  1. Führen Sie die Schritte 3.1-3.5, wie oben beschrieben, auf eine separate Maus.
  2. Durchspülen Sie langsam mit 10 mL kalte DPBS in den rechten Ventrikel des Herzens in einem Winkel von 45° mit einer 25-G-Nadel.
  3. Verbrauchssteuern Sie der Lunge mit einer Schere und in beschrifteten 1,5 mL Röhrchen.
  4. Bis zur Weiterverarbeitung lagern Sie der Lunge bei-80 ° C.
  5. Verwenden Sie standard-Techniken, wie beschrieben (Einbettung und schneiden) und nach Hersteller Protokolle (siehe Tabelle der Materialien).

(5) Mikroskopie und Imaging

  1. Öffnen Sie das Bildbearbeitungsprogramm Quantifizierung (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Mit einem Lichtmikroskop, erhalten Sie mindestens 4 verschiedene Felder der GMS gefärbten Folien (10 X Objektiv). Sicherstellen Sie, dass die Bilder für die infizierten Luftwege in der Lunge mit ähnlicher Dichte Gewebe repräsentativ sind.
    Hinweis: Wenn die Dichte und die Verteilung von Bodenaggregaten Brennpunkte zwischen Steuerung und experimentellen Gruppen deutlich anders aussehen, Zusatzfelder ergriffen werden oder die GMS-Bereich des ganzen Lunge kann abgebildet werden (4 X Objektiv). Erhalten Sie die gleichen Bereiche der Lunge (gekennzeichnet durch gleichwertige Gewebe Morphologie) auf einem seriellen Lunge Abschnitt gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin, falls gewünscht.
  3. Fügen Sie Maßstabsleisten zu den Bildern hinzu, wenn nötig und speichern Sie die Bilder quantifiziert werden. Auswählen, Bearbeiten > hinzufügen/bearbeiten Kalibrierungsmarkierungen > Menü: Wählen Sie dicke, Farbe und Größe der Bar Nennweite > Klicken Sie auf das Bild für an die Maßstabsleiste platziert werden soll. Schließen Sie das Menü und wählen Sie, Bearbeiten > Zusammenführen > Zusammenführen Kalibrierungsmarkierungen > Datei speichern unter Wählen > benennen Sie die Datei und klicken Sie auf speichern.

6. verwenden ein Bildbearbeitungsprogramm um den Pilz Belastung (Abbildung 3) zu berechnen

  1. Öffnen Sie ein Bildbearbeitungsprogramm. Wählen Sie Datei > Ordner mit Proben zu quantifizieren > Bild (Abbildung 3A). Wählen Sie Bild > Art > "RGB-Stack" (Abb. 3 b) umwandeln.
  2. Verwenden Sie die Rechte Pfeiltaste, um die zweite von den drei gegebenen Bilder (Abb. 3 b) auszuwählen. Drücken Sie "STRG + UMSCHALT + T" zu bringen, die "Schwelle" Menü Einstellungen Einsteller (Abbildung 3). Suchen Sie das original TIFF oder JPG Bild als Referenz und öffnen mit einer Bildanzeige-Programm (Abbildung 3).
  3. Ziehen Sie den oberen Schieberegler ganz nach links und den unteren Schieberegler, bis der Bereich ausgewählt (in rot) repräsentativ für die Mikroskopie-Bild (in der Regel im Bereich von 130-160 wie angegeben auf der rechten Seite des Schiebereglers (Abbildung 3).
  4. Einmal ausgewählt, drücken Sie die Taste "Set" > "OK" (Abbildung 3D). Wählen Sie "Analyse" > "Messungen festlegen" > "Gebiet, Bereich Bruchteil, Grenze, Schwelle, Beschriftung anzeigen" prüfen und lassen Sie die unteren Einstellungen (Drop-Down-Menü und stellen nach dem Komma) als Standard > "OK" (Abbildung 3D).
  5. Wichtige Bereiche der Leerraum oder Hintergrundfärbung können durch Auswahl des entsprechenden Gewebes mit einem Bereich oder Polygon Tool ausgeschlossen werden.
  6. Schließlich wählen Sie "Analyse" > "Measure" (ein Fenster mit Daten sollte angezeigt werden, oder eine Registerkarte auf der Windows-Taskleiste erscheint mit der Bezeichnung, "Ergebnisse") (Abbildung 3E). Übertragen Sie die Daten auf eine Daten-Analyse-Programm für die grafische Darstellung und statistische Analyse.
  7. Geben Sie den Mittelwert aus den vier Bereich Prozentsätze für jede Lunge Probe. 5-8 Proben sind in der Regel ausreichend, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen erkennen. Wenn zwei Versuchsgruppen vergleichen, führen Sie ein ungepaartes Student t-Test, um die Bedeutung zu bestimmen.

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Abbildung 3: Vertreter Screenshots für jeden Schritt des GMS histologischen Feld Quantifizierung. (A) wählen Sie Datei > Ordner mit Proben zu quantifizieren > Bild auswählen. (B) wählen Sie Bild > Art > "RGB-Stack" umwandeln. Verwenden Sie die Rechte Pfeiltaste, um die zweite von den drei gegebenen Bilder auszuwählen. (C) Hit "STRG + UMSCHALT + T", um die "Schwelle" Menü-Einstellungen-Einsteller aufzurufen. Suchen Sie das original TIFF oder JPG Bild als Referenz und mit Foto-Viewer-Programm zu öffnen. Ziehen Sie den oberen Schieberegler ganz nach links und den unteren Schieberegler, bis der Bereich ausgewählt (in rot) repräsentativ für die Mikroskopie-Bild (in der Regel im Bereich von 130-160 wie angegeben auf der rechten Seite des Schiebereglers. (D) nach ausgewählten drücken Sie "Set" > "OK". Wählen Sie "Analyse" > "Messungen festlegen" > "Gebiet, Bereich Bruchteil, Grenze, Schwelle, Beschriftung anzeigen" prüfen und lassen Sie die unteren Einstellungen (Drop-Down-Menü und stellen nach dem Komma) als Standard > "OK". (E) Schließlich wählen Sie "Analyse" > "Measure" (ein Fenster mit Daten sollte angezeigt werden, oder eine Registerkarte auf der Windows-Taskleiste erscheint mit der Bezeichnung "Ergebnisse"). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

(7) DNA Pilz Belastung

  1. Entfernen Sie die Lungen von-80 ° C und lyophilize für mindestens 4 Stunden (über Nacht ist optimal) oder bis vollständig durch ein Einfrieren Trockensystem getrocknet.
  2. Während die Lunge trocknen, bereiten Sie DNA Extraktionspuffer (0,1 M NaCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris HCl pH 8.0, und 0,5 % SDS zu).
  3. Ort der vorbereiteten DNA Extraktionspuffer im Wasserbad 60 ° C Vorwärmen. Legen Sie auch Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (25:24:1) in einem 50 mL konische Röhrchen und Trennung zu ermöglichen.
  4. Legen Sie die lyophilisierten Lungen in einem 2-mL-Schraubverschluss Rohr mit 0,2 mL Glasperlen. Mit einem Wulst-Schläger, Mahlen Sie trocken Lungengewebe für 15-30 s, bis ein feines Pulver entsteht.
  5. Hinzu kommen 0,8 mL warmen DNA Extraktionspuffer jedes Rohr und Wirbel gut. Inkubieren Sie jedes Rohr für 15 min bei 65 ° C Perle Badewanne und dann Wirbel vor der Inkubation für eine zusätzliche 15 min. Nach der Inkubation, Wirbel und dann Zentrifuge Röhren bei 25.000 x g für 10 Minuten.
  6. 3 Sätze von 1,5 mL Röhrchen für jede der Proben beschriften und die oberste Schicht des Überstands in einer Reihe von Röhren zu übertragen. Seien Sie vorsichtig beim Pipettieren, wässrigen Deckschicht, um nicht zu stören, die mittlere Schicht.
  7. Gleiches Volumen an Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol hinzufügen und gut verrühren. Anschließend Zentrifugieren Sie bei 25.000 x g für 15 min vor, die obere Schicht in die zweite Reihe von Röhrchen pipettieren.
  8. Gleiches Volumen an Chloroform: Isoamyl Chloroform hinzufügen, gut mischen und Zentrifugieren bei 25.000 x g für 10 min. sorgfältig Pipette aus der oberen Schicht in die dritte Reihe von Röhren.
  9. Hinzufügen von 500 µL Isopropanol und 50 µL NaoAc (pH 5,2), gut mischen und Proben bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren. Dann bei 25.000 x g für 30 min Zentrifugieren Sie und dekantieren Sie des Überstandes.
  10. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 750 µL aus Eis kalt 70 % Ethanol und Zentrifuge für 5 min bei 25.000 x g. Dekantieren das Ethanol und lassen Sie die Pellets in die Luft in den Rohren in einem Rauch-Hauben für 40 min trocknen.
  11. Die trockene Pellets in 300 µL TE-Puffer aufzuwirbeln.
    Hinweis: Die DNA kann bei-20 ° C bis quantifiziert gelagert werden.
  12. DNA mit einem Spektralphotometer zu quantifizieren und 100 µL 0,2 µg/µL jeder DNA-Probe für qPCR Analyse vorzubereiten.
  13. Ein standard qPCR in dreifacher Ausführung mit 1 µg DNA-Probe, Pilz 18 s rDNA Grundierung, wie zuvor beschrieben durchführen und Sonde setzt mit einer modifizierten Sonde Quencher (5'- / 56-FAM/AGC CAG CGG/ZEN/CCC GCA AAT G/3IABkFQ/3 ")12,13.
  14. Bereiten Sie eine Standardkurve aus genomischer DNA A. Fumigatus und berechnen Sie die Konzentration der Pilz DNA in Pg in jeder Probe unter Verwendung der durchschnittlichen Reporters färben Ct-Werte.
  15. Zeichnen Sie die Pg/µg Pilz DNA mit Standardfehler des Mittelwerts. Führen Sie ein Student t-test Analyse Bedeutung zu bestimmen.
    Hinweis: als eine weniger giftige Alternative zu den hierin verwendeten Phenol-Chloroform-DNA-Extraktion, Spalte basierend DNA-Extraktion Kits verwendet werden.

Ergebnisse

Abbildung 4 enthält ein Diagramm des Überlebens der Wildtyp oder Eosinophilen-defizienten Mäusen mit IA mit Caspofungin behandelt. Die Ergebnisse zeigen, dass Eosinophilen-defizienten Mäusen verlängertes Überleben im Vergleich zu Wildtyp Mäusen ausgestellt (50 % Mortalität im Vergleich zu 100 % Mortalität, beziehungsweise). Abbildung 5 zeigt Vertreter GMS Färbung von neutropenisch Wildtyp und Eosinophilen-defizienten Mäusen mit IA behandelt oder unbehandelt mit Caspofungin. Caspofungin Behandlung führte in der relativen Pilz Abfertigung in Eosinophilen-mangelhaft, aber nicht Wildtyp-Mäusen (richtigen Platten), während beide Gruppen, die nicht erhalten haben waren Caspofungin ähnliche (linken Panels). Abbildung 6 zeigt den Vergleich der Pilz Belastung in Caspofungin behandelt und unbehandelte Wildtyp oder Eosinophilen-defizienten Mäusen zu steuern, verwenden beide qPCR Pilz DNA (Abbildung 6A) und Vertreter GMS Quantifizierung von 4 (10 X Objektiv) Felder) Abbildung 6 b). Die Ergebnisse der beiden Techniken zeigen, dass Caspofungin Behandlungsergebnisse der bedeutendste pilzliche Belastung zwischen Wildtyp und Eosinophilen-defizienten Mäusen (Abb. 6A) zu verringern. Bei unbehandelten Mäusen führte nur GMS Quantifizierung eine signifikante Abnahme der Mäuse fehlen Eosinophile (Abb. 6 b). Als mittlere Bereich der gesamten Lunge GMS-gefärbten Abschnitte wurden berechnet (4 X Objektiv), die Unterschiede waren ähnlich wie die erzielten Ergebnisse mit 4 Vertreter 10 X Felder, wenn auch mit weniger statistische Signifikanz (Abbildung 6). Abbildung 7 zeigt überleben, Vertreter GMS Färbung (4 10 X Felder) und Quantifizierung der Pilz Belastung durch beide Methoden in γδ T-Zell-Mangel (TCRδKO)-Mäuse, die behandelt wurden mit Caspofungin im Vergleich zur Kontrolle, unbehandelten Mäusen. Caspofungin Behandlung verbessert überleben (Abb. 7A) und Pilzinfektionen Belastung (Abb. 7 b-D) bei TCRδKO Mäusen. Ähnlich wie die Ergebnisse der Abbildung 6, waren die Ergebnisse der Pilz Belastung gemessen mittels qPCR (Abb. 7 b) und Vertreter GMS Quantifizierung (Abbildung 7) vergleichbar.

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Abbildung 4: erhöhte Überlebensrate bei Eosinophilen-defizienten (ΔdblGATA) Mäuse mit IA nach Behandlung mit Caspofungin. 15-30 Mäuse/Gruppe. Zusammenfassung von 3-6 Experimente. p < 0,0001. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung8geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 5: repräsentative Bilder von GMS-gefärbten Lungen-Abschnitte aus Wildtyp, Eosinophilen mangelhaft und Caspofungin behandelt oder Kontrolle unbehandelt Mäuse mit IA Vertreter der 3-4 Mäuse/Gruppe. Maßstabsbalken entspricht 100 µm. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung8geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 6: Pilz in Wildtyp Belastung und Eosinophilen-defizienten Mäusen mit IA behandelt oder Kontrolle mit Caspofungin behandelt. (A) qPCR Pilz DNA. 15-30 Mäuse/Gruppe, Zusammenfassung von 3-6 Experimente. (B) GMS Quantifizierung der histologischen Abschnitte bedeuten % der GMS Färbung von 4 Felder (10 X-Objektiv). (C) GMS Quantifizierung, mittlere % der gesamten Lunge Sektion (4 X Objektiv). B und C sind eine Zusammenfassung der 5 Mäuse/Gruppe. p < 0,05. p < 0,001. p < 0,0001. Diese Zahl wurde Daten generiert, die in einer früheren Publikation8gemeldet wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 7: Schweregrad der IA γδ T-Zell-defizienten Mäusen nach Caspofungin Behandlung abgenommen. (A) überleben. (B) qPCR Pilz DNA. (C) GMS Quantifizierung der Histologie. (D) repräsentative Bilder von GMS-gefärbten Abschnitte aus γδ T-Zellen mit IA, behandelt oder unbehandelt mit Caspofungin. A und B sind zwei Experimente mit 7-10 Mäuse/Gruppe im Überblick. C und D sind 4 Mäuse/Gruppe im Überblick. p < 0,05. p < 0,01. p < 0,001. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung8geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Der Zweck dieses Artikels war es, eine Methode zur Bestimmung der Lunge Pilz Belastung bei Mäusen mit IA einzuführen, durch die Verwendung von GMS-gefärbten Lunge histologischen Abschnitte zur Bildanalyse und Quantifizierung. In dieser Studie, Behandlung mit der β-Glucan-Synthese-targeting pilzbefallverhütende Droge Caspofungin14 verbesserte nicht überleben oder Pilzinfektionen Belastung bei neutropenisch Wildtyp Mäusen mit IA-8. Jedoch in Ermangelung von Eosinophilen oder γδ T Zellen überleben und Pilzinfektionen Belastung verbessert. Die Ergebnisse unserer Studie zeigte auch, dass vergleichbare Ergebnisse von GMS Pilz Belastung im Vergleich zu den weit verbreiteten Pilz DNA qPCR Methode6bezogen werden können.

Es gibt mehrere Vorteile für die Verwendung von GMS Pilz Belastung Quantifizierung. Erstens kann der Prozess bestehenden histologische Proben, wodurch möglicherweise die Anzahl der Experimente erforderlich, um signifikante Unterschiede bestimmen nutzen. Zweitens wurden in dieser Studie weniger Tiere für GMS Pilz Belastung Quantifizierung, signifikante Unterschiede im Vergleich zu qPCR Pilz DNA (Bild 6, Bild 7) zu erreichen. Drittens: Vergleich der Pilz Belastung in verschiedenen Isolaten von qPCR Isolat-abhängige Unterschiede in der ribosomalen DNA-Kopie Nummer15betroffen sein kann. Im Gegensatz dazu ist GMS Quantifizierung Exemplarzahl, nicht betroffen, da Pilz Belastung durch relativen Pegel der Lunge Pilzwachstum bestimmt wird. So, die Verwendung von GMS Quantifizierung für Pilzinfektionen Belastung reduziert den Einsatz von Wirbeltieren und erfordert keine Pre-Bestimmung der rDNA Exemplarzahl. Zu guter Letzt neben der Änderung Pilz Morphologie, Caspofungin Therapie Pilz Fragmentierung erhöht und dadurch kann künstlich erhöhen Pilz Belastung gemessen durch Isolierung der Kolonie bildende Einheiten von Lunge Homogenates12,16 ,17. So vermeidet GMS Quantifizierung der Pilz Belastung mehrere Einschränkungen mit anderen häufig verwendeten Methoden.

Allerdings sind die Grenzen der GMS Quantifizierung und/oder dieser Studie darauf hingewiesen. Zuerst die Autoren eine vergleichbare Verteilung von Bodenaggregaten Wachstum der gesamten Lunge jede Versuchsgruppe angenommen und so zur Quantifizierung von 4 Vertreter 10 x Objektive Felder als eine repräsentative Messung der Pilz Belastung in der gesamten Lunge (Abb. 6 b). Es ist möglich, dass in einigen Fällen die relative Verteilung, Größe und Dichte von Bodenaggregaten Brennpunkte hinreichend unterscheiden würde, dass die Pilze Belastung durch die qPCR-Methode anders mit dieser Methode und gleichwertig erscheinen würde. Unsere zusätzliche Ergebnisse mit ganze Lunge Abschnitt Quantifizierung mit Hilfe der 4 X Objektive Felder zeigten jedoch ähnlich, wenn auch weniger statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen (Abbildung 6). Der Standardfehler des diese Quantifizierung wurde mit dieser Strategie, wahrscheinlich aufgrund der verringerten Bodenaggregaten Auflösung mit dem 4 X Objektive und erhöhte Hintergrund in suboptimalen Bereichen erhöht. Daher wird eine repräsentative Quantifizierung der weniger Felder bei höherer Vergrößerung bevorzugt. Zweitens wurde nur ein einzigen, zentralen Bereich für jede Probe verwendet. Ist es möglich, basierend auf den Pilz Isolate oder Mäuse-Stämme verwendet, dass einige Studien zu einer ungleichmäßigen Verteilung von Bodenaggregaten Wachstum führen können. In diesen Fällen sollten weitere Abschnitte in jedem Paraffinblock quantifiziert werden, um eine repräsentativere Belastung zu erhalten. Drittens: in Experimenten, die umfangreiche Produktion von Schleimstoffe (d. h.Quantifizierung Atemwege Pilzwachstum in allergische bronchopulmonale Aspergillose (ABPA)18 oder zystische Fibrose (CF)18), GMS Reaktivität mit induzieren Polysaccharid-reiche Schleimstoffe19 könnte unspezifische GMS + Ergebnissen führen und so neigen einige Proben zu Gunsten der höheren Belastung Pilz. Da nur das neutropenisch Modell der IA in dieser Studie verwendet wurde, ist es möglich, dass die Verwendung von anderen immun zuständigen oder unterdrückenden Modellen führt zu weniger vergleichbare Ergebnisse könnten. Trotz dieser Vorbehalte GMS Quantifizierung bietet eine vergleichbare Technik um Pilzinfektionen Belastung zu bestimmen und die weitere Verwendung in weiteren Studien kann weiter bestätigen den Nutzen dieser Methode als konsistente, zuverlässige und kostengünstige.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Studie wurde zum Teil durch eine Indiana Universität Schule von Medizin Enhancement-Forschungsstipendium und vom NIH-NIAID 1R03AI122127-01 unterstützt. N.V. wurde teilweise in diesem Zeitraum durch eine Karriere in der Immunologie Gemeinschaft von der American Association Immunologen unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Aspergillus fumigatus 293 StammlösungPilzgenetik Stock CenterFGSC #A1100
HyPure Wasser in ZellkulturqualitätThermo Fisher ScientificSH30529.03
MalzextraktMP Biomedicals2155315weißes Pulver
BD  BBL Acidicase Dehydrierte Nährmedien: PeptonFisher ScientificL11843
Dextrose (D-Glukose) wasserfrei (körniges Pulver/zertifiziertes ACS)Fisher ScientificD16-3
Fisher BioReagents Agar, Pulver / Flocken, Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1423-500
Auto Dry CabinetShanghai Hasuc Instrument Manufacture Co., LtdHSFC160FD
Serie 1300 Klasse II, Typ A2 Biologische SicherheitswerkbankThermo Fisher Scientific1375
0,5 mm GlasperlenBioSpec Products11079105
15 ml Konische RöhrchenThermo Fisher Scientific339650
HämazytometerFisher Scientific# 0267110
Leica Modell DME MikroskopLeica13595XXX
Dulbecco's Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma-AldrichD8662-500 ml
1,5 mlTuben Fisher Scientific# 05-408-129
BD Precisionglide  Spritzennadeln, Feinheit 27, L 1/2 ZollSigma-AldrichZ192384
Anti-Maus-Ly-6G-AntikörperBioXCellBP0075-1Klon 1A8
Caspofungin-DiacetatSigma-AldrichSML0425
IsofluranHenry Schein Tiergesundheit1169567762
nicht rebreathing Tabletop-VeterinäranästhesiegerätSupera AnästhesieinnovationenM3000
Pureline SauerstoffkonzentratorSupera Anesthesia InnovationsOC8000
Slant Board RestraintIndiana State University Facility ManagementSonderanfertigung
Gilson PIPETMAN Classic 200 ml PipetsFisher ScientificF123601G
Pentobarbital-Natrium (Tödlich-Plus)Vortech Pharmaceuticals0298-9373-68
Allzweck-Pinzette mit breiter SpitzeFisher Scientific10-300
Fisherbrand  Standard-PräparierschereFisher Scientific08-951-20
Fisherbrand Gebogene AllzweckzangeFisher Scientific10-275
Ethylalkohol-200 ProofPHARMCO-AAPER111000200
Fisherbrand Absorbierende UnterlagenFisher Scientific14-206-63
BD Precisionglide  Spritzennadeln, Feinheit 25, L 1 ZollFisher ScientificZ192406
Vollkunststoff-NormspritzenFisher Scientific14-817-30
IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50BFisher ScientificNC9742754
Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%Sigma-AldrichHT501128-4L
50 ml konische RöhrchenThermo Fisher Scientific339652
Thermo Scientific Shandon Einbettkassetten II in SchlauchpackungenFisher ScientificB1000729
Fisherfinest  Histoplast ParaffinwachsFisher Scientific22-900-700
Einweg-BasisformenFisher Scientific22-363-554
Reichert Jung Histocut 820 MikrotomLabequip.com31930
WasserbadPrecision Scientific66630-23
CO2-InkubatorFisher Scientific116875H
Silberfleck ( Modified GMS) KitSigma-AldrichHT100A-1KT
Fast Green FCFFisher ScientificAC410530250
Frosted Mikroskop ObjektträgerFisher Scientific12-550-343
Fisherfinest Superslip Cover GlasFisher Scientific12-545-89
Cytoseal XYLFisher Scientific22-050-262
Olympus Provis AX70 MikroskopOlympusOLYMPUS-AX70
U-PHOTO Universal-FotosystemOlympusOLYMPUS-U-PHOTO
U-MCB-2 MULTI CONTROL BOXOlympusOLYMPUS-U-MCB-2
U-PS NETZTEILOlympusOLYMPUS-U-PS
FreeZone 1 Liter Tischgerät Freeze Dry SystemLABCONCO7740020
Maxima C  Plus  VakuumpumpeFisher Scientific01-257-80Verdrängung - 6,1 cfm
1-ButanolFisher ScientificA383-4
AMRESCO  PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML  DFSFisher ScientificNC9573988
Freistehende Mikrozentrifugenröhrchen mit SchraubverschlüssenFisher Scientific# 02-682-557
Mini-Beadbeater-24BioSpec Produkte112011
BioSpec ProductsLieferantenvielfalt Partner 2,3 MM ZIRKONOXIDKÜGELCHENFisher ScientificNC0451999
Tris Base (weiße Kristalle oder kristallines Pulver/ Molekularbiologie)Fisher ScientificBP152-1
Salzsäure, zertifiziert ACS PlusFisher ScientificA144S
Ethylendiamintetraessigsäure, DinatriumsalzdihydratFisher ScientificS311
Natriumdodecylsulfat (SDS), weißes Pulver, ElektrophoreseFisher ScientificBP166
Chloroform/Isoamylalkohol 24:1Fisher ScientificAC327155000
Biotek Epoch Mikroplatten-SpektralphotometerFisher Scientific11-120-570
Thermo Scientific™   ABsolute Blue qPCR mischt FisherScientificAB4137A
Hybridisierungssonde, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′Integrated DNA TechnologiesN/A
Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′Integrated DNA TechnologiesN/A
Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′Integrierte DNA-TechnologienN/A
Angewandte Biosysteme & Handel MikroAmp&Handel; Optischer 8-Röhrchen-Streifen, 0,2 mLFisher Scientific43-165-67
Thermo Scientific Gewölbte und flache PCR-KappenstreifenFisher ScientificAB-0386
Mx3005P QPCR-System, 110 VoltAgilent401443Stratagene ist jetzt im Besitz von Agilent
BALB/c-MäusenDas Jackson Laboratory000651
C57BL/6 (B6) MäuseDas Jackson Laboratory000664
Eosinophil-defizient (Δ dblGATA, BALB/c Hintergrund) MäuseDas Jackson Laboratory005653
γ Δ T-Zell-defiziente (TCRδ-/-, B6 Hintergrund) MäuseThe Jackson Laboratory002120
ImageJ SoftwareNational Institutes of HealthN/Ahttps://imagej.nih.gov/ij/
Spot Advanced SoftwareSpot ImagingSPOT53Ahttp://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/
GraphPad Prism 6GraphPad SoftwareN/Ahttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Fisherbrand SaugeinlagenFisher Scientific14-206-62
Stufe 4.5http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf

Referenzen

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