Erkennung von Waschmittel-Sensitive Interaktionen zwischen Membranproteine

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll für die Erkennung von Waschmittel-Sensitive Interaktionen zwischen Membranproteine mit Bindung des Sortier-Rezeptors, Sortilin, um die erste luminalen Schleife von der Glukose-Transporter-Protein, GLUT4, als Beispiel.

Abstract

Unsere Fähigkeit, Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erforschen ist der Schlüssel zum Verständnis der rechtlicher Verbindungen in der Zelle. Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen in vielen Fällen ist jedoch mit erheblichen experimentelle Herausforderungen verbunden. Insbesondere interagieren Sortierung Rezeptoren mit ihrer Ladung Eiweiß in das Lumen der Membran Fächer oft in ein Waschmittel-Sensitive-Mode, so dass co-Immunopräzipitation dieser Proteine unbrauchbar. Bindung von der Sortierung Rezeptor Sortilin, Glukose-Transporter GLUT4 als Beispiel für schwache luminalen Wechselwirkungen zwischen Membranproteine dienen kann. Hier beschreiben wir einen schnelle, einfachen und kostengünstigen Assay um die Interaktion zwischen Sortilin und GLUT4 zu überprüfen. Dafür haben wir entworfen und chemisch synthetisiert die Myc-markierte Peptid entspricht der potenziellen Sortilin-Bindung-Epitop in der luminalen Teil des GLUT4. Sortilin mit dem Stichwort sechs Histidin war in Säugerzellen ausgedrückt und isoliert von Zelle Lysates mit Kobalt Perlen. Sortilin an den Perlen immobilisiert wurde die Peptid-Lösung bei verschiedenen pH-Werten inkubiert und der eluierten Material wurde durch Western Blot analysiert. Dieser Test kann leicht an andere Waschmittel-Sensitive Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen sein.

Introduction

GLUT4 ist ein Glukose-Transporter-Protein, das vorwiegend in Fett und skelettartigen Muskelzellen exprimiert ist wo es die Wirkung des Insulins auf postprandialen Blut Glukose Abstand¹vermittelt. Ein sehr stabiles Protein ist, GLUT4 auf ein post-translationalen Ebene geregelt. In Abwesenheit von Insulin GLUT4 wird weitgehend von der Plasmamembran (daher niedrige basale Durchlässigkeit für Glukose) ausgeschlossen und wird vor allem innerhalb der Zelle in kleinen Insulin eine geschlechtergerechte Vesikeln (IRVs) lokalisiert und Trans-Golgi-Netzwerk (TGN), die voraussichtlich vertreten sind IRV-Spender-Fach. Bei der Insulinverabreichung die IRVs v....

Protocol

1. Handling des Peptids

1. Gestaltung und Bestellung des Peptids
   1. Wählen Sie die gewünschte Reihenfolge des Peptids, und fügen Sie ein Tag, wie Myc Epitop (EQKLISEED) an die beiden N - oder C-Terminus.
   2. Überprüfen Sie die vorhergesagte Löslichkeit des Peptids in Wasser mit Peptid Löslichkeit Rechner http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Wenn die Löslichkeit gering ist, versuchen Sie, eine andere wasserlösliche markierst, um die Ladung Balance ändern.
      Hinweis: Wir haben das Peptid entspricht der ersten luminalen Schleife (Fll) von GLUT4 mit dem Stichwort Myc Epitop (Fette Schrift) am N-Terminus (Myc-Fll-GLUT4): EQKLISE....

Results

Lysates wurden von 3 t 3 L1 Zellen stabil transfizierten mit Sortilin-Myc/His⁵ und von WT 3 t 3 L1 Zellen, verwendet als Negativkontrolle vorbereitet. Beide Lysates waren mit Kobalt Perlen bei pH 6 und pH 8 inkubiert und gründlich gewaschen. Kügelchen mit immobilisierten Proteine wurden dann bei der Lösung von Myc-Fll-Glut4 inkubiert. Nach sorgfältiger Wäschen waren Proteine gebunden, die Perlen mit 0,25 M Imidazol eluiert. Proben wurden ausgesetzt, zusammen mit de.......

Discussion

Sortilin ist ein evolutionär konservierte Multi-Liganden-Protein-Rezeptor, der bei beiden Signalisierung an der Plasmamembran und in intrazellulären Sortierung Veranstaltungen^6,7beteiligt ist. Die Suche nach dem authentischen Sortilin Liganden (einige davon sind luminalen oder integraler Membranproteine) ist jedoch komplizierter, wie das Zusammenspiel von Sortilin mit einigen seiner Bindungspartner zu empfindlich auf Waschmittel zu sein scheint. Daher eine einfac.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Proteaseinhibitor-Cocktail	Sigma	P8849	zur Verwendung bei der Aufreinigung von Histidin-Tag-Protein
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Corning	21-040-CV	PBS
1 ml Insulinspritze U-100	BD	329652	26G x 1/2
BCA Protein Assay Kit	Pierce	23228
Waschpuffer	Boston BioProducts	BP-234	Für die Reinigung von His-Tag-Proteinen
HisPur Kobaltharz	Thermo Scientific	89964
Tricin-Probenpuffer	Bio-Rad	161-0739	mit SDS, bMercaptaethanol sollte hinzugefügt werden
Elution  Puffer	Boston BioProducts	BP-236	für die Reinigung von His-Tag-Proteinen mit 250 mM Imidazol
Mini-Protean Tris-Tricin Fertiggelen 10-20%	Bio-Rad	456-3115	Zur Trennung von Peptid und kleinem Protein
Tris/Tricine/SDS Laufpuffer	Bio-Rad	161-0744
Transferpuffer	Boston BioProducts	BP-190	Fügen Sie 20 %
und 0,45 mm	Bio-Rad	1620115
Rinderserumalbumin	Sigma	A9647	BSA
Anti-Myc-Antikörper	Zellsignalisierung	2272	Kaninchenpeptid
	Genscipt		Bestellung anpassen
Precision Plus Protein Zweifarbige Standarts	BioRad	161-0374